第四章 沉淀法.ppt

第四章沉淀法 precipitation 2 沉淀 目的 分离和浓缩 概述 3 利用沉析剂使生化物质在溶液中的溶解度降低而形成无定形固体沉淀的过程 蛋白质分子的溶解特性 4 防止蛋白质凝聚沉淀的屏障 蛋白质周围的水化层 蛋白质两性电解质 分子间静电排斥作用 5 沉淀法的分类 根据所加入的沉淀剂的不同 沉淀法可以分为 1 盐析法 2 等电点沉淀法 3 有机溶剂沉淀法 4 非离子型聚合物沉淀法 5 聚电解质沉淀法 6 复合盐沉淀法等 7 亲和沉淀法 8 选择性沉淀法 6 一 盐析 概念 盐析是可逆的 而变性是不可逆的 7 在高浓度的中性盐存在下 蛋白质 酶 等生物大分子物质在水溶液中的溶解度降低 产生沉淀的过程 盐析法机理 1 破坏水化膜 分子间易碰撞聚集 2 破坏水化膜 暴露出憎水区域 3 中和电荷 减少静电斥力 8 9 盐析机理示意图 盐析过程 当中性盐加入蛋白质分散体系时可能出现以下两种情况 1 盐溶 现象 salt in 低盐浓度下 增加蛋白质分子间静电斥力 蛋白质溶解度增大 2 盐析 现象 salt out 高盐浓度下 中和电荷 破坏水化膜 蛋白质溶解度随之下降 10 11 盐析作用要强盐析用盐需有较大的溶解度盐析用盐必须是惰性的来源丰富 经济 1 盐析用盐的选择 12 盐析用盐的选择 阴离子的影响大于阳离子阴离子盐析效果 柠檬酸盐 PO43 SO42 CH3COO Cl NO3 SCN 阳离子盐析效果 NH4 K Na 高价阳离子 13 盐析中常用的盐 硫酸铵 硫酸钠 磷酸钾 磷酸钠 盐析用盐的选择 14 硫酸铵是最常用的蛋白质盐析沉淀剂 1 价廉 2 溶解度大 温度系数小 3 不易引起蛋白质变性 盐析用盐的选择 缺点 1 水解变酸 2 高pH释氨 腐蚀 3 残留产品有影响 15 2 盐析操作 加盐方式 硫酸铵的加入有以下几种方法 1 加入固体盐法 工业用用于要求饱和度较高而不增大溶液体积的情况 2 加入饱和溶液法用于要求饱和度不高而原来溶液体积不大的情况 一般40 60 3 透析平衡法多用于结晶 16 S KsIS 蛋白质的溶解度 g L I 离子强度 1 2 mizi2mi 离子i的摩尔浓度 Zi 所带电荷 常数 图中截距Ks 盐析常数 图中直线斜率 Cohn经验式 17 3 盐浓度对盐析效果的影响 和Ks的物理意义 代表截距与蛋白质种类 温度 pH值有关 与盐无关 Ks 盐析常数 代表图中直线的斜率 与温度和pH无关 但和蛋白质与盐的种类有关 18 用盐析法分离蛋白质的二种方法 Ks分段盐析法 用于早期的粗提液 固定pH 温度 改变盐浓度 分段盐析法 用于进一步精制 固定离子强度 改变pH及温度 19 最适饱和度是30 55 分段盐析 fractionalsaltingout 20 4 盐析法特点 成本低 操作简单 安全 不会引起蛋白质变性 分离效果不理想 21 蛋白浓度为2 3 5 盐析注意事项 选择适宜饱和度采用分步盐析为了避免盐对酶的影响 一般脱盐处理 22 脱盐1 透析2 凝胶过滤 23 在含有溶质的水溶液中加入一定量亲水的有机溶剂 降低溶质的溶解度 使其沉淀析出 二 有机溶剂沉淀法 24 机理 A降低溶剂介电常数B破坏水化膜 有机溶剂沉淀法机理 25 1 常用的有机溶剂沉析剂 选择依据 水溶性要好介电常数要小致变性作用要小毒性要小 挥发性适中容易获取常用 乙醇 甲醇和丙酮 26 1 温度必须在低温下进行2 pH值 pH多控制在待沉蛋白质的等电点附近 3 样品浓度 一般初浓度为0 5 2 4 中性盐浓度 一般中性盐浓度为0 01 0 05mol L 常用的为醋酸钠 醋酸铵 氯化钠 5 某些金属离子 如Ca2 Zn2 等可与某些成阴离子状态的蛋白质形成复合物 并降低溶剂用量 2 有机溶剂沉淀法的影响因素 27 优点 分辨能力比盐析法高 沉淀不用脱盐 过滤较为容易 缺点 容易引起变性失活 操作要求在低温下进行 成本高 3 有机溶剂沉淀法的特点 28 三 等电点沉淀法 在低的离子强度下 调pH至等电点 降低蛋白质间静电斥力 使分子间相互吸引 形成沉淀的操作 pH pI 29 等电点沉淀法 30 等电点沉淀法注意事项 适用于憎水性较强的蛋白质 往往不能获得高的回收率 通常与其他沉淀方法结合使用 31 四 非离子型聚合物沉淀 用聚乙二醇 PEG 等非离子性聚合物能降低蛋白质的溶解度 有选择性的沉淀蛋白质 机理 与有机溶剂相似 能降低水活度 破坏蛋白质的水化膜 常用 分子量 4 000 32 五 聚电解质沉淀 机理 架桥与静电离子型多糖聚合物酸性多糖 如 羧甲基纤维素 海藻酸钠合成的离子聚合物 聚丙烯酸 pH2 890 蛋白沉淀 聚苯乙烯季胺盐 pH10 4 95 蛋白沉淀 33 六 成盐类复合物沉淀 此类沉析剂有以下三种 1 高价金属盐2 苦味酸盐 单宁酸盐 鞣质等3 无机复合盐 磷钨酸盐 磷钼酸盐等 34 1 金属离子沉淀蛋白质 一般可分三类 能与羧基 胺基等含氮化合物以及含氮杂环化合物强烈结合的一些金属离子 如 Mn2 Fe2 u2 Zn2 能与羧酸结合而不与含氮化合物结合的一些金属离子 如 Ca2 Ba2 Mg2 Pb2 能与巯基化合物强烈结合的一些金属离子 如 g2 Ag2 Pb2 35 2 有机盐法含氮有机酸能与有机分子的碱性功能团形成复合物3 无机复合盐法 如磷钨酸盐 磷钼酸盐等 以上盐类复合物都具有很低的溶解度 极易沉淀析出 成盐类复合物沉淀 36 七 亲和沉淀 利用蛋白质与特定的生物合成分子 免疫配位体 基质 辅酶等 之间高度专一的相互作用而设计出来的一种特殊选择性的分离技术 37 八 选择性变性沉淀法 利用蛋白质 酶和核酸等生物大分子对某些物理或化学因素敏感性不同 有选择地使之变性沉淀 以达到分离提纯的目的 38 各种沉淀方法应用范围 盐析法 多用于各种蛋白质和酶的分离纯化 有机溶剂沉淀法 多用于生物小分子 多糖及核酸产品的分离纯化 有时也用于蛋白质沉淀 等电点沉淀法 用于氨基酸 蛋白质等两性物质的沉淀 但单独应用较少 多与其它方法结合使用 非离子多聚体沉淀法 用于分离生物大分子 生成盐复合物沉淀 用于多种化合物 特别是小分子物质的沉淀 选择性沉淀 多用于除去某些不耐热的和在一定pH值下易变性的杂蛋白 39 九 沉淀法应用 沉淀法大规模提纯血浆蛋白胰岛素的提取柠檬酸的提取生活例子 咸鸭蛋 40 胰岛素的提取 猪胰提取液滤液滤液沉淀脱脂液粗制品 提取 乙醇提取 加酸调pH2 5 10 12 搅拌 碱化 氨水调pH7 8 8 0 酸化 酸调pH2 5 加ZnCl2 酸调pH2 7 2 8 12 15 放置过夜 酸调pH2 5 加NaCl 锌沉淀 盐析 脱脂 41 讨论题 咸蛋煮熟了 蛋黄里会有油 熟鸭蛋蛋黄中脂肪的含量高达31 为什么看不到一点油 可是在熟咸蛋的蛋黄中 却经常