电生理实验常见问题解答.doc

电生理实验常见问题解答（1）转载2010-10-09 14:53请问目前分析细胞外放电的信号处理软件较好的是什么？价格昂贵的有国外的PCLAMP系列软件和POWERLAB；价格便宜的较好用的有国产的PCLAB和MEDLAB。如果感兴趣输入GOOGLE，一搜即知。axon guide是很经典的哦，大家可以到公司主页上下载本书主要针对PATCH，是AXON公司的产品配套广告说明书，但是也包含了不少基本电生理知识，集中阅读一下第1、2章节有帮助。可以下载看看，网站如下，请教：干扰的大小如何检测？检测干扰大小和你记录电信号一样，可以从相关软件读出来，也可以从示波器上读出。建议丁香妹妹找一些基础电生理书籍熟悉一下，不要着急，先入门为重。请问微电极的电阻如何测量?怎样才能保证电极尖端已被电极内液完全充满?给予电极一个电流/电压，可以从示波器上读出来，也可以从相应的放大器上显示出来。建议购买带有芯的玻璃电极，这样可以简单地从尾部灌入内液后，轻轻用手指敲打电极即可；如果是无芯电极，就需要先用注射器将电极尖端充满，而后在从尾部灌入内液。问题是有时尖端太细,从尾部注入内液后,很难保证尖端全被充满.注射器接皮管皮管接电极尾部电极尖端深入电极液中抽吸注射器电极尖端充满液体再从电极尾部管电极内液解决问题了。我在记录细胞外放电时,干扰太大,诸如50hz的交流电干扰,请问如何尽可能地排除这些干扰信号?交流电干扰应该不难处理，只需要中间接一个直流电转换器即可。我想用Patch做平滑肌的BK通道,请教Pleace前辈,在酶解法分离细胞时,使用DMEM会因为含钙高而影响结果吗?文献多数都用无钙液，如果使用前我用PBS洗三次是否可以？你最好用无钙液，即使后来用PBS洗三次也不可以。因为之前的无钙液操作不仅可以保护细胞，而且可以使之处于低兴奋状态。屏蔽和接地是电生理基本要求。如果你记录的信号足够大的话，可以不用屏蔽。但生物电信号一般都很弱，这就是为什么要屏蔽和接地。也是为什么很多时候晚上做实验干涉小因为晚上用大功率电器的人相对少些，空间的电磁干扰相对小些，地线相对也干净一些。屏蔽笼即法拉第笼，一般是一层铜网，一层铁网。铜网屏蔽电，铁网屏蔽磁。屏蔽笼和系统的信号共地。关于地线，根据你的系统所记录的信号的强弱要求可以不同，信号越弱，要求越高。一般细胞外记录甚至更粗的记录要求相对不高。要是做到单通道水平，就不是凑合能解决问题的。就是这样，电生理的地线也应该和公共地线区分开来。一般比较正规的电生理实验室的地线应该单独埋设。地线埋设的要求其实很简单，尽量减小对地电阻。但实施起来就有很多方法了。我听说的一个方法是：从实验室下到地的主线用大概10cm的铜缆。地上要挖个深1.51.8m、1.5*1.5m宽的坑。铜缆用铜铆钉（尽量减少材质造成的电阻差异）焊在一块1.5m*1.5m*4cm的铜板上。铜板放入坑中。板上埋2.5kg食盐、2.5kg木炭。再将坑添上。主线到各个信号地分支点用铜棒焊接。铜棒上钻孔接地线。仪器电源不直接接到公共电源上，而是通过稳压隔离电源后接到另设的电源上。仪器电源的地线和系统的信号地分开接地。信号地接到单独埋设的地线上。仪器电源的地线也就是三相插头的顶端那个插头很多时候不接。震动太大：可能原因有防震台防震效果不好，充气不足，或是实验室附近有什么强振动源；记录槽设计是否合理；液体流速是否太快？记录系统是否稳定：微电极放大器电容补偿是否调好，是否需要校正？记录系统干扰和噪声情况如何？细胞状态的问题：状态不好；或是与细胞的放电类型有关，有时电极刺激了某些类型的细胞，细胞产生放电，适应后放电消失。温度控制！改变温度对场电位的影响非常大（切身体会）。系统稳定性！微操是否会漂移，试验过程中是否需要锁定微操位置基线调节不应该调holding电压，应该调offset，也就是液接电位；建议你首先计算一下你所用的电极内液的液接电位（clampex中有计算方法），看看到底与0差多少；另外，保证软件和硬件中都没有加holding电压；如果这些都没问题，判断是否硬件问题，每条接口线是否都连接正确并接触良好？判断是否软件设置中的错误，reset全部设置到出厂状态，然后重新设置！对单通道的了解不是很多，仅提供一点参考意见：1、单通和whole-cell主要在于噪音水平的差异。单通要求较高，噪音水平最好小于1-2pA，这是由于单通的信号非常小，比如Na，也就在1-2pA左右，而K，最大的也不过10pA，如果抗干扰性差的话，信号很容易被噪声掩盖（所以gain要打大些）。Ca的信号我没有记到过，不过应该也不会大于10pA。2、操作基本相同。我用的是Axon200B，外部连线没有改动，但用的是patch(beta=1)，据说在这种模式下，放大器内部的线路连接和whole-cell(beta=1)不同。protocol的设置，主要有两方面不太相同，一是电极内外液（给药方式不同），二是钳制电位（针对你给的step电压刺激）。如果是电压门控性离子通道的话，好像inside 和outside的钳制电位方向不一样，而且电流方向也不同，具体的您最好还是查查文献。3、clampfit 9.0是可以直接分析单通道的，如果是8.0的版本的话，我不太清楚。学习膜片钳教材推荐（13本）1.王绍, 徐涛. 电生理学方法.2.韩济生主编. 神经科学原理. 第二版. 北京：北京医科大学中国协和医科大学联合出版社，1999.3.张均田主编. 现代药理学实验方法. 北京：北京医科大学中国协和医科大学联合出版社，1997.4.陈军. 膜片钳实验技术. 北京: 科学出版社, 2001.5.刘振伟. 脑片膜片钳技术及其研究概况.6.张均田主编. 神经药理学研究进展. 北京：人民卫生出版社，2002.7.康华光主编。膜片钳技术及其应用，科学出版社，20028.Sakmann B and Neher E. Single-Channel Recording. New York: Plenum Press. 1983.9.Sherman-Gold R. The Axon Guide. Axon Instruments Inc. 1993.10.Chad J and Wheal H. Molecular Neurobiology: a practical approach. New York: Oxford niversity Press, 1991.11.Hille B. Ionic Channels of Excitable Membrane. Massachusetts: Sinauer Associates Inc.1992.12.Methods in Enzymology. 1992; 20713.Areles Molleman,Patch Clamping : An Introductory Guide to Patch Clamp Electrophysiology. 2002.Wiley Canada.一点小更正：8.Sakmann B and Neher E. Single-Channel Recording. New York: Plenum Press. 1983最新为1995年第二版，FTP中有pdf电子书。11.Hille B. Ionic Channels of Excitable Membrane. Massachusetts: Sinauer Associates Inc.1992.最新为2001年第三版。medicinegiant推荐的很精彩。我觉得基线不能回零的原因有三个：1，可能是你的电极的银丝该重新镀了，如果你用的电极是镀有Agcl. 2，可能是你的电极夹持器内有了水，里面潮湿，所以导致基线漂移。3，可能是由于你的地线没有接好或是地线也需要重新镀Agcl了实现高阻封接的注意事项:1.分离细胞时,酶消化应该适度使膜表面洁净;2.浴液必须严格过滤,除去杂志和灰尘污染;3.电极材料宜选用硬质玻璃,使之具有低噪声的性能,其直径尽可能的小而且要经过热抛光;4.涂敷硅酮树脂改善介电特性;5.电极进入液面时,可稍加10cm水柱的正压,封接时应施加20-30cm水柱的负压,在几秒钟内使Rseal上升到数十个G欧;6.正压解除后,每个电极只能使用一次;7.若电极内含有钙离子,应使用HEPES缓冲液;8.使用低渗透(10%)的电极内液比较容易形成高阻封接.电容补偿对微电极放大器的记录的影响可能有这两种情况：一是欠补偿，会导致记录到信号失真或畸变；二是过补偿，会引起微放的自激，使记录系统不稳定。MEZ8201我用过。它的探头上有个cal接头。将cal与探头的地接头相连。8201面板上有校正电压选择。输出校正电压后，可以在显示屏上看到记录的校正电压。如果补偿正确应该是方波，如果是欠补偿，方波的直角被滤掉；如果是过补偿，则看到的是双向三角波。这时你调节面板上的电容补偿旋钮，使看到的波形尽量接近方波。8201的说明书上有详细的说明，可以照着来。用无钙液的目的就是记录不出钙激活的钾电流，类似于whole-cell potassium记录中Ia的记法（用全部钾电流减去Id部分），再正常外液钾电流减去无钙液钾电流。我觉得还是你的电容补偿没有调好。你可以先在cal与地之间串个大电阻，10M左右，相当于电极电阻大小（8201附件里应该有这么大的电阻，用于校正用）。这时调节电容补偿。等这样调好后在测电极阻抗。因为电极本身除了电阻外还有电容，还要加上电极与浴液之间的电容。所以你首先要将放大器内部的电容补偿调好后（排除电极电容以及其他杂散电容的影响），再进行测量就比较准确了。仪器窗口显示的电压是你所记录的电压。但你现在记录的是细胞外的电压，也就是细胞膜上通道开放引起的膜外的电流变化。而不是膜内外之间稳定的电势差。因此记录的电位有波动是正常的。你可以将看到的电压波动和记录下来的电压比较一下。看两者之间相差多大。窗口的电压值应该不会与记录的相差太大。BK通道电流很大，做单通道电流，电极的拉制，不一定要涂sylgard，入水电阻5Mo左右比较的合适，封接达到10G以上并难做到，而且并不一定要到10G，只要封接稳定，噪声低于1PA，就可以记到单通道电流。HEKA的Pulse-pulsefit,不太好做单通道分析，建议使用Pclamp9，或 minianalysis功能强大。胰岛细胞的patch clamp很难作的，主要是分离单细胞的质量很难保证。电导、电流-电压图与直方图能用clampfit得出来，但用他不太方便，作图功能不是太强，建议使用sigmaplot灌流装置很简单，用灌流瓶重力灌流就可，灌流瓶通过一般的一次性输液器与培养皿相连，连接管入水的部分用细的硅胶管。流出道用同样口径的细管，然后将流出管与负压吸引装置相连，或者用蠕动泵。如果要让DRG在盖波片上贴壁，你怎么灌流？怎么保证细胞的活性？如果你担心在培养皿不好贴壁，大可放心。不过培养皿一定要干净，最好一次性的。当然可以让DRG在玻片上贴壁，但玻片应放在加有细胞外液的皿里，方便灌流。这样做的好处是你可以一片一片取出来做，时间可以久一些。因为我是新手，我们实验室也才建，所以遇到一些问题只好向你们请教。我做大大致步骤是：1配置人工脑脊液（ACSF）：成分：NaCl 124mmol/L KCl 5mmol/L KH2PO4 1.2mmol/L MgSO4 1.3mmol/L CaCl2 2mmol/L NaHCO3 26mmol/L Glu 10mmol/L用超纯水配置。2. 取大鼠，迅速断头，剪开头皮，拨开颅骨，取出大脑和小脑并置于含95%O2和5%CO2饱和的冰冷的ACSF中。马上在浸有ACSF的滤纸上将小脑略加修剪，同琼脂一起用502胶水粘在切片槽的固定位置。槽中放有冰冷的ACSF（小于4），并不断通入含95%O2和5%CO2混合气体。用振动切片机切出小脑矢状脑片（400um），切好的脑片置于25下含95%O2和5%CO2饱和气体的ACSF中孵育2小时。3.电极内充液：将含2%膀胺天蓝的0.5mol/L的醋酸钠溶液充入微电极尖端，电阻大约在2兆。银丝上镀有氯化银，但可能不太多了。4. 将孵育好的脑片移入灌流槽小室（设定温度在32左右），并用含95%O2和5%CO2混合气体的ACSF以4ml/min的流速持续灌流。记录时，将记录微电极用微推进器推进，插入脑片，观察放电，并*声音。我做出来一次，连续记录到了放电，而且放大器上的电压数值基本稳定在74mv左右。但近好几次都没记录到，所以纳闷到底哪里出了问题。麻烦你帮我看看，给我点指导。我也问了几个人，他们都说是脑片活性的问题，但我觉得我做的已经很小心了。多谢！1、用的大鼠鼠龄多大？如果是幼鼠，取脑没有什么问题。取脑时间越短越好。如果是成年鼠，最好用冰的acsf心脏灌流后再取脑。不过成年鼠我也没做过。2、取脑后在冰冻的氧饱和acsf内冻10min后再上台切片。3、电极尖端还可以再细点，阻抗到510M（尖端越细，记录的电位越接近单个细胞的电位变化。），配膀胺天蓝时记得用滤纸过滤后再使用。银丝重新镀一层氯化银。电生理抗干扰并不难：其一，仪器连接要有章法。导线不能肆意穿插。其二，最好有共同的地线。其三，动物接地要良好最后，电极拉制要过关。成年鼠和幼年鼠不一样的地方是：1、成年鼠颅骨比较硬，手术困难程度大些；1，在做大鼠的立体定位时，在准确无误的上好耳棒的前提下，根据立体定位图谱，（Paxinos & Waston, 1986），最好还是采用耳间线定位法。尽量不要采用前囟（Bregma）法。特别是要定位比较深层的脑核团组织。前囟（Bregma）法不可靠！2， 乌拉坦麻醉行人工呼吸，乌拉坦应该不会对血流动力学产生显著性影响。这里关键还是乌拉坦的剂量要合适。建议你还是使用戊巴比妥钠，比较好。因为乌拉坦的安全剂量较窄。3，验证中枢位点，通用方法是，电泳。这也就是为什么玻璃微电极要灌充膀胺天蓝的原因。如果是成年鼠的话，要进行4度蔗糖人工脑脊液心脏灌流。加入蔗糖是为了维持细胞渗透压并功能。灌流时注意肝脏颜色，变白即可。去脑后冰冻2分钟确实时间太短。我个人觉得至少得78分钟。如果时间太短，脑片内层细胞温度来不及降低，一方面细胞代谢高，另一方面切片时硬度不够，也易损害细胞。相反，如果冰冻太久，形成冰晶，也易引起细胞死亡。关于取脑时间：一般要求在1min以内。我个人认为1min15sec不致于造成太大影响。如果取脑时间稍常的话，可以在打开部分颅骨后先在冰水ACSF中让大脑冷却几秒钟再继续。我一般打开颅骨后的取脑过程是在冰水ACSF进行的。不知你是不是也是这样？灌流速度确实会影响脑片活性。一般灌流速度在24ml/min. 速度太慢，会导致细胞缺血缺氧，加快死亡。如果你的实验是这个原因，应该有个时间上的关系，即随时间推移，成功率降低，或记录到放电时间缩短。建议你再检查一下配置的ACSF的PH和渗透压。电极溶液的离子组成必须和细胞膜所暴露的体内或培养液的离子组成相似。因此当细胞外溶液作为浴液时主要由NaCl组成，全细胞或细胞外面向外分离膜片记录中细胞内液作为电极灌注溶液主要含有钾离子。典型的ECS（细胞外液）和ICS（细胞内液）组成可以在表中化学组成 细胞外液（mM） 细胞内液（mM）Na+ 126 5K+ 6 147Mg2+ 2.5 1.2Ca2+ 1.2 0Cl- 125 150GTP 0 0.1ATP 0 5HEPES 10 20Glucose 11 11Sucrose 67 0可以看到。在试验中我们有许多类型的离子组成可以运用，但PH值和渗透压对成功的封接是非常关键的。理论上，ECS的PH和渗透压应该和待测物来源环境一致，即培养细胞时的培养液，PH是由缓冲液来调节，在膜片钳试验中有以下几种常用的缓冲溶液：CO2缓冲溶液，是由气体CO2和HCO3-平衡组成的。CO2缓冲溶液的许多特性被认为是对于脊椎动物待测物的生理环境最为相似的缓冲液。但CO2缓冲液必须需要一个装置使溶液始终暴露于CO2而不是空气。其他缓冲液如磷酸盐或HEPES虽然被广泛运用但有报道一些间接作用。实验的经验将决定最终使用那种缓冲溶液。当一个细胞是从HEPES缓冲介质中生长来的，那么我们很难反对使用HEPES缓冲溶液，但对于新鲜的分离的细胞或组织切片使用CO2缓冲溶液比HEPES缓冲溶液要安全。电极中的缓冲溶液是个难题，因为其中的气体成分是难于控制的，因为溶液暴露于空气，因此这时不能使用CO2缓冲溶液。并且ICS通常需要运用化学手段如EGTA排除钙离子，钙离子使溶液的PH很低，并且需要高浓度的HEPES或其他缓冲溶液，同时放大了一些干扰作用。大多数脊椎动物的的ECS的PH值大约是7.4。在试验过程中保持PH恒定是非常重要的，因为PH的很小的变化也会影响离子通道的作用。ICS稍稍偏酸一些大约在7.27.3。1. 判断地线是否接好的一个简单方法就是在开机记录状态下，观察，当取下实验用仪器，比如，放大器或刺激器上所连接的地线后，你所记录的电信号是否会发生变化，也就是说，你要仔细观察地线的”有”和”无”是否对生物电信号的记录产生明显的影响。如果有影响，说明你所连接的地线产生了作用。请注意，接地时要一点接地，而不要多点接地，造?大地环路。至于，到底需不需要在实验室外面挖坑，埋特殊而专门的地线。众说纷纭。其实，只要你的生物记录仪器的辨差率足够大的话。并且，你的仪器连接有章法。那些专门的特殊的埋地式的地线以及屏蔽网都可以省去。2. 在你的实验室，必备的仪器都有了，然而，你可能忽略了一件不起眼的设备。也许你忘记写了。那就是外接扬声器，也就是我们平常所说的音频*器。一个好的有经验的电生理工作者，他的敏锐之处不是在眼睛上的看，而是在耳朵里的听。可以说，神经信号的有无一听即知。如果你没接扬声器的话，我建议你接上一个听听。这对你的提高很有帮助。3. 有没有稳压器，意义不大。当然，如果你不放心的话，你可以接上一个。我想这主要是出于保护仪器的目的。4. 对于你设置的高低频滤过参数。不同的实验室，不同的参数。但是，大同小异。你的参数也是这样。我的建议是，你在调节微调旋钮时（如果你的仪器允许这样做的话），边听，边看。很容易找到适合你实验的最佳参数。5. 我一直都是认为电生理的记录关键是在电极的拉制上，不管是胞内记录，还是胞外记录。都要有一个?适的电极。当你在遇到记录不到生物信号的时候，多想一想你的记录电极是不是有问题。当然，这是有一个前提的，即你的生物信号放大系统工作正常。对于你的实验，我感觉电极阻抗不合适。建议你提高电极阻抗，再试试。6. 神经元的放电，有自发（spontaneous response）和诱发（induced-response）两大类。而对于神经元放电频率的内在特性（ISI-Inter Spike interval）的研究,目前正是一个热点。查查Pubmed，你就会很有收获的。电生理实验中，记录电极所选用的材料通常有铂金丝，Ag或AgCl丝，镍铬合金，不锈钢。这主要考虑材料的电阻和传导性。铜丝一般情况下较少使用，但不是不可使用。比如，制备记录肌电的同心圆电极时就可采用在针管内插入漆包线的方法。但是对于玻璃微电极内的引导电极丝，一般都是选用Ag-AgCl丝。玻璃微电极是我们通常选用的细胞外记录的电极。当然，也是胞内记录和膜片钳记录的专用电极。通常情况下，我们要考虑电极阻抗。为什么呢，因为在电生理实验中，没有一定的输入阻抗，是记录不到合适神经元的细胞放电的。那么这里我们要清楚是什么因素决定电极阻抗的大小。简单的讲，对于玻璃微电极而言，电极尖端 （tip）的口径大小起了决定性作用。尖端越细，阻抗越高。正如你所言，电极阻抗小，相应的细胞信号的采集幅度也会变小，当然也包括噪声也会变小。但是你有没有考虑过一个情况，在玻璃微电极阻抗较小的情况下，由于尖端口径较大，你的电极灌充液在不断的渗漏（leak）。这对细胞外记录是很危险的。对于你的胞外记录实验，电极尖端要在1 微米左右。简单的讲，电极阻抗较低能够收集到来自更大范围的更多的生物电信号。然而，一点需要考虑，你是在做单细胞放电记录。如果阻抗过低的话，势必会带来一个问题，多单位怎么处理? 换句话讲，没有一定的电极阻抗，你是记录不到非常漂亮的单个神经元的细胞放电的（请注意，我这里使用的是单个神经元的概念）。而对于场电位的记录，通常不需要高阻抗的电极。在胞外单细胞记录中，你可以采用窗式幅度鉴别仪来处理（Function single unit recording method）多单位的情况。然而这不是一个好的办法去记录single unit。只是一个信号处理上我们通常采用的办法。因此，较为可行的记录办法是适当提高玻璃电极阻抗，从而让记录电极只记录单个神经元的放电。对于离子通道的进一步研究是离子通道有两个或更多的构型状态，这些构型状态是相对稳定的。每种稳定的构型代表了不同的功能状态。例如，每种离子通道至少有一种开放的构型状态和一种或两种关闭的构型状态。离子通道在不同构型状态下的转换被称为门控。相对于门控机制中离子通道的暂时的结构的变化，我们对于门控的分子机制还知之甚少。虽然我们可以运用图形来方便地描述离子通道从开放到关闭的过程，但这个方法或许只对特定的通道是准确的。更为常见的是，离子通道的门控包括通道构型的普遍的变化。例如，我们从高分辨率的显微镜和图象分析器得到的证据表明间隙结合离子通道的开放和关闭包括组成离子通道的六个亚基的固有的缠绕和倾斜。相似的证据表明骨骼肌细胞的Ach通道的激活是由组成离子通道孔道的五个亚基的协调的缠绕和弯曲完成的。在从关闭状态到开放状态的转换过程中出现的分子重排，由于形成了较宽的孔道并且更多的极性氨基酸到达离子通道的水溶性孔道的表面。离子通道门控有三种主要的生理模式：离子通道的一个区域的局部的构型变化；离子通道全长的构型的普遍变化；通道入口处的阻塞粒子的进入到排出之间的转化。因为神经细胞的主要功能是产生短暂的电信号。三种主要的调节机制用于控制通道保持开放和激活的时间。一些通道受化学配体的调控。配体可以和通道直接结合，可以在细胞外的位点这时配体是递质，也可以在细胞内的位点这时是细胞质的特定成分如钙离子和核苷酸。另外配体通过对蛋白的磷酸化对离子通道进行共价修饰能激活细胞信号的瀑布式传递。另外一些离子通道受膜电位变化的调控。最后一些离子通道受细胞膜的机械牵拉作用的调控。在这些调控因素的影响下，离子通道进入下面三种功能状态：关闭和静息状态，开放（激活），或关闭和不可激活状态。门控的快速作用对于瞬间到瞬间的信号传导是必要的，但门控会受到细胞代谢水平的长效变化的影响。例如在电压门控的钾通道对于细胞内的ATP水平很敏感，同时还有一些通道的门控特性随细胞内的氧化还原水平的不同而变化。对于刺激引起通道从关闭状态向开放状态转换，这个过程是需要能量的。在电压门控的离子通道中能量来源于通道蛋白带电部分的穿过膜电场的运动，这部分称为电压感受器。电压感受器是有净电荷的因为感受器中有碱性氨基酸（正电荷）或酸性氨基酸（负电荷）。带电的电压感受器的穿越电场的运动为通道开放状态和关闭状态的转换提供了能量。在递质门控的通道中门控的能量来源于递质和通道的受体结合时所产生的能量。对于机械门控的离子通道能量来源于细胞膜的拉伸，认为这种拉伸可以通过细胞骨架或直接通过脂质双分子层的张力的变化传递到通道。门控通道的信号也控制着通道开放状态和关闭状态的转换的速度。对于电压门控的通道，转换速度主要依赖于膜电位。虽然转换的时间从几微秒到几分钟不等但大多数需要几微秒。因此一旦通道开放将维持几微秒然后关闭，关闭维持几微秒后通道有重新开放。一旦转换开始将自发的依次进行，因此此时再给予突然的电压上升的刺激，将会看到通过细胞膜离子通道的电流的全或无的梯形的变化。递质门控通道和电压门控通道经过不同的过程进入离子通道不可激活状态。配体门控通道进入离子通道的不可激活状态是由于它们对配体的长期的暴露。这个过程被称为脱敏作用。离子通道的脱敏的基本机制还没有完全清楚。在一些通道中的脱敏作用是因为配体和通道相互作用的本质特征，而在另一些通道中则是由于蛋白激酶激活的通道分子的磷酸化引起的。许多但不是全部的电压门控的离子通道能够在激活后进入不可激活状态。这个过程被称为失活。电压门控的钾通道和钠通道的失活被认为是通道内部构型发生改变，这种变化是由和激活控制区域分离的离子通道的亚单位或相应区域控制的。（在细胞内运用蛋白水解酶来终止电压门控的钠通道失活而不影响通道的激活的能力。）比较而言，电压激活的钙通道的失活需要钙离子的流入。细胞内钙离子浓度增加会使钙通道失活，直接方式是通过和通道内的控制位点结合，或运用间接方式通过激活细胞内的相应的酶这些酶对通道蛋白磷酸化而使通道失活。外来因素如药物和毒素，也能影响离子通道的门控位点。大多数这些物质都是关闭通道的；只有很少的一些开放通道。一些成分和通道的结合位点和细胞内的门控配体的正常的结合位点是一样的，因此阻止激活剂的行使相应的功能。外来因素和通道的结合是不牢固的并且是可逆的，如箭毒封锁骨骼肌细胞膜上的烟酸Ach门控通道。外来因素和通道的结合也有可能是牢固的并且是不可逆的，如蛇毒的-bungaro毒素封锁骨骼肌细胞膜上的烟酸Ach门控通道。有些外来物质是无竞争机制的，它们影响正常的门控机制却没有和配体的结合位点直接作用。例如药物安定和GABA门控的氯离子通道的调控位点结合使得通道对GABA反应的开放时间延后。这种间接影响不仅出现在配体门控的通道中，在电压门控和机械门控的通道中也存在。离子通道的基因家族分类大多数神经，肌肉细胞中的离子通道可以被分成几种基因家族。每个基因家族的成员都有相似的氨基酸序列和跨膜结构。每个基因家族认为都是由普通的原始基因通过基因复制和变异发展而来的。编码配体门控的离子通道的基因能被乙酰胆碱，GABA以及甘胺酸激活属于同一家族。这个家族中的离子通道是由五个密切的亲缘关系的亚单位组成。每个亚单位有四个跨膜的螺旋（M1-M4）。配体门控的离子通道基因家族的成员的不同在于离子的选择性另外还有它们各自的配体的特性。编码谷胺酸激活的通道的基因可以独立成为一个家族和其他的配体门控的通道区分开。间隙结合的通道的基因编码属于一个独立的家族。每个间隙结合点通道都是由12个相同的亚单位组成，每个亚单位有四个跨膜部分。这种在电突触部位的特殊的通道跨越了两个细胞的细胞质。编码电压门控型离子通道的基因都属于第三个家族。这类通道被去机化电压激活并且对钠离子，钾离子，钙离子有选择性。所有的电压门控的通道都有一个相似的结构。它们都有由六个跨膜部分（S1-S6）组成的基本结构basic motif的四次重复。S5和S6相互连接形成环状结构，通过了细胞膜的细胞外侧面，P-区域组成了离子通道的选择性滤孔。电压门控的钠和钙通道中每个单独的亚单位都有四个这种的重复结构。钾通道是由四个分离的亚单位组成，每个亚单位有一个重复结构。编码电压门控钾通道的主要的基因家族和另两类编码选择性钾通道的基因家族几乎没有关联，因为这两种基因家族有着特殊的结构和属性。一类基因家族是由编码内向整流的钾通道的基因组成，基因在超极化时被激活。每个通道亚单位只有两个跨膜部分，并且和形成通道孔道的P-区域相连接。第二类编码选择性钾通道的基因家族的亚单位有两个形成孔道结构的重复。这些通道也对静息时钾离子的传导力有贡献。分子生物学研究的快速发展快速引发了对其他的一些离子通道基因家族的证实。这些家族包括氯离子通道，氯离子通道对于确定神经和肌肉细胞静息电位以及确定一类由ATP激活的配体门控型离子通道（这类通道在特定的突触上有神经递质的作用）都是很重要的。对这些离子通道的基因测序将揭示更多的通道家族。由于通道是由许多亚单位组成，因此亚单位在结合时不同的变化就会使离子通道显示不同的功能特性，通道的种类也非常多。在神经元中已知就有超过12种类型的离子通道，并且每种离子通道还有几种密切的亲缘关系的构型（同分异构体），它们的差别在于通道开放和关闭的速度以及对不同激活信号的敏感性。离子通道的多样化是两种或多种有密切的亲缘关系基因的表达和mRNA从同一个基因转录后选择性地剪接或对mRNA的加工这些因素共同造成的。和酶的同分异构体一样，离子通道类型的变化在特殊的发育阶段，在大脑中的不同的细胞类型中，甚至是同一细胞的不同的区域都有着不同的表现。离子通道结构和功能的微妙的变化使得离子通道功能高度专一。近年对于线虫Caenorhabditis elegans整个基因组测序工作强调了多细胞有机生物的离子通道的复杂性。这个基因组包括编码电压门控钙通道的五个基因，编码选择性钾通道的60多个基因，编码配体门控型通道的90个基因，以及编码选择性氯通道的六个基因。在这个基因组中没有编码电压门控型钠通道的基因。不同细胞上的丰富的离子通道类型使得对于发展作用于神经系统选择性区域上的离子通道的激活和阻塞的药物成为可能。这种药物理论上应该具有最大的治疗效果和最小的副作用。因为你是刚开始做，建议你严格按步骤做，同时尽量将你的实验条件也严格化，这样有利于你在实验中寻找导致问题的关键所在。1、水尽量用好些的，双蒸水甚至三蒸水，有去离子水更好以排除水中的离子杂质对脑片活性的影响。2、在称量药品时尽量精确，药品用分析纯，有条件用国外的更好。3、有条件的话PH值和渗透压都要测一下。渗透压有专门的渗透压仪检测，可以看看别的实验室有没有，借用一下。4、灌流的acsf配好后就持续给混合气，不要到记录时才给。灌流的速度可以参考相关文献，有的文献有报道。使用别人已经比较成熟的记录槽。5、记录系统方面，如果你的放大器是使用多年的，按说明书将放大器调试、校正到最佳状态。但如果最近有人用这个放大器做过类似实验，而且记录很好，可以暂不调试。当然这个最好在熟悉该仪器的技术人员指导下进行。6、微电极不仅要测电阻，而且要在显微镜下量直径，直径要保证在1微米左右。内液要过滤，充灌要完全。如果你使用的是新电极，要先清洗后再使用。如果你的记录系统没有问题，而且脑片活性很好，即使12M的电极，也能记到电位，不过记到的是single unit还是field potential就不好说了。建议你根据文献和别人的经验，与你的步骤一步一步推敲。你能够保证某个实验条件严格，就可以排除这个条件可能造成的干扰，而把矛盾的焦点对准最可能的地方。记住，你现在是在做一项已经成熟的技术，就尽量按成熟的技术来，不要随便改变其中的步骤或参数。等条件摸索好了，你就可以按你的设想进行你的实验。首先，你使用的ACSF必须事先通气（20-30分钟）使之饱和，然后才可以进行灌流；气体流量不好说，一般性语言描述为有一到三处连续不断的气泡冒出来即可，对脑片的供氧能力主要还取决于灌流速度。给药方式，在脑片上用循环给药一般说来都是比较慢的；如果你想快一点，可以在入水管上接一个三通，一边是正常溶液，一边是加过药的溶液，估计一下从三通到chamber的管子体积，根据流速计算一下药物流到chamber去的时间，wash也同样。你是做的细胞外的话，加药还有种方法。就是用多管微电极。一般有三管、五管和七管。中心管用做记录，充灌电极内液。其他管里充灌药物，通过电泳使其作用到记录的细胞附近。有这种毛坯卖。不过这种方法也有缺点，容易使记录不稳定。现在有专门的加药系统，可以多种药物快速微量给药。下面这个是华工仪博代理的加药系统：/prodb.htm 如果经费允许，可以考虑。单细胞记录有用Y管加药的方法。Y管的分叉一头给药，一头给持续的负压。药物从Y管的直管进入培养皿。注意要先给负压，再给药，使Y管充满药物，再将Y管扎入细胞附近。我不记得你是否说过你们的记录时温度是多少。但要记录自发放电的话，一定要保证记录槽的温度在32度以上。不管是在体还是离体，记录自发都是对温度有要求的。在体要在37左右，离体在30到32以上，才可能记录到自发放电。昨天一个耶鲁大学的教授来我们这里也提到温度对自发放电影响的问题。1、因为记录前已经孵育了12h，你的记录槽的温度又是在32度，如果细胞没有问题，应该几分钟后脑片适应了局部环境就可以记录到放电。2、脑片境界变模糊我也觉得是脑片活性不行了。在我做的海马脑片上，好的脑片低倍镜下可以看到分层清楚，细胞带有折射，皮质可以看到黑色点状的细胞。CA3的细胞比较大，耐受力差些，过半个小时到1h很明显看到CA3细胞带均匀透亮。这时高倍下看CA3细胞大都肿胀。你的这个情况可能和记录槽有关我觉得。流速、氧饱和上次都说过了。还有就是浸没液面不要太低，刚刚盖住脑片是不够的。如果你的acsf有问题，在孵育时状态就不行了，不会到记录槽时才出问题。3、每次实验完器皿的清洗也很重要。不知你们的灌流是怎么做的。我们给记录槽灌流用的蠕动泵上的硅胶管每次都要用蒸馏水和75酒精各灌洗一遍。孵育和灌流用的烧杯由于在室温下放置较长时间，也很容易长细菌，糖盐很容易在杯底沉积。每次实验完一定要洗干净。否则下次实验你再准的acsf经过这样的烧杯和灌流管渗透压和ph值也会变的。4、如果你现在想验证脑片状态怎么样，自发记不到的话你可以试试诱发。给刺激看看有没有反应，有的话看看反应持续时间和反应表现。建议你查查文献，看看你记录的细胞的电生理特性是怎样的。我也觉得和灌流槽有关，因为我测了一下ph，发现烧杯内氧饱和的acsf和最后流出的acsf 的ph基本上很接近，且接近7.4，惟独灌流槽小室内液体ph要偏高点。我用的是全浸式脑片灌流槽，所以我怀疑小室内液体得不到充分交换，甚至有的一点也不交换。不知你那边用的是什么样的灌流槽？我老板说实在不行就换灌流槽。如果记录细胞外自发放电，你觉得用全浸式的好还是用半浸式的好？我们用的是自制的全浸式记录槽，用的挺好。附件是它的示意图，供你参考。但灌流槽ph值偏高也有可能和你的流速有关：如果流速过慢也会造成交换不好。记录细胞外单位放电中，为了保证记录的电位是单个细胞的活动，要尽量将电极拉细。电极尖端越细，记录的放电越有可能是单个细胞的活动。看放电是不是单个细胞的活动，可以看示波器上的放电的幅度是否接近一致。放电幅度长长短短的那就是记录到多个神经元的活动。有时你仔细观察，还可以发现长短放电各有各的规律。同时*也可以发现放电的声音不一致。如果放电幅度基本一致，频率有变化。这有可能是单个细胞的活动。因为你记录的脑片中的神经元，它接受多个突触的信息，因此它的放电可能不一定十分规律。wholecell recording的液接电位的补偿问题我们一般都是在电极入水后补偿液接电位。但在下电极的过程中有时基线还在波动，有时还很大。按理说当形成gigacell后，就不能在调节pipeoffset了。但是，当形成巨阻封接后，电极内液和浴液之间的接触就隔断了，然后吸破形成whole cell。这个时候液接电位就消失了。但你入水时已经补了这个液接电位。也就是说形成whole cell后多补了液接电位大小的电压。你记录的电位是实际电位加上液接电位的值。很多人电极内液都是用的葡萄糖酸钾，用axon的液接电位计算公式算的葡萄糖酸钾版的电极内液和外液的液接电位都是10mv以上。这个时候误差就大了。这就产生个问题：这个液接电位怎么补？什么时候补？不补的话你钳制电压应该钳多少，电流钳下记录的膜电位与实际膜电位差多少？请大家说说各自的液接电位补偿的做法和理由。这是一个不错的问题。首先，让我们来看一看offset这个电压是怎么来的。他的来源很广泛，一部分是恒定值，比如放大器的输入offset；一部分是变化值，比如液接电位，它依赖于离子成分；一部分由附加环路产生，包括玻璃电极、试验浴槽或者是氯化银电极；还有一部分是膜片钳放大器产生的。我们调节offset，是把这个电压在放大器里加到command电压上了，从而使得在command电压为零的时候电流也为零。液接电位在入水的时候有，一旦形成巨欧姆封接或者吸破后就不存在了，所以这一部分电位差值有必要考虑进去。我一般的做法是入水之后补offset，一旦开始封接（30M）就不再进行补偿，直至形成巨欧姆封接。在这个过程中，液接电位已经加到command电压里头去了，所以在吸破后测量其膜电位（电流钳）的时候，要将液接电位减去，比如测出来是-50mV，减去液接电位（以+10mV为例），就变成了-60mV。在电压钳模式下的钳制电位也是一样要补上一个液接电位差值的，比如command电压是-60mV，实际输出是-70mV。不知我理解得对不对。关于这个问题，axon的说明书里有比较详尽的补偿方法。我用的灌流槽就中间一个小室，而且体积蛮大的。液体从小室下面进来，到达一定高度后从周围小孔出去。理论上来讲里边的液体应该可以得到充分交换，但不知为何小室内液体的ph要高于流入的和最后流出的acsf。而且液面比较高，控制不好的话脑片会浮起来。不过我设定的流速并不慢，我用的是蠕动泵灌流，流速在4ml/min左右。还有就是温度控制的不稳定，不知你用的那种全浸式灌流槽如何来控制这些问题。因为我觉得这两个问题直接影响了我能否记录到脑片的自发放电。我这两天做了几次，都能记录到自发放电，但持续时间不长，最长的也就2小时左右，短的只有半小时。不知你以前记录的时候一般能维持多少时间，怎样才能使脑片的活性维持较长的时间？我自己没有做过成年鼠的脑片。不过我觉得是先分离海马再冰冻。但是如果没有冻过，脑组织很软，可能不太好分离。我想可能要先将脑组织冻12min在分离比较好些。这样一是组织有些硬度，比较好剥离海马；二是降低组织温度，减少神经元损伤。剥离时最好在冰板上进行，中间要加些4度ascsf保持组织湿润。有人在做成年鼠脑片前是用冰冻的氧饱和的ACSF心脏灌流的。这样可以降低脑组织内部温度，你在剥离海马时神经元的损伤就小一些，从而提高海马神经元的存活率。液面和你的记录槽齐平就可以了，太高会溢出可能漏到显微镜系统里；太低交换不好。脑片可以用白金丝做的U型框粘上尼龙丝来压（陈军的那本书里有介绍怎么做），你也可以将尼龙网粘在白金框，或者银丝也可。你粘尼龙丝时候隔23mm粘一根，这个距离够你下电极了，不会说到做的时候还要调整尼龙网的位置。至于为什么从孵育槽到记录槽要等1h才能记录到自发放电，我也不太清楚。不过我觉得应该要不了那么长时间。是不是你的记录槽液体交换慢了点，适当快点，混合气早点充再试试看。从你现在的情况看，切片估计不是问题了。不知孵育中可能的问题你注意没有：首先还是要给acsf预先给予混合气进行饱和；其次，在孵育时注意在尼龙网下不要形成气泡可能造成脑片底部与液体接触不良；脑片在网上要平摊开，脑片之间最好不要覆盖和折叠。我觉得由于你们这种记录槽液体是从底部流入，可能会造成脑片飘，记录不稳。6mm的高度有些高了，我们的记录槽大约3mm高，太高对显微镜成像效果会有影响。还有，你们的记录槽液体是自下向上流，那么脑片深处得到的氧饱和acsf就好一些，越往上交换过的acsf就多一些。而且你们的槽子这么深，积累的废液也相对多些。或者这么说，同样的流速，6mm深的记录槽液体和气体交换的时间要长于3mm的记录槽，这可能会影响到脑片在记录槽中的活性。而你要是加快流速的话，又会加剧脑片的飘荡，影响记录的稳定。所以，我觉得你的记录槽需要改进。要不降低高度试试，要不用我上次说的那个记录槽。不过用我说的记录槽，你的加温系统不知能不能上上去。应该每个海马的锥体神经元都可以记录到0.1 mM glutamine 诱导的电流的，不知你是想记*AR介导的电流，还是AMPAR/KA介导的电流，如果是前者，应该用无Mg2+溶液和13 微摩尔的gly才可以记录到。另外，你配好的glutamine溶液要注意pH的变化，可能会偏酸，而H+对glutamine电流是抑制的。model cell实际就是模拟patch记录的三个阶段: 1、电极入水。电路上就是一个10M的电阻；2、巨阻形成。电路上是1个10GM的电阻；3、whole cell形成。电路是一个500M的电阻和一个电容构成的回路。三种状况均可在seal test窗口中看到。seal test和你给step 刺激一样，都是在model cell上加个电压，窗口显示了记到的电流大小。同理你也可以在电压钳下给step，利用欧姆定律自己根据给的电压和记到的电流算电阻。这个值可能不会那么标准就等于三种状态下的电阻，这与仪器自身的噪声及性能有关，但不会有太大的偏差。如果偏差很大，比如应该为10M只记到5M，可能里面有问题。这时你就要排除是model cell的问题还是放大器的问题。测model cel电阻排除一下model cell的问题。如果model cell没问题，对照说明书用它校正一下放大器。最大的可能就是封接系统漏气。将电极固定在holder上，电极尖端烧闭。三通管与带电极的holder整体浸入水中，从三通管给气体，看三通管、三通管与软管连接处、软管与holder连接处等易于漏气的地方是否有气泡冒出。如有，用胶将其封闭，或者换新管。还有一种可能就是电极堵了，不过电极堵的话电极电阻会有较大的增加，很好辨认。电极内液是在入水之前灌充的，一旦钳制以后，可能就不能更换了，因为一旦更换，就不可避免引起振动，这是膜片钳实验的禁忌之一，很容易引起细胞的死亡。另外，关于渗透时间的问题，我曾经特意作过time-course，通常电极内液完全渗透到细胞内，使电极内和细胞内达到平衡大约在5min左右，有时候因为负压大小或其他的原因，可能大于或小于5min，虽然没有作过氨基酸，但是时间也是差不多的。1、如果你考虑与鼠龄有关，建议你查查有关大鼠发育的文献，看看你所做核团是在生后多少天发育成熟。也可以参考做该核团的文献，看看别人用多大的老鼠。（我个人认为觉得20d应该没有问题）2、渗透压不知是你计算的还是实际测量的。有人提出渗透压略高一些还有利于细胞的长时间存活，甚至有人孵育时用高渗的蔗糖脑脊液，记录时用正常脑脊液。你可以参考别人的文献，适当调整一下方子。这个要靠你自己摸索，各个实验室不一样。3、孵育时氧饱和越充分越好。我们一般都事先给孵育槽里充氧2h左右。因为混合气里co2比例一定，而且需要它稳定acsf的ph值，这和在体不一样，应该不存在通气过