抗瓜氨酸化纤维蛋白原抗体的检测及其在类风湿关节炎中的临床意义_赵义(1).pdf

论著 抗瓜氨酸化纤维蛋白原抗体的检测及其在 类风湿关节炎中的临床意义 赵 义 田 昕 w 栗占国 v 北京大学人民医院风湿免疫科 北京 100044 摘 要 目的 探讨抗瓜氨酸化的人纤维蛋白原抗体 ACF 在类风湿关节炎 RA 临床诊断中的价值 方法 采 用肽酰精氨酸脱亚氨基酶将人纤维蛋白原在体外环境下催化成瓜氨酸化形式 采用 ELISA 方法对 183例 RA 121 例系统性红斑狼疮 48例骨关节炎和 108例健康对照者血清中的 ACF水平进行检测 并与 RA患者临床相关资料 和实验室指标进行统计学分析 结果 ACF在 RA 系统性红斑狼疮 骨关节炎和健康对照者中的阳性率分别为 67 21 25 62 18 75 和 2 78 对 RA 的敏感性为 67 21 特异性为 84 84 阳性预测值为 74 55 RA 患者中 ACF的阳性率显著高于其他 3组 P 0 001 与 RA 临床及实验室指标比较显示 ACF与红细胞沉降率 r 0 386 P 0 001 抗环瓜氨酸肽 CCP 抗体 r 0 239 P 0 05 和抗角蛋白抗体 AKA r 0 288 P 0 05 具有相关性 ACF阳性组与阴性组 ESR X线分期 Ig M RF 抗 CCP抗体 AKA 和抗核周因子的差异有统计 学意义 另外 在 Ig M RF AKA和抗核周因子阴性患者中 ACF具有较高的阳性率 结论 ACF在 RA 中具有较高 的敏感性和特异性 且与红细胞沉降率 抗 CCP抗体 AKA相关 ACF阳性患者更容易出现影像学改变 另外 ACF 检测对于 RA 相关抗体阴性的患者具有辅助诊断价值 关键词 纤维蛋白原 瓜氨酸 酶联免疫吸附测定 关节炎 类风湿 中图分类号 R5931220 4 文献标识码 A 文章编号 1671 167X 2006 04 0350 06 Diagnostic values of antibody to citrullinated human fibrinogen in rheumatoid arthritis ZHAO Y i T I AN X inw LI Zhan guov Department ofRheumatology and I mmunology Peking University People sHospita l Beijing 100044 China ABSTRACT Objective To study the prevalence of antibody to citrullinated human fibrinogen ACF in rheu m atic diseases and the diagnostic values in rheumatoid arthritis M ethods Human fibrinogen was dei m inated by the peptidylarginine dei m inase PAD in the presence of Ca 2 in vitro ACF wasdetected by ELISA in 352 patientsw ith rheu m atic diseases 183 RA 121 SLE and 48OA and 108 healthy con trols The sensitivity and specificity in RA were calculated and the correlations bet ween ACF and the clinical and laboratory parameters were analysed by SPSS statistical soft ware Results Compared w ith SLE 25 62 OA 18 75 and healthy control 2 78 respectively the patientsw ith RA had a significantly higher level ofACF 67 21 P 0 001 ACF had a sensitivity of 67 21 and a spe cificity of 84 84 for RA In the investigated clinical and laboratory para m eters of RA the significant correlationswere found bet weenACF and ESR r 0 386 P 0 001 ant i CCP antibody r 0 288 P 0 05 andAKA r 0 288 P 正常标本 D 值 x 2s为阳性阈值 AU Ar bitrary unit 值 D瓜氨酸化Fg DBSA 待测血清 D瓜氨酸化Fg DBSA 标准血清 100 标准血清为阳性血清池 1 4 RA相关临床及实验室资料的采集 所有 RA患者的临床及实验室资料均由北京大 学人民医院病案检索数据库中获得 临床资料包括 性别 年龄 病程 晨僵时间 皮下结节 肺部损害 疾 病活动性评分 DAS28 和 X线表现 实验室指标包 括红细胞沉降率 ESR C反应蛋白 CRP Ig M RF 抗 CCP抗体 AKA和 APF X线表现按照 X线 分期记录相应例数 期为正常或关节面下骨质疏 松 期为有骨质疏松 关节周围软组织肿胀 关节 间隙正常或有轻微的关节面骨质侵蚀或破坏 但无 关节畸形 期为明显的关节面下骨质侵蚀和破 坏 关节间隙变窄或消失 但无纤维性或骨性强直 及关节半脱位畸形 期为除以上两期表现外 合并 有关节纤维性或骨性强直 皮下结节和肺部损害按 有无分别记录例数 AKA和 APF分别记录阳性和 阴性患者例数 其他实验室指标采用测定数值进行 记录 1 5 统计学处理 采用 SPSS 13 0统计学软件 对于正态分布的 351 赵 义 等 抗瓜氨酸化纤维蛋白原抗体的检测及其在类风湿关节炎中的临床意义 的计量资料以 x s表示 组间比较采用 t检验 非 正态分布的计量资料以中位数 极差 表示 组间比 较采用 Mann Whitney U检验 两变量间的相关性 分析采用 Spear man等级相关分析法 两独立样本 率的比较用 V 2 检验 对于配对计数资料的比较采用 M cNemar V 2 检验 其两组间相关性采用 Kendall s Turb相关分析 P 0 05为差异有统计学意义 2 结果 2 1 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 SDS PAGE 及蛋 白印迹 W estern blotting 考马斯亮蓝 CBB 染色显示 Fg的 A B和 C 三 条带分别位于约 63 000 56 000和 47 000处 而瓜 氨酸化 Fg的 3条带在 SDS PAGE凝胶中均较 Fg电 泳迁移率减慢 蛋白印迹可见瓜氨酸化 Fg出现明 显的 3条抗体结合条带 而 Fg则无抗体结合带出 现 说明 Fg的 3条链均被瓜氨酸化 图 1 A CBB staining changes in mobilities of proteins in SDS fields are shown progressive decreases in the mobilities of fibrinogen after citrull i nation by PAD B W estern blotting Ant iMC the ant i citrulline modified antibodies to citrullinated fibrinogen lane 1 are shown in lane4 fibrinogen lane 5 is not detected by the Ab 1 protein marker 2 citrullinated fibrinogen 3 fibrinogen 4 citrullinated fibrinogen 5 f i brinoge 图 1 纤维蛋白原瓜氨酸化的鉴定 Figure 1 Citrullination by PAD was confir med using Coomassie Blue CBB staining andW estern blotting 2 2 ACF的检测 我们通过 EL ISA 方法对 183 例 RA 121 例 SLE 48例 OA以及 108例健康人血清中的 ACF水 平进行了测定 108例健康人血清光密度值均数为 0 627 标准差为 0 221 阳性阈值为 1 069 据此计 算出 ACF在 RA SLE OA 以及健康人血清中的阳 性率分别为 67 21 25 62 18 75 和 2 78 在 RA组中 ACF的阳性率高于其他三组 差异有统 计学意义 P 0 05 表 1 ACF对于 RA具有较高 的敏感性 67 21 和特异性 84 84 其阳性预 测值和阴性预测值分别为 74 55 和 79 66 表 1 ACF在类风湿关节炎诊断中的意义 Table 1 The prevalence ofACF in several rheumatic diseases and health controls G roups No of serum tested n No of positive serum n Positive rate RA18312367 21 SLE1213125 62 OA48918 75 Heath controls10822 78 P 0 05 我们对晨僵时间 皮下结节 肺部损害 X线分期及 DAS28在两组间 进行了比较 结果显示 X线分期在抗体阳性组和 阴性组之间差异有统计学意义 P 0 001 阳性组 36 9 出现 期 X线改变的患者比率明显多于 阴性组 15 7 P 0 05 在 ACF 阳性 RA 患者中 出现皮下结节和 肺部损害的比率分别为 8 1 10 123 和 8 9 11 123 而 ACF 阴性患者中则分别为 11 7 7 60 和 10 0 6 60 差异 无 统 计学 意 义 P 0 05 表 2 2 3 2 ACF与 RA相关实验室指标之间的关系 在 183例 RA患者中 ACF与抗 CCP抗体相关 r 0 242 P 0 05 另外 我 们比较了 ACF 阳性组与阴性组之间 Ig M RF ESR 和 CRP的水平 结果显示 在 ACF阳性组 IgM RF 和 ESR水平明显高于阴性组 差异有统计学意义 P 均 0 01 而 CRP水平在两组之间差异无统计 学意义 P 0 064 表 2 相关性分析表明 ACF 与 ESR相关 r 0 386 P 0 01 而与 Ig M RF 无 关 在 183例入选的 RA患者中 144例患者检测了 AKA 119例患者检测了 APF 通过 McNe mar V 2 检 352 北京大学学报 医学版 JOURNAL OF PEK I NG UN I VERSI TY HEALTH SCI ENCES Vo l 38 No 4 Aug 2006 验和 Kendall s Turb相关分析 在检出阳性率上 ACF高于 AKA V 2 55 54 P 0 01 和 APF V 2 67 21 P 0 01 差异有统计学意义 ACF与 AKA 相关 CO 0 197 P 0 01 而与 APF无关 CO 0 099 P 0 217 另外 183 例 RA 患 者中 Ig M RF阴 性患 者 50 例 其 中 19 例 ACF 阳性 38 00 在 107 例 AKA 阴 性 的 RA 中 有 59 81 64 107 的患者 ACF 阳性 在 107例 APF 阴性的患者中 ACF 阳性率为 68 22 73 107 但在抗 CCP抗体阴性 RA中 仅有 14 58 7 58 患者出现 ACF阳性 表 3 表 2 ACF与 RA 患者临床相关指标的关系 Table 2 Comparison of clinica l and laboratory features between patients with ACF and those without ACF G roup tests Clinical and laboratory Characteristics Patientsw ith ACF n 123 Patients without ACF n 60 P Clinical features Stiffness ti me h 1 20 0 33 5 00 1 00 0 08 3 50 0 124 Rheu matoid nodules n 10 8 1 7 11 7 NS Lung damages n 11 8 9 6 10 0 NS DAS28 score x s 5 39 1 525 31 1 450 909 R adiographic staging n Stage 31 25 2 27 45 0 0 007 Stage 34 27 6 18 30 0 0 740 Stage 17 13 8 7 11 7 0 685 Stage 41 33 3 8 13 3 0 004 Laboratory features Ant i CCP U mL 4 6 0 8 6 2 9 0 8 4 0 011 Ig M RF I U mL 227 0 3830 37 0 4590 0 000 CRP mg L 26 1 1 0 960 0 19 4 1 0 126 0 0 064 ESR mm h 65 6 150 50 3 104 0 010 Data are presented asmedian range NS not significant 图 2 ACF与抗 CCP 抗体的相关性 Figure 2 The correlation ofACF ELISA AU on the y ax is and ant i CCP antibodies EL I SA U mL on the x asis in 183 RA patients The coefficient of 0 242 P 0 01 suggests a statistical connection between ACF and ant iCCP antibodies 3 讨论 瓜氨酸化是蛋白质翻译后修饰的一种形式 在 Ca 2 的存在下 肽酰精氨酸脱亚氨基酶 PAD 催化 蛋白中的精氨酸残基脱亚氨基 转变为瓜氨酸残基 这种改变会导致蛋白质所带正电荷减少 蛋白分子 内部结构发生变化 使得原先隐藏于分子内部的基 团得以暴露出来 7 另外 由于正电荷的减少 瓜 氨酸化蛋白 与 MHC 类 分子 如 HLA DRB1 0101 HLA DRB1 0401 HLA DRB1 0404 的亲合 力增高大约 100倍 使其更容易被提呈 抗原性增 强 8 因此 蛋白质的瓜氨酸化可能与 RA 的自身 T细胞活化 抗体形成和炎症反应密切相关 表 3 ACF在 RA相关自身抗体阴性患者中的意义 Table 3 The prevalence ofACF in sera negative RA G roups of antibody negative Total n N o ofACF positive n Rate IgM RF501938 00 AKA1076459 81 APF1077368 22 ant i CCP48714 58 IgM RF IgMrheumatoid factor AKA antikeratine antibodies APF antiperinuclear factor 研究表明 在 RA 关节滑膜内有大量的纤维蛋 白的沉积 而纤维蛋白的可溶性前体形式为纤维蛋 白原 fibirnogen Fg 是一种主要的血浆成分 Fg 在参与凝血 纤溶 细胞和基质的相互作用 炎症反 应 伤口愈合以及瘤形成中具有重要作用 9 2001 年 Baeten等 10 发现在 RA滑膜内存在大量的瓜氨 353 赵 义 等 抗瓜氨酸化纤维蛋白原抗体的检测及其在类风湿关节炎中的临床意义 酸化 citrullinated 蛋白 Masson Bessiere等 11 证实 滑膜内的这种瓜氨酸化蛋白主要为瓜氨酸化的纤维 蛋白 fibrin 的 A和 B链 在此基础上 2002年 Nagueira等 12 通过 ELISA 方法证实针对瓜氨酸化 的 Fg的自身抗体在 RA 中具有与 RF和抗 CCP抗 体相似的诊断价值 N ielen等 13 对抗瓜氨酸化人 纤维蛋白原抗体 ACF 在早期关节炎中的诊断和预 后价值进行了研究 证实 ACF 在 RA 中的敏感性 55 8 和特异性 92 6 与抗 CCP抗体 分别 为 57 8 和 94 2 相近 而且在对 RA的早期诊 断上 其敏感性高于 Ig M 类风湿因子 IgM RF 并 与 RA的影像学进展相关 因此 ACF 很可能成为 一种新的特异性抗体被应用于 RA的诊断 3 1 人纤维蛋白原 Fg 的瓜氨酸化 Fg由两组 AA BB和 C3条多肽链通过二硫键 结合形成 1个蛋白分子 在变性凝胶电泳中二硫键 断裂 3条多肽链分开 因此在图 1中出现 3条电泳 带 Fg在 Ca 2 存在下 被 PAD酶催化 3条多肽链 中的精氨酸残基脱亚氨基转变为瓜氨酸残基 其分 子质量会稍有增加 约 1Da 14 同时由于电荷改 变 导致多肽链去折叠 肽链展开 因此 在 SDS PAGE电泳时 会出现瓜氨酸化的多肽链的泳动速 率较瓜氨酸化前有所减慢 15 通过抗修饰后瓜氨 酸抗体 抗 MC抗体 进行 W estern blotting检测 抗 体与瓜氨酸化的 Fg 3条肽链均有结合 在 X线片上 检测到三条发光条带 证明 Fg的三条多肽链均发生 瓜氨酸化 而 Fg无发光条带检出 说明瓜氨酸化成 功 3 2 在几种风湿病和健康人群中 ACF的分布 本研究采用 ELISA方法 对 183例 RA 121例 SLE和 48例 OA 患者以及 108例健康人血清中 ACF进行了测定 ACF 在 RA SLE OA及健康人中 的阳性率分别为 67 21 25 62 18 75 和 2 78 ACF对 RA的敏感性为 67 21 特异性为 84 84 RA 患者中 ACF 的阳性率显著高于另两 种风湿病以及健康人 与 N ielen等 13 的报道相比 敏感性高 而特异性稍低 这可能与被检的人群和 研究方法不同有关 从本研究结果看 ACF 在 SLE 和 OA中也有一定的阳性率 这可能与 ACF对未瓜 氨酸化的 Fg的交叉反应有关 我们以未瓜氨酸化 的 Fg为抗原包板通过 EL ISA方法对 RA SLE OA 及健康人血清中抗 Fg抗体也做了检测 结果发现与 健康人相比 抗 Fg抗体在三种风湿病中均有较低的 阳性率 而且三者之间差异无统计学意义 结果未 列出 这说明 ACF所针对的主要抗原表位为含有 瓜氨酸化的基团 而瓜氨酸化 Fg引起的自身免疫反 应对 RA是具有特异性的 3 3 ACF与 RA相关临床及实验室指标的关系 本研究对 ACF与抗 CCP抗体之间的相关性进 行了分析 在被检的 183例 RA患者中 共有 159 例患 者 进行 了抗 CCP 抗 体的 检测 阳性 率 为 69 81 通过 Spearman等级相关分析表明 ACF 与抗 CCP抗体之间存在正相关性 这表明抗 CCP 抗体与 ACF所针对的抗原具有共同的抗原表位 而 瓜氨酸化的 Fg很可能就是抗 CCP抗体所针对的体 内天然抗原之一 两种抗体在阳性率上没有差异 而且 抗 CCP抗体阴性患者中 ACF的阳性率也低 这表明 ACF与抗 CCP抗体具有很好的一致性 目 前认为 抗 CCP抗体具有早期诊断 RA的价值 甚至 在 RA发病前的数年抗 CCP抗体即已出现 N ielen 等在对 379例早期关节炎病人的研究中显示 ACF 在对 RA的早期诊断方面与抗 CCP抗体高度一致 本研究中所选病例由于并非全是早期患者 因此 ACF的早期诊断价值有待进一步的证实 尽管如 此 由于 ACF与抗 CCP抗体之间存在正相关性及相 似的敏感性和特异性 ACF对于 RA的辅助诊断价 值应与抗 CCP抗体相似 在对 ACF与 RA患者的年龄 病程 晨僵时间 皮下结节 肺部损害 X线分期以及疾病活动性评分 DAS28 等疾病相关临床资料的分析中发现 ACF 阳性组与 ACF 阴性组相比 在年龄 病程 晨僵时 间 皮下结节 肺部损害及 DAS28评分等方面差异 无统计学意义 而在影像学表现上 ACF阳性组 期 X线改变明显多于阴性组 这可能预示 ACF阳性 患者更容易出现骨质的破坏 已有人报道抗 CCP 抗体除与 RA患者的骨质侵蚀程度相关外 与其他 疾病活动指标之间无明显的相关性 16 这与本研究 中对于 ACF的分析结果极为相似 这说明 ACF与 抗 CCP抗体在对 RA的病情评估方面具有高度的一 致性 目前认为抗 CCP抗体与 RA患者的骨质破坏 出现时间及严重程度密切相关 17 而 ACF对于骨 破坏是否有同样的预示价值有待于进一步的前瞻性 临床对照研究 在 RA相关实验室指标方面 IgM RF和 ESR在 ACF阳性组与阴性组之间具有显著的 差异 阳性组的水平明显高于阴性组 相关性分析 显示 ACF与 ESR之间存在正向相关 而与 IgM RF 无明显相关 ESR是 RA病情活动性指标之一 其 水平的高低与血浆中的纤维蛋白原浓度有关 炎症 条件下 纤维蛋白原浓度增加 由于纤维蛋白原为一 种重要的前炎症因子 因此 ESR与 ACF之间在病 354 北京大学学报 医学版 JOURNAL OF PEK I NG UN I VERSI TY HEALTH SCI ENCES Vo l 38 No 4 Aug 2006 理生理学上可能存在某些未知的关系 IgM RF在 RA患者中具有很高的敏感性 其抗体水平与 RA的 病情活动有一定的关系 ACF阳性组 Ig M RF水平 较高可能反映了这部分患者体内较强的体液免疫水 平 但二者之间缺乏相关性 结果未列出 研究中还发现 有 38 的 IgM RF阴性的患者 其 ACF是阳性 19 50 这表明 ACF对于 RF阴性 的 RA患者可能具有一定的诊断价值 另外 与 AKA和 APF这两种 RA特异性抗体相比 ACF的阳 性率更高 尤其在这两种抗体阴性的 RA患者中 ACF具有较高的阳性率 因此 ACF在 RF AKA和 APF阴性的 RA患者中是一项重要的实验室指标 三种抗体的联合检测更有力于提高 RA的检出率 总之 ACF在 RA 中具有很高的敏感性和特异 性 在对 RA的诊断上具有与抗 CCP抗体同样的价 值 ACF与 RA 患者体内 ESR 的水平相关 并对 Ig M RF AKA及 APF 阴性 RA 的诊断具有重要意 义 参考文献 1 Schellekens GA de Jong BA van denHoogen FH et a l C itru l line is an essential constituent of antigenic deter m inants recognized by rheumatoid arthritis specific autoantibodies J Clin Invest 1998 101 273 281 2 Schellekens GA V isser H de Jong BA et a l The diagnostic properties of rheumatoid arthritis antibodies recognizing a cyclic citr ullinated peptide J Arthritis Rheum 2000 43 155 163 3 V asishta A D iagnosing early onset r heumatoid arthritis the ro le of ant i CCP antibodies J Am Clin Lab 2002 21 34 36 4 ForslindK Ahl menM EberhardtK et a l Prediction of radiolog ical outcome in early rheumato id arthritis in clinical practice ro le of antibodies to citrullinated peptides ant iCCP J Ann Rheum D is 2004 63 1090 1095 5 Nogueira L SebbagM V incentC et a l Perfor mance of two EL I SA s forantifilaggrin autoantibodies using eitheraffinity purified or dei m inated recombinant hu man filaggrin in the diagnosis of rheu matoid arthritis J Ann Rheum D is 2001 60 882 887 6 SuzukiA Yamada R Ohtake YamanakaM et a l Ant i citrull i nated collagen type I antibody is a target of autoi mmunity in rheu matoid arthritis J Biochem B iophys Res Commun 2005 333 418 426 7 Vossenaar ER Zendman AJ van Venroo ijW J et a l PAD a grow ing fam ily of citr ullinating enzymes genes features and in volvement in disease J Bioessays 2003 25 1106 1118 8 H ill JA Southwood S Sette A et a l Cutting edge the conver sion of arg inine to citrulline allows for a high affinity peptide inter action w ith the rheumatoid arthritis associated HLA DRB1 0401 MHC class IImolecule J J I mmuno l 2003 171 538 541 9 M osessonMW Fibrinogen and fibrin structure and functions J J ThrombH aemost 2005 3 1894 1904 10 Baeten D Peene I UnionA et a l Specific presence of intrace l lular citrullinated proteins in rheu matoid arthritis synov iu m rele vance to antifilaggrin autoantibodies J A rthritis Rheum 2001 44 2255 2262 11 M asson Bessiere C Sebbag M G irba lNeuhauser E et a l The major synovial targets of the rheu matoid arthritis specific antifilag grin autoantibodies are dei m inated for m s of the a lpha and beta chains of fibrin J J I mmuno l 2001 66 4177 4184 12 Nogueira L Sebbag M Chapuy R egaud S et a l Autoantibodies to dei m inated fibrinogen are the most efficient serological criterion for the diagnosis of rheumato id arthritisabstract J A 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