腺苷预处理对糖氧剥夺损伤星形胶质细胞的保护作用

腺苷预处理对糖氧剥夺损伤星形胶质细胞的保护作用 摘要： 目的：观察糖氧剥夺对星形胶质细胞的影响及腺苷的保护作用。方法：取体外培养第三代或第四代星形胶质细胞，传代至96孔板或24孔板内，细胞贴壁并长出突起后，随机分为三组：正常对照组（normal control group）、糖氧剥夺组（OGD group）、腺苷预处理组（ADO group），进行糖氧剥夺/复氧处理。观察糖氧剥夺8h复氧糖24h后星形胶质细胞形态、细胞活性。结果：糖氧剥夺复氧糖24h后，正常对照组星形胶质细胞生长状态良好；OGD模型组星形胶质细胞胞体水肿变圆，细胞形态由不规则变成梭形，突起明显变短或消失；ADO组细胞水肿较轻。OGD模型组星形胶质细胞活力下降，OD值明显低于正常对照组（P0.01）；ADO组细胞活力显著高于OGD模型组，表明ADO能明显改善细胞活力（P0.01）。结论：糖氧剥夺可引起星形胶质细胞严重损伤，星形胶质细胞形态、活性与缺氧缺糖呈对应变化，腺苷能减少糖氧剥夺后星形胶质细胞形态学改变及细胞凋亡，提示腺苷对糖氧剥夺的星形胶质细胞有一定的保护作用。 关键词：腺苷；星形胶质细胞；糖氧剥夺 The protection of Adenosine Preconditioning on Oxygen-glucose deprivation injury induced astrocyte cells 【Abstract】 Objective To investigate the effect of oxygen-glucose deprivation and protective effect of adenosine on astrocytes. MethodsAstrocytes were cultured for third or fourth generation in vitro， and then passaged at 96 or 24 well plate. When the astrocytes attaching to the wall and growing with prominences， they were randomly divided into 3 groups， normal control group， oxygen-glucose deprivation （OGD） group and adenosine preconditioning （ADO） group. The cells were taken OGD/reoxygenation treatment. The morphology and activity of astrocyte cells were observed at 8 hours after OGD and 24 hours after reoxygenation. Results At 24 hours after OGD/reoxygenation treatment， the astrocyte cells were with normal morphology in normal control group； the soma of astrocyte cells became edema and round in OGD group， the cell morphology changed to fusiformis from irregular， and prominence obviously became short or disappeared； the edema was lighter in ADO group. Activity of astrocyte cells decreased in OGD group， and OD value was significantly lower than that in normal control group （P0.01）. Cell activity was higher in ADO group than that in OGD group， which indicated that ADO can obviously improved cell activity （P0.01）. Conclusions Astrocytes are injured seriously after OGD； morphology and cell activity of astrocytes take change in accordance with oxygen deficit and glucose deprivation. Adenosine can decrease morphological changes and cell apoptosis of astrocyte cells after OGD. we can make conclusion that adenosine has influence on astrocytes after OGD.【Key words】Adenosine； Astrocyte； Oxygen-glucose deprivation 【中图分类号】 Q2-09 【文献标识码】B 【文章编号】1002-3763（2014）05-0018-02 脑血管疾病是人类三大死亡原因之一，缺血性脑血管病是一类常见病、多发病，其致残率与病死率都很高。缺血后的血流恢复在某些情况下能导致进一步的组织损伤和功能障碍， 这种恢复血流灌注后的有害情况称为缺血再灌注损伤（ischemia- reperfusion injury， IRI） ，这一概念在1970年经实验证实1，抑制再灌注损伤成为目前治疗缺血性脑卒中的关键环节。有研究表明，腺苷及其受体在多种脏器缺血再灌注损伤的保护方面有重要作用2、3、4 。星形胶质细胞（Astrocyte，Ast）是中枢神经系统中数量最多的神经细胞，过去Ast仅被视为具有固定神经元的功能，对神经元起支持和营养作用。而现在人们逐渐认识到它在调节中枢神经系统功能中发挥着很关键的作用。本研究探讨腺苷预处理对糖氧剥夺损伤Ast的保护作用，揭示腺苷对神经系统的保护机制，为腺苷应用于临床治疗脑血管疾病奠定理论基础。 1 材料与方法 1.1 实验动物：出生24小时内的Sprague-Dewley（SD）大鼠，雌雄不限，体重约10-12g。由新乡医学院实验动物中心提供。 1.2 主要试剂及仪器：DMEM（Dulbeccos Modified Eagle Medium）高糖培养基、DMEM无糖培养基购于Gibico公司，胰蛋白酶粉、XTT、PMS购于Sigma公司，胎牛血清购于杭州四季青，兔抗人胶质纤维酸性蛋白GFAP多克隆抗体购于中杉金桥公司，FITC标记羊抗兔IgG购于博奥森公司，腺苷（Adension）购于Amresco公司；CO2恒温细胞培养箱（德国Heraeu公司）、Eclipse E200显微镜（日本Nikon公司）、BIO-TEK ELX800 酶标仪（美国宝特仪器有限公司）。 1.3 实验方法 1.3.1 星型胶质细胞的培养： 参照俞爱青 5的方法行体外SD大鼠星形胶质细胞培养：取材后利用机械分离法和差速贴壁法纯化培养Ast，接种密度为1109L-1，根据细胞生长情况，23d半量换液1次。原代细胞培养至铺满瓶底约85%后，即可传代，传代细胞生长较快，一般57d即可再次传代，取第3代、第4代细胞进行免疫细胞胶质纤维酸性蛋白酶（glial fibrillary acidic protein，GFAP）荧光鉴定（根据说明书操作）及实验。 1.3.2 实验分组及处理过程：取第3代或第4代Ast，根据监测指标要求将细胞传代时将其传至96孔或24孔板内，分为实验对照组（normal control group）、氧糖剥夺模型组（Oxygen glucose deprivation，OGD group）、腺苷预处理组（ADO group）。实验正常对照组不进行氧糖剥夺，在氧糖剥夺期及复氧糖期均更换完全DMEM培养基。OGD组在氧糖剥夺期更换成无糖、无血清DMEM培养基；ADO组在氧糖剥夺前24h给予含100mol/L腺苷的完全DMEM培养基，氧糖剥夺时更换为无糖、无血清DMEM培养基。 1.3.3 氧糖剥夺/复氨糖过程：OGD组和ADO组在氧糖剥夺期分别更换为预热的无糖DMEM培养基，去培养板盖，放入自制密闭的温度保持在（370.5）的从入口持续充入缺氧混合气体（含体积分数为95%N2，5%CO2），出口接入水密封瓶的3升缺氧仓中进行缺氧处理。缺氧气体由缺氧仓顶部进入，由底部排出，初以10L/min，6min后缺氧仓内O2浓度降至1%，再以1L/min持续充入缺氧混合气体，并开始计时缺氧8h。8h后取出培养板，OGD组及ADO组均更换为预热的复糖DMEM培养基，转移到细胞培养箱内培养。根据实验设计检测以下试验指标。 1.3.4 检测指标：观察氧糖剥夺8h复氧糖24h后各组Ast形态学变化、检测细胞活性变化。 1.3.4.1 倒置显微镜下观察细胞形态学变化 1.3.4.2 细胞活性检测：将对数生长期的星形胶质细胞以5104个细胞/mL的密度接种于96孔板中继续培养，待细胞基本融合后，吸弃培养液，进行随机分组，每组设3个复孔，重复3次，各组氧糖剥夺处理过程如同上述，各孔加入相应的培养基100uL，在再复氧复糖22h时，每孔加入预温37的XTT复合溶液50L。在细胞培养箱内继续孵育2小时，用450nm波长测定OD值，然后将光密度值（OD值）按以下公式计算： 细胞存活率=（样本吸光度-空白组的吸光度）/对照组的吸光度100% 1.4 统计学方法分析：所有数据均以均数标准差（XS）表示，采用Prism4.0软件包进行统计学分析，多组之间显著性检验用单因素方差分析， P0.05为差异有显著性。 2 实验结果 2.1 倒置显微镜下观察OGD后Ast形态差异。 糖氧剥夺后，OGD组和ADO组形态上无明显差异，均显示星形胶质细胞突触缩短，倒置显微镜下观察细胞透亮度增加，明显可见细胞突触之间的广泛联系，网状交织较糖氧剥夺前明显。复糖氧24h后可见OGD组细胞形状各异、细胞水肿，胞膜不完整；ADO组水肿相对较轻，细胞排列相对整齐。 2.2 XTT比色法检测细胞活性（对照组、OGD组、ADO组）： 通过对XTT比色法的OD值进行单因素方差分析制得表1和图表1。由表1可知，OGD模型组星形胶质细胞活力下降，OD值明显低于正常对照组（P?0.01），表明细胞因受损伤或死亡而导致细胞活力明显下降。ADO组细胞活力显著高于OGD模型组，表明ADO能明显改善细胞活力（P?0.01）。 3 讨论 腺苷用于缺血再灌注损伤已有很长时间，但更多的是用于心肌的缺血再灌注损伤6 。短暂缺血后心肌不仅具有即刻保护作用，同时在2472h 内会出现延迟保护作用7。腺苷（adenosine， ADO）及其受体参与了心肌缺血预处理的早期保护作用，同时也是延迟保护的重要介质8、9。 表1 氧糖剥夺各组XXT法细胞活性比较（XS） 目前已知的腺苷受体（adenosine receptor， AR）有4种亚型，即A1受体（A1R）、A2a受体（A2aR）、A2b受体（A2bR）和A3受体（A3R）。 缺血预处理时用药物阻断A1受体或ATP通道能阻断缺血耐受的形成。大量的体内外研究表明，AlR在脑缺血中具有神经保护作用原代培养的皮质或海马神经元细胞，在糖-氧剥夺的条件下给予A1R选择性激动剂环己基处理后，其细胞损伤明显减轻，而A1R特异性拮抗剂可加重同一缺氧模型所诱导的细胞损伤。同样，在脑缺血的动物模型中也有类似发现。这些都提示AlR对脑缺血具有神经保护作用10。 内源性腺苷释放诱导IPC样保护作用，保护作用分为早期和延迟两个时相，早期保护在预处理数分钟后出现，持续几个小时，可能主要涉及内源性活性物质；延迟保护在预处理后24小时出现，持续数天，与早期保护不同，与诸多基因表达的增强或受抑有关，包括热休克蛋白（heat derived neurotrophic factor HSP）、脑源性神经营养因子（brain derived neurotrophic factor BDNF）细胞因子、抗氧化酶等11. 经相关实验证明，测定急性反复缺血、缺氧小鼠的脑组织内腺苷含量，急性缺血、缺氧1次的小鼠，脑组织内的腺苷含量高于对照组（ P 12，证明了脑组织缺血、缺氧，特别是反复缺血、缺氧的刺激，引起动物体内腺苷含量的升高。吴浩等人经过实验得出结论：反复发作的短暂性脑缺血发作（TIA）会刺激体内腺苷水平升高，并有一定的脑保护作用，增强机体对缺血、缺氧的耐受，可能会改善卒中的症状和预后13。缺糖缺氧可引起海马神经元严重损伤，神经元损伤程度与神经元存活率、LDH 渗出含量的改变呈对应变化。腺苷能减少缺糖缺氧后神经元的损伤，减少缺糖缺氧后神经元凋亡，提示腺苷对缺糖缺氧海马神经元具有一定的保护作用14。因此，从理论上讲：通过预先给予星形胶质细胞培养瓶内加入腺苷，随着体外模拟脑缺血模型的建立，激发腺苷受体的表达，诱导星形胶质细胞缺血缺氧耐受形成。 该实验组已经过相关实验证实，Ast对神经元的保护作用15。本实验结果提示，无论从形态学变化，还是Ast活性变化，氧糖剥夺对体外培养的星形胶质细胞可造成严重的损伤，随着复氧时间的延长，星形胶质细胞的损伤逐渐加重。ADO可减轻氧糖剥夺的星形胶质细胞的损伤，具有一定保护作用。 因此本实验观察到的腺苷能减少缺糖缺氧后星形胶质细胞的损伤，减少缺糖缺氧后再恢复糖和氧供应后的星形胶质细胞的凋亡，提示腺苷对体外培养的缺糖缺氧星形胶质细胞具有一定保护作用。实验结果支持上述腺苷通过减轻Ca2+超载、氧自由基损伤等引发的星形胶质细胞水肿、细胞膜损伤、线粒体损伤及DNA损伤发挥神经保护作用的。其具体机制有待进一步研究。 参考文献 1Harrison RG. Observations on the living developing nerve fiber J， Anat Rec， 1970，1（6）：116-120. 2 Di Paola R， Melani A， Esposito E， et al. Adenosine A2a Receptor Selective Stimulation Reduces Signaling Pathways Involved in the Development of Intestine Ischemia and Reperfusion InjuryJ. Shock，2010，33（5）：541-551. 3 Park SW， Chen SWC， Kim M， et al. Selective intrarenal human A1 adenosine receptor overexpression reduces acute liver and kidney injury after hepatic ischemia reperfusion in miceJ. Laboratory Investigation，2010，90（3）：476-495. 4 Taha MO， Miranda-Ferreira R， Sim？es RS， et al. Role of Adenosine on Intestinal Ischemia- Reperfusion Injury in RabbitsJ. Transplantation Proceedings，2010，42（2）：454-456. 5 俞爱青，崔红梅，周志俊.新生鼠星形胶质细胞分离培养方法J.毒理学杂志.2009，23（1）：70-72. 6 周必强， 叶世铎.腺苷预处理和缺血预处理心肌保护效果对比研究J.实用心脑肺血管病杂志.2006，14（12）：950-952. 7 Ravingerov T. Intrinsic defensive mechanisms in the heart ： a potential novel approach to cardiac protection against ischemic injury1 GenPhysiol Biophys ， 2007 ， 26