微生物实验.docx

实验部分： 1.细菌形态观察，细菌涂片制作与染色镜检 油镜的使用原理：，因空气的折光率与玻璃的折光率不同，固有一部分光线被折射，不能射入镜头，加之油镜的镜面较小，进入镜中的光线少，为避免部分光线折射的损失，所以滴加香柏油增强视野亮度，香柏油的折光率和玻璃相近，使视野明亮，物象清晰。 油镜的使用方法: 1.放置，显微镜使用时应放置在洁净平稳的实验台上 2.调节视野亮度，打开电源开关，尽量升高聚光器，放大光圈，调节亮度调节钮，使射入镜头的光线适中 3.标本片的放置，于标本片的欲检部位，滴加香柏油一滴，将标本片固定于载物台上，用油镜检查 4.镜检，首先，眼睛从镜筒右侧注视油镜头，小心转动粗调节器，使载物台上升，直至油镜头浸没在油中，与玻片相接触。然后用目镜观察，同时缓缓转动粗调节器使载物台缓慢下降，待得到模糊影像时，再用细调节器，直至物像完全清晰为止。 5.油镜保养，油镜用毕，应以擦镜纸擦去镜头上的香柏油，如油已干或物镜模糊不清，可滴加少量乙醇乙醚于擦镜纸上，拭静油镜头，并随即用擦镜纸拭去乙醇乙醚，然后把低倍镜转至中央，高倍镜和油镜转成“八”字形，使载物台和聚光器下降，关闭电源，用布包好，放于阴凉干燥处。 细菌标本片制备 1.抹片 （1）固体培养物，取洁净的玻片一张，把接种环在酒精灯火焰上烧灼灭菌后，取12环无菌生理盐水，放于载玻片的中央，再将接种环灭菌，冷却后，从固体培养基上挑取菌落少许，与水混匀，做成1cm的涂面。接种环用后要灭菌。 （2）液体培养物，可直接用接种环去细菌培养液，在玻片上做涂面 （3）液体病料,取一张边缘整齐的载玻片，用其一端蘸取血液等液体材料少许，在另一张洁净的载玻片上，以45角均匀推成一薄层涂面。 （4）组织病料，以无菌剪刀、镊子剪取备检组织一小块，以其新鲜切面在玻片上做35个压印或涂抹呈适当大小的一薄层。切忌涂抹太厚，不利于染色和观察 2.干燥，涂片在室温下自然干燥，必要时将涂面向上，置火焰高处微烤加热干燥。 3.火焰固定，将干燥好的抹片涂面向上，在火焰上来回通过数次，以手背触及玻片微烫手为宜。常用细菌染色方法 美蓝染色法： 在经火焰固定的涂片上，滴加适量美蓝染色液覆盖涂面，染色23分钟，水洗，晒干或吸水纸轻压吸干镜检，结果为菌体呈蓝色。 瑞氏染色法： 细菌抹片自然干燥后，滴加瑞氏染色液于涂片上以固定标本，13分钟后，再滴加与染色液等量的磷酸盐缓冲液或中性蒸馏水于玻片上，轻轻摇晃使于染色液混合均匀，5分钟左右水洗，干后镜检，菌体呈蓝色，组织细胞胞浆呈红色，细胞核呈蓝色。 姬姆萨染色法：血片或组织触片自然干燥后，用甲醇固定35分钟，干燥后在其上滴加足量染色液或将抹片浸入盛有染色液的染缸里，染色30分钟，或者染色数小时或24小时，取出水洗，吸干或烘干，镜检，细菌呈蓝青色，组织细胞浆呈红色，细胞核呈蓝色。 革兰氏染色法：（1）在固定好的抹片上，滴加草酸铵结晶紫染色液，染13分钟，水洗。 （2）加革兰氏碘液媒染，作用12分钟，水洗 （3）加95%酒精脱色约30s至1min，水洗 （4）加稀释石碳酸复合或沙黄水溶液复染30s左右，水洗，吸干后镜检 结果：革兰氏阳性菌呈蓝紫色，革兰氏阴性菌呈红色。2.培养基制备及常用仪器使用 培养基制备基本步骤：配料，溶化，测定及矫正pH，过滤，分装，灭菌，无菌检验，备用 制备培养基基本要求：选择所需的营养物质，调整pH，培养基应均质透明，不含抑菌物质，灭菌处理 营养琼脂培养基制法： 将琼脂粉加入肉膏汤内，煮沸使其完全溶解，矫正Ph7.47.6，过滤分装于试管或三角瓶中，以121.3灭菌20min。可制成斜面、高层培养基或平板培养基。 血液琼脂培养基： 将灭菌的营养琼脂冷至4550，无菌操作，加入5%10%的无菌血液，然后倾注灭菌平皿或分装试管制成斜面。供营养要求较高的细菌分离培养。 电热恒温培养箱使用方法： 插上电源插头，开启电源开关，绿色指示灯亮，表明电源接通。然后把温控仪上的温度调节旋钮旋至所需温度刻度处，此时红灯亮，箱内升温，待红绿指示灯交替发亮时，工作室内温度达到设定状态，进入正常工作。 电热干燥箱(干热灭菌箱)使用方法： 1. 适宜用干热灭菌箱灭菌的物品是玻璃器皿和金属器皿，而塑料制品、橡皮制品、天然和化学纤维制品、培养基等，均不适用干热灭菌。 2进箱，物品放在干热灭菌箱中的铁搁板上，关箱门。 3. 定温，常用灭菌温度为160。 4. 灭菌，接通电源，干热灭菌箱升温至定温灭菌，160维持2h。 5. 出箱，关断电源，待温度下降至60左右，开箱门取出被灭菌的物品。 高压蒸汽灭菌器（高压锅） 1. 加水 立式锅可直接加水至锅内底部隔板以下2/3高处；有加水口和水位窗者，由加水口加水至止水线处。 2. 装锅 把需灭菌的器物放入锅内（器物不要装得太满，以免影响灭菌效果），盖好锅盖，将螺旋柄拧紧（对角式均匀拧紧），打开排气阀。 3. 点火 启动开关，电加热器工作。 4. 排放冷空气 锅内水沸腾后，蒸汽逐渐驱赶锅内冷空气，当温度计指针指向100时，证明锅内已充满蒸汽，冷空气被驱尽，关闭排气阀。 5. 升压、保压与灭菌 关闭排气阀以后，锅内成为密闭系统，蒸汽不断增多，压力计和温度计的指针上升，当压力达到0.1MPa，温度为121时，开始灭菌计时；控制热源，维持0.1Mpa、12130min即完成灭菌。 6. 降压与排气 完成灭菌后停止加热，任灭菌锅自然冷却降压。当压力降至0.025MPa以下后，可打开排气阀排除余汽。 7. 出锅 待锅内压力降至大气压时揭开锅盖，取出器物，排掉锅内剩余水。 3.细菌的分离培养与细菌移植 细菌的分离培养： 平板划线分离法： （1）右手持接种环于酒精灯上烧灼灭菌，待冷。 （2）无菌操作取病料，若为液体病料，可直接用灭菌的接种环取病料一环;若为固体病料，首先将烙刀在酒精灯上灭菌，立即用其将病料表面烧烙灭菌，并在烧烙部位做一切口，然后用灭菌接种环从切口插入组织中缓缓转动接种环，取少量组织或液体。 （3）左手持平皿，用拇指、食指及中指将皿盖打开一侧（以小角度为佳，角度能划线即可） （4）将已取被检材料的接种环伸入平皿，并凃于培养基一侧，然后自动抹处成3040角，以腕力在平板表面轻轻的分区划线。 （5）划线完毕，烧灼接种环，将培养皿盖好，用记号笔在培养皿底部标明被检材料，日期，倒置37温箱中，培养1824h观察结果。 细菌移植 斜面移植： （1）左手持菌种管及琼脂斜面管，一般菌种管放在两侧，斜面管放在内侧，两管口并齐，管身倾斜，斜面向上，管口靠近火焰。 （2）右手拇指，食指及中指持接种环在酒精灯上烧灼灭菌 （3）将斜面管的棉塞夹在右手掌与小指之间，菌种管棉塞夹在小指与无名指之间，将两棉塞一起拔出。 （4）把灭菌接种环伸入菌管内，挑取少量菌苔将其立即伸入斜面培养基底部，由下而上在斜面上弯曲划线，然后管口和棉塞通过火焰后塞好，接种环烧灼灭菌。 （5）在斜面管口，写明菌种，日期，置37温箱内，培养1824h，观察生长情况。 4.细菌的生化试验 糖发酵试验：将细菌无菌操作接种于糖发酵培养基中，37培养2448小时，结果3种： 有的只产酸，有的产酸产气，有的不发酵 甲基红与VP试验（鉴别产气肠道杆菌和大肠杆菌） VP试验：由于产气肠杆菌使丙酮酸脱羧生成乙酰甲基甲醇，在碱性溶液中氧化，生成二乙酰，与培养基反应生成红色化合物，所以VP试验为阳性，大肠杆菌不能生成乙酰甲基甲醇，为阴性不变色。 甲基红试验：产气肠杆菌丙酮酸较少，酸性较弱，故为阴性，甲基红指示剂为黄色 大肠杆菌丙酮酸较多，酸性较强，故为阳性，甲基红指示剂为红色。 吲哚试验：细菌可分解蛋白胨中的色氨酸产生吲哚，加入二甲苯，摇匀，静置片刻，沿试管壁加入吲哚试剂，若能形成玫瑰吲哚而成红色，则为阳性，不变色为阴性。（大肠杆菌为阳性，产气杆菌为阴性） 硫化氢试验：细菌分解培养基中的含硫氨基酸，产生硫化氢，与加到培养基中的硫酸亚铁反应，生成黑色的硫化亚铁，使培养基变黑，为硫化氢阳性反应，不变色为阴性反应。 5. 凝集试验 鸡白痢全血平板凝集试验 （1）取一块洁净的玻板，划出一定规格的方块 （2）在每个方块的中心滴一滴鸡白痢全血平板凝集抗原 （3）用采血针刺破鸡冠或翅静脉采集新鲜血液 （4）在抗原滴旁边滴加等量的一滴新鲜血液 （5）用一洁净的牙签将抗原与血液混匀，不同检样不能用同一牙签混匀。 （6）轻轻摇动，使混合物反应2min 结果，室温下在2min内出现凝集现象为阳性，未出现凝集现象为阴性 布鲁氏菌的试管凝集试验 （1）每份血清用5支试管，另取对照管3支，置于试管架上。 （2）取0.5%石碳酸生理盐水，第一管加入2.3ml,25管加入0.5ml，然后另取吸管吸取被检血清0.2毫升，加入第一管中，并反复 吸吹3次将血清与生理盐水充分混合均匀，吸出1.5ml弃之，再吸出0.5ml加入第2管，混匀后吸出0.5ml加入第三管，依此类推至第5管，混匀后吸出0.5ml弃之。第6管中不加血清，第7管中加1:25稀释的布鲁氏阳性血清0.5ml，第8管中加1:25稀释的布鲁氏阴性血清0.5ml。 （3）将布鲁氏菌试验凝集抗原用0.5%石碳酸生理盐水稀释20倍，在各管中分别加入0.5ml，加完后，充分振荡，放入37温箱中24h，取出观察并记录结果。 （4）结果判定。以“+”表示反应强度，以出现“+”以上凝集现象的最高稀释倍数，作为该血清的凝集价。 （5）判定标准，牛马，骆驼凝集价为1:100，猪，羊，狗凝集价为1:50，判为阳性;牛，马，骆驼凝集价为1:50，猪，羊，狗为1:25，判为可疑。 6.琼脂扩散试验 琼脂板的制备 称取琼脂糖1.0g，加到100ml，pH7.2 0.01mol/L PBS中，在水浴中煮沸或用电炉煮沸充分融化，加入8g氯化钠，充分溶解后加1%硫柳汞溶液1ml，冷至4555，将洁净、干热灭菌、直径为90mm的平皿置于平台上，每个平皿加入1822ml,加盖待凝固后，把平皿倒置以防水分蒸发，方普通冰箱保存备用 琼脂扩散操作： （1）打孔，在制好的琼脂板上按7孔一组的梅花形打孔，孔径5mm,孔距3mm，将孔内的琼脂用注射针头从斜面向上轻轻挑出，挑出时注意不可使边缘或琼脂层脱离皿底。 （2）封底，用酒精灯轻烤平皿底部至琼脂板底部刚刚要溶化为止，封闭孔底部，以防侧漏 （3）加样，用微量移液器吸取抗原悬液滴入中间孔，标准阳性血清分别滴入外周的1和4孔，被检血清按编号顺序分别加入另外4个孔，每孔均以加满不溢出为度，每加一个样品应换一个滴头 （4）反应，加样完毕后，静置510min，然后将平皿轻轻倒置放入湿盒内，37温箱中作用，分别在24h,36h,72h观察并记录结果 结果判定： 判定方法：将琼脂板置日光灯或侧强光下观察，若标准阳性血清与抗原孔之间出现一条清晰的白色沉淀线，则试验成立。 判定标准：被检血清孔与中心抗原孔之间出现清晰致密的沉淀线，且该线与抗原和标准阳性之间沉淀线末端吻合，则被检血清为阳性。 被检血清孔与中心孔之间不出现沉淀线，且标准血清沉淀线直向被检血清孔，则被检血清判为阴性。 7.酶联免疫吸附试验(ELISA) PPA-ELISA检测猪瘟抗体效价 （1）包被，用pH9.6碳酸盐缓冲液稀释猪瘟病毒抗原至1g/ml,以微量加样器每孔加样100l,置湿盒内37包被23h。 （2）洗涤，用洗涤液将反应板洗涤3次，每次5min，甩干。 （3）封闭，以微量加样器在每孔内加封闭液200l,置湿盒内37封闭3h. （4）洗涤，重复第二步 （5）加待检血清，以微量加样器在每孔内加100l稀释液，然后在酶标板的第1孔加100l待检血清，以微量加样器反复吹吸几次混匀后，吸100l加至第2孔，依次倍比稀释支第12孔，剩余的100l弃去，置湿盒内37作用