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Gateway技术快速构建表达载体 2012 12 3 Gateway技术是基于研究的非常清楚的 噬菌体位点特异重组系统 attBxattP attLxattR 建立的 在噬菌体和细菌的整合因子 INF Int 的作用下 lambda噬菌体的attP位点和大肠杆菌基因组的attB位点可以发生定点重组 lambda噬菌体DNA整合到大肠杆菌的基因组DNA中 两侧产生两个新位点 attL和attR 这是一个可逆的过程 如果在一个噬菌体编码蛋白解离因子Xis和IHF Int的共同介导下这两个新位点可以再次重组回复为attB和attP位点 噬菌体从细菌基因组上裂解下来 这一过程的方向是受控于两个重要因素 存在的重组位点和介导蛋白 O 15bp的同源序列attP 噬菌体同源重组位点attB E coli染色体上的同源重组位点 修饰后的位点信息 Gateway技术只需要两步反应就可完成表达载体的构建 第一步 入门载体的构建 有四种方法 限制性内切酶消化目的基因后酶连进入入门载体B PCR克隆 以含attB的特异引物合成目的基因 C 构建Gateway兼容cDNA文库D Gateway改造过的克隆资源 BP反应 LR反应 第二步 表达克隆载体的构建 LR反应 混合包含目的基因的入门克隆和合适的目的载体以及GatewayLRClonase酶 构建表达载体 目的载体必须含有attR同源序列 可与含有attL的入门载体进行定点同源重组 为什么要构建入门载体 EntryClone是作为基因的一个来源克隆以便较容易地亚克隆到任意目标载体 同时 一旦EntryClone是测序有效的 就不需要对多个表达载体进行测序 另外 attB序列相对较小 25bp 这使得它们更适合加到PCR引物中去 需要在5 端附加4个G以便进行有效重组 实例一 1 现在单子叶植物的表达载体较少 Davidetc 建立了一套基于Gateway技术的的开源表达载体 pANIC载体 该表达载体可经根癌农杆菌和基因枪法转化进入植物细胞 主要包括两大类 过表达载体和发卡RNA表达载体 所有载体都包含三个成分 1 Gateway技术中的的attR序列 2 转基因植物筛选基因序列 3 可见的报告基因序列 OsAct1 riceactin1promoterandintron PvUbi1 switchgrasspolyubiquitin1promoterandintron PvUbi2 switchgrasspolyubiquitin2promoterandintron ZmUbi1 maizeubiquitin1promoterandintron bar bialaphosresistancecodingregion hph hygromycinBphosphotransferasecodingregion pporRFP Poritesporitesredfluorescentproteincodingregion GUSPlus GUSPlusAMcodingregionalongwiththericeglycinerichproteinsignalpeptidesequence Cmr chloramphenicolresistancegene ccdB negativeselectionmarker 35ST 35Sterminatorsequence NOST Agrobacteriumtumefaciensnosterminatorsequence OCST octopinesynthaseterminatorsequence AcV5 epitopetag LB leftborder RB rightborder R1andR2 attR1andattR2recombinationsites pUCoriandColE1 originsofreplicationinE coli PVS1 originofreplicationinA tumefaciens AmprandKanr ampicillinandkanamycinbacterialresistance 通过三个实验验证pANIC载体体系的效能 pANIC构建的含有gus基因的表达载体 转化植物后gus基因的表达活性 由图可看出 含有玉米泛素蛋白ZmUbi1的pANIC过表达载体的GUS酶活性最高 该图显示利用pANIC4B载体 8B前体 构建的发卡RNA表达载体在柳枝稷中两个独立品系间的表达量 PvCCR1和PvC4H1表达量明显低于对照组 用pANIC7A构建的表达载体 通过基因枪技术导入小麦和柳枝稷中 观察pporRFP红色荧光蛋白基因的表达 红色荧光蛋白自发荧光率较低而且红光穿透力更强 最高吸收峰为583nm 实例二 1 为方便基于植物瞬时表达技术的高通量功能基因筛选 利用Gaetway技术实现植物表达载体和表达文库的构建 将35S启动子和Gateway技术入门载体pDONR222的经过酶切后连接到植物表达载体pCAMBIA0380的多克隆位点上 构建Gateway技术兼容的p1104D植物表达载体 p1104D重组基因的选择性测试 对GUS基因之外的 种长度不一的基因 用带有attB序列的引物进行扩增后 按Gateway指南与p1104D进行BP反应 电转化感受态大肠杆菌DH10B 平板筛选之后随机挑取40个单克隆进行测序验证 发现这 种基因均顺利地重组到了p1104D载体中 因此 p1104D载体对目的基因片段的大小没有严格要求 可以满足文库构建中不同大小片段的重组 优点 Gateway克隆技术是invitrogen公司的专利 通用性不如经典克隆强 对于本身含有重组类似或保守序列的片段或结构复杂的片段应用此法可能会受影响 而且BP反应和LR反应试剂较贵 缺点 参考文献 1 DavidG J Mannetc Gateway compatiblevectorsforhigh throughputgenefunctionalanalysisinswitchgrass PanicumvirgatumL andothermonocotspecies 2 郭姗姗基 张蒙 单卫星 基于Gateway技术的植物表达载体的构建 3 Gateway Technology 专利