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纯化及表征多酚氧化酶从茄属植物的berthaultii腺毛植物体内普遍存在着内生菌，由于其生活在没有外在感染症状的健康植物组织内部，因此植物内生菌的存在和作用长期以来未被发现。直到20世纪30年代，由于牲畜食了感染内生真菌的牧草，给畜牧业造成重大损失，才开始对植物内生菌有了初步认识。内生菌一词“endophyte”最早是由德国科学家DeBarry于1886年提出。1986年，Carrol将植物内生菌定义为生活在地上部分、活的植物组织内不引起明显症状的微生物。1991年，Petrini提出植物内生菌是指生活史的一定阶段生活在活体植物组织内不引起植物明显病害的微生物。1992年，K1eopper等认为植物内生菌是指能够定殖在植物细胞间隙或细胞内，并与寄主植物建立和谐联合关系的一类微生物，并首次提出了“植物理内生细菌”的概念，他认为能在植物体内定殖的致病菌和菌根菌不属于内生菌。-选择过程引起的调制解调器种植土豆（马铃薯）大幅纳尔欠其遗传基础。几个基因相似品种现在几乎所有的面积生长在美国塔特斯。选择质量可能是园艺糖尿病合并无意中删除或还原更新的重要抗虫性因素（如甾体甘氨酸oalkaloids）（34），直到最近，相对较小的成功为实现对选育抗昆虫帽子有适合种植马铃薯（例如美国太古甲虫，马铃薯甲虫）。因此，它是不urprising，种植马铃薯的易受攻击的从各种各样的节肢动物食草动物；小固有的昆虫性仍然在美国马铃薯。有，但是，广泛的多样性的遗传性状可在野生种质。野生马铃薯品种表现出很大的抗虫性无害环境技术。野生马铃薯种berthaultii玻利维亚awkes显示了高度的抗蚜虫，eafhoppers，跳蚤甲虫，蜘蛛，和美国太古甲虫（11）。这种抵抗是由高密度在叶面腺毛（8，9，11）。腺毛是修改表皮细胞频率-“这项工作得到了部分孵化项目纽约州149417，国际马铃薯中心，并通过赠款康奈尔生物技术项目，这是由纽约州科学和技术基础，财团的产业，美国陆军研究办公室，和国家自然科学基金。-敷料赋予抵抗节肢动物害虫的行动和行为的改变allelochem分泌有毒物品，或通过物理诱捕。美国berthaultii拥有2类型的腺毛，腺毛和B型肝炎600至950微米的长度和分泌一种粘性混合物短期和中链脂肪酸酯化，蔗糖16。美国berthaultii蔗糖酯功能的圈套小型节肢动物，也作为强有力的喂养威慑为绿色桃蚜虫（22）。型腺毛由berthaultii是120至210，米长度，每50 - 70-am tetralobulate头直径（由四至八个细胞）在其顶点。型毛赋予抵抗昆虫诱捕聚合腺毛分泌物。易碎型腺毛头部破裂接触后的昆虫，排出分泌物迅速经过氧化聚合。聚合的硬化渗出液对昆虫妨碍行动，闭塞的口器，并最终将小节肢动物的叶子，与随后的死亡率（8，9，11）。以往的工作（4，8,25）表征了氧化聚合美国berthaultii聚合型腺毛分泌物2类型的氧化酵素，ppo2（欧共体1.10.3。）和P（欧共体1.11.1.7）。优先提供和组织是铜离子和血红素酶，分别，这是能够氧化交联多种酚类底物。当前的是无处不在，膜质酶，先生40000至45000氧化酚醌在费用的02（19，20，31，32）。本机是一种异质性酶组，局部区域内和细胞外，利用过氧化氢氧化各种各样的基板（7）。吉普森（8）指出，在02的情况下，内容破裂型一毛不聚合，显示，氧气是主要的氧化剂。相反，以往的（25）的研究也表明，P占很大部分氧化能力型腺毛。然而，这些工人没有样本个体毛，它很可能是大多数P他们观察nontrichomal。bouthyette等人。（4）初步确定在pp0和P型腺毛，但由于个人毛状体没有取样是没有明确规定这些酶是从皮毛或nontrichomal细胞的叶。马铃薯栽培，美国马铃薯，缺乏trichome-mediated昆虫诱捕阻力。尽管外在-缩写：多酚氧化酶，多酚氧化酶，过氧化物酶；多巴，二羟苯丙氨酸；电泳，等电聚焦；皮，国际标准化组织电点。-形态和美国berthaultii韭型三chomes基本上是保守的，毛状体的形成liage的马铃薯栽培是目前在低密度和不容易破裂。此外，当破裂，该内容由马铃薯型毛不氧化无法诱捕昆虫（9）。虽然三chome-based抗性机制的野生马铃薯被成功地转移到杂种四倍体的误码率thaultiiS马铃薯具有高密度的皮毛昆虫诱捕能力（29），失败的原因美国马铃薯腺毛分泌物进行氧化聚合聚合是未知的。本研究的目的是分析个人三chomes确定，净化，并描述小学氧化酶参与昆虫诱捕的误码率thaultii型腺毛和，此外，以确定是否失败的美国的皮毛为抗虫性与没有氧化酶类腺毛。材料与方法植物材料 种子的马铃薯berthaultii霍克斯，厂简介473334号，分别用10%（体积比）为10的味道，冲两次水，然后浸泡在9毫米的赤霉素24小时之前播种。土壤混合使用普罗米克斯本钢（总理品牌）。植物对每周施肥计划模块与20-10-20氮磷钾加双周应用螯合铁（330铁sesquestrene）。植物生长在250下1000年钨金属卤化物灯，一个ppfd 3.6103，mol2对的光子，光安排14至16小时光/ 8 10小时黑暗。 个人腺毛收藏每个电泳分析，250至7000毛手动收集通过触摸每个腺毛头部同年底，300 -，微米直径的玻璃毛细管，已制定出一个直径约50，嗯。后接触，毛状体破裂，其内容是进入毛细血管，这是充满了200毫米或10毫米的数码地面电视半胱氨酸，蔗糖50毫米，100毫米磷酸钠，PH值7。对样品进行离心12000g 5分钟去除碎片，和之前的上清液或电泳混合2%载体两性电解质或煮Laemm li样品缓冲液。SDS - PAGE电泳进行了10%聚丙烯酰胺minigels。凝胶运行在200伏（对照站）45分钟时是采用酸碱值为3。9.5预制5%聚丙烯酰胺凝胶（pharmacia-lkb生物技术）根据制造商的指示。确定型腺毛和蛋白质含量亚细胞分布的腺毛，7000型钛chomes收集分别为10毫米半胱氨酸，50毫米蔗糖，100毫米磷酸钠，PH值7。最后的体积的腺毛是27，这是成功的；65铝集合缓冲区，和样本中心fuged在7000g 5分钟- 40的上清液进行。75000g离心30分钟在airfuge 250（贝克曼仪器，公司。）。上清和洗颗粒被稀释到65冰川与集合缓冲区，和测定多酚氧化酶活性和蛋白质（Brad ford法，生物拉德，使用牛血清白蛋白为标准）。 和活性蛋白凝胶染液对多酚氧化酶活性检测，凝胶放置在一个0.1米磷酸钠溶液，PH值7，0.3米的儿茶酚，对苯二胺和90毫米5至10分钟，彻底用清水洗净，浸泡在10%柠檬酸为2分钟，和干。宝活性染色组成的6毫升的45毫米3采取在二甲基甲酰胺，92毫升0.1米醋酸钠，PH值5，和1.5毫升的30%过氧化氢。凝胶是培养为5分钟，用清水彻底洗净，和干。用考马斯染色，SDS - PAGE和等电聚焦凝胶固定在一个解决10%（瓦特/五）醋酸酸，25%（5 / 5）甲基与，3%（瓦特/五）磺基水杨酸。等电聚焦凝胶然后扩展洗地在5%（体积比）甲醇，7.5%（体积比）乙酸除去载体两性电解质，在染色前与首席运营官马西亮蓝R银染凝胶是固定的洗之前，开发（国家、相同抽动银染试剂盒ec-710）。纯化的多酚氧化酶完全展开叶的美国berthaultii被消灭棉花棒蘸解决200毫米数码地面电视。大约30的传单被擦背面和正面每拭子，共有4000个传单被消灭。原油腺毛分泌物挤压从拭子用注射器和15000g离心15分钟的supema 40西林（约20毫升）倒出，混合2毫升40%个载体两性电解质（H 4 - 6），并带到最后体积40毫升水。这个解决方案，然后装为制备电泳细胞（rotofor，和电泳仪）品种在40瓦功率。馏分收集思同时在真空和存在的多酚氧化酶确定使用分光光度多酚氧化酶活性测定6。活性组分进行汇总和透析为12 - 40小时前的变化在0.5米氯化钠，其次是2前变化的水。纯化的酶浓缩冷冻干燥和储存在-战车。铜消耗多酚氧化酶重组孵化酶在苹果酸钠33毫米，PH值5，1毫米硫酸铜为13小时在- 40。作为一个控制，一个整除是培养下相同的条件，但没有硫酸铜。除苹果酸过量铜离是一个1毫升的人数中G - 25柱平衡水。该reconsti了酶测定分光的多酚氧化酶活性和活性染色等电聚焦凝胶。底物特异性最初的反应率与各种基板多酚氧化酶采用分光光度法2-nitro-5-thio苯甲酸氧化醌产生各种酚类化合物的活性（6）。反应混合物的组成10毫米，100毫米磷酸钠，PH值7，和57米2-nitro-5-thiobenzoic；在1 1al，加上2温度的100毫升水。第二页做完图1。等电聚焦的蛋白质型毛。巷1，1850号berthaultii型毛，开发的多酚氧化酶活性；巷2号，1850号berthaultii型毛，考马斯染色蛋白；3巷500号，离型毛，开发蛋白银染色；巷4号，500号berthaultii型毛，开发的蛋白银染色；巷5号，1850号马铃薯型毛，制定了多酚氧化酶活性；巷6号，1850号berthaultii型毛，发达的过氧化物酶活性。图2。SDS - PAGE和免疫印迹法分别收集美国berthaultii和马铃薯型毛。1车道，美国误码率thaultii，500毛，银染；2，美国，500毛，银染；3车道，美国berthaultii，250毛，我munoblot发达与兔抗硫。berthaultii腺毛多酚氧化酶和羊抗兔二抗体共轭与辣根过氧化物酶；巷4，美国，250毛，免疫印迹的发展与兔抗硫。berthaultii腺毛，山羊抗氧化酶兔二抗体共轭与辣根过氧化物酶。酶联免疫吸附试验和免疫印迹多克隆抗体的制备腺毛多酚氧化酶由新西兰白兔皮下注射2300，克纯化多酚氧化酶乳化在1毫升的完整弗氏佐剂。随后注射100夹具在收入完全弗氏佐剂进行了15和21 d。titering抗血清进行了酶联免疫吸附试验使用100纯化的酶以及聚苯乙烯96孔板发展与亲和纯化的羊抗兔immunoglob胰岛素克碱性磷酸酶共轭（1）。在这些欺诈传统的滴度的抗血清，汇集收集10和30后提升为250000秒。一个4000稀释抗血清通常用于免疫印迹。电聚焦和SDS - PAGE minigels平衡20分钟在传输缓冲区的25毫米三，192毫米甘氨酸，20%（5 /五）甲醇，PH值8.3，然后转移到硝酸纤维素使用一个小型的transblot单元（仪）操作0，100五，0.25个1小时（1）。二次抗体山羊抗兔免疫球蛋白辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶共轭。结果多酚氧化酶和宝型毛美国berthaultii内容500 1850型毛收集分析电泳确定的贡献对多酚氧化酶和氧化酶的补充在型腺毛。手动分离型毛电泳分析蛋白质允许腺毛污染其它叶或表皮细胞。论广泛的PH值（酸碱度3.5-9.5）等电聚焦凝胶装内容500号berthaultii型毛，一个单一的蛋白质的种类（皮5.5）占50至70%的总腺毛蛋白，具有强烈的多酚氧化酶活性当1850个毛进行了分析（图1）。该predomi南斯的皮5.5个酶显然在银和考马斯亮蓝染色聚焦凝胶（图1）。二维码喷码电泳证实这些结果（不显示）。SDS - PAGE（图2）500型毛也表明这59000先生是主要的蛋白质在美国berthaultii型毛。虽然活性阴离子词性也出现在毛（图1），离散波段相应的蛋白质婆活动没有明显的从考马斯或银染色。虽然活性染色凝胶不提供比较准确的订单和多酚氧化酶活性的贡献使氧化腺毛分泌物，酚酮，一个特定的抑制多酚氧化酶，但宝基板（13），选择性地抑制大部分氧化活性的个人收藏的类型一个毛状体，这表明酶是主要的氧化性活动的美国berthaultii型毛（表）。多酚氧化酶是一种可溶性蛋白在酿酒berthaulti型毛七千型毛收集个人每年评估是否是与膜或质成分的腺毛和估计浓度的多酚氧化酶的皮毛。美国berthaultii型毛状体载约1毫微克的可溶性蛋白腺毛。大多数的多酚氧化酶活性（ 80%）和散装腺毛蛋白质留在上清液后高离心（75000g）（表一），这表明三丁目多酚氧化酶是一种可溶性蛋白。腺毛的多酚氧化酶的纯化虽然酶是一个重要的组成部分berthaultii S型一个毛状体，迅速与醌产生多酚氧化酶氧化修饰的蛋白质，和小尺寸数字皮毛，重大障碍净化多酚氧化酶从这些器官。因此，一个步骤的程序为净化腺毛多酚氧化酶的设计。毛收获的擦拭叶面用棉签饱和区。一个高层次的还原剂（200毫米数码地面电视）被纳入缓冲防止氧化修饰的多酚氧化酶。这些准备工作产生一个浅黄绿色粗腺毛与无提取物氧化褐变的特点。在一个代表有效的净化，4000小叶被消灭，收益率为1毫克蛋白在20毫升的200毫米数码地面电视。离心后清除杂物，粗毛制备子其制备点，有代表性的运行收益率为100，二均匀多酚氧化酶（无花果。3和4）。长期暴露在高浓度的多酚氧化酶的数码地面电视在分离部分灭活酶，显然去除铜。部分灭活酶进行侦察stituted处理铜”，产生了27倍酶的活性。其催化活性的恢复腺毛多酚氧化酶的酶蛋白进行等电聚焦重组酶，多酚氧化酶活性和染色（图5）。图3。腺毛多酚氧化酶的纯化聚焦。制备图4。银染聚丙烯酰胺凝胶电泳4微克，纯化的多酚氧化酶汇集分数12至15从预备点（图3）。纯化的多酚氧化酶的制备点细胞表现为单一条带，59000先生，银染法页（图4）。在一些准备工作，一个带17000先生成为可见后煮沸Laemm li样品缓冲（数据未显示）。这个乐队是不遵守时净化迅速完成，并没有在西部污点从聚苯醚收集新鲜的毛状体染色抗体的制备纯化的蛋白质，这表明它是由图5。铜氧化酶的纯化的重组腺毛。一，多酚氧化酶活性，检测中所描述的“材料和方法。”固体酒吧，多酚氧化酶活性，重组的存在1毫米铜”。孵出的酒吧，多酚氧化酶的活动之前，Cu 2 +重建。乙，多酚氧化酶活性染色电泳凝胶，PH值3.0-9.5，装有2，g cu24侦察stituted多酚氧化酶（1）和铜消耗多酚氧化酶（2道）。腺毛多酚氧化酶该59000多肽。这一假设得到证实孵化的粗毛制备一夜之间在0C在这些条件下，先生17000检测银乐队应变积累与相应减少高磁共振带（未显示）。纯化，冻干蛋白稳定型数周，或在水在- 40以上夜。氨基酸组成的纯化的多酚氧化酶一致的四种制剂（表二）。酸性电的蛋白是一致的高水平的天然的和澳大利亚，其中一些必须的谷氨酸和天门冬氨酸，分别为。表征酶抗体多克隆免疫沉淀anti-trichome多酚氧化酶近80%的多酚氧化酶活性从粗腺毛的制备，虽然它没有抑制多酚氧化酶活性直接（17）。本既不也不抑制蘑菇泰抗血清沉淀rosinase（17）。免疫电泳及等电聚焦控制固定的，具体的抗体酶型腺毛制剂。SDS - PAGE和免疫印迹本地电泳凝胶，该anti-trichome多酚氧化酶抗体交叉反应强烈反对45000先生带新鲜预削提取物的S . berthaultii和马铃薯全叶而不是在所有的商用（西格马）蘑菇酪氨酸酶（17）。聚苯醚型毛美国马铃薯主要的有价证券5.5蛋白提取三chomes南berthaultii是没有在美国的皮毛。美国马铃薯型毛只有微量蛋白酸性范围的凝胶被占领的皮5.5个酶的S .berthaultii毛（图1）。此外，多酚氧化酶活性没有检测到皮5.5带特性的S .berthaultii腺毛多酚氧化酶（图1）。SDS - PAGE 500酿酒桶erosum型毛确定弱银染带59000先生（图2）。免疫电泳（图2）显示，这个乐队交叉反应多克隆抗体对美国berthaultii先生59000聚苯醚。不过，染色强度相对数相同美国berthaultii毛表明，多酚氧化酶是目前在美国的毛在更低的浓度比在美国berthaultii。在等电聚焦凝胶印迹S型马铃薯毛状体，抗体染色带皮5.1，略酸性比美国berthaultii腺毛多酚氧化酶。又来了染色带从美国马铃薯是暗的比从美国berthaultii（17）和没有检出多酚氧化酶活动（图1，5）。底物特异性多酚氧化酶催化不同的反应，羟基化以邻二酚的monophenols（甲酚酶，酪氨酸酶，或而单加氧酶的活动欧共体1.14.18.1 ），和o-dihydroxyphenols到邻醌脱氢（邻苯二酚氧化酶或二酚氧氧化还原酶活性欧盟1.10.3.2 ）（20）。多酚氧化酶从各种来源可能拥有的邻苯二酚氧化酶和甲酚酶活性（15，23），只有甲酚酶活性（27，28），或只儿茶酚氧化酶活性18 24。在大多数情况下，只有儿茶酚氧化酶活性显然，甲酚酶活性可以由另外的还原剂或催化量的邻苯二酚为反应（5，14，26）。美国berthaultii腺毛多酚氧化酶催化氧化的一些o-diphenolic基板（表三）。在与预以往的研究（4），phenylpropenoids的首选子出。没有monohydroxylase（甲酚酶酪氨酸酶的活性；）探测，即使在实验中进行在场的1毫米的数码地面电视或当引物与一二酚（200，嗯儿茶酚）。漆酶（苯二酚氧化酶欧共体1.10.3.1 ）活性没有表现出这种酶。对流层单身，抑制多酚氧化酶（20），抑制多酚氧化酶活性达75%在浓度为0.2毫米。讨论酶是主要的蛋白质和氧化酵素美国berthaultii型毛。聚焦的单独收集毛（图1）清楚地表明，婆和婆活动是小组件型毛。聚苯醚构成了70%的总腺毛蛋白型腺毛美国berthaultii，相应的浓度为14毫克多酚蛋白/毫升防止酚类氧化之前腺毛破裂，酶必须内隔离腺毛，和浓度的多酚氧化酶在这一分现可显著提高。即使我们假设多酚氧化酶是不分割，其浓度在三方法200丁目，嗯。计算表明，在蛋白表达水平，显着的程度专业化这些器官在美国berthaultii。虽然专业化的腺毛代谢为高水平的生物合成或积累的一些器官特异性二是公认的（33），这是第一次个案，本专业已被确定的一个单一的蛋白质种类。破裂型毛状体在没有足够还原剂导致氧化形成巨大的交联酶聚集体与价值超过12 00000，以前称为，多酚氧化酶”（4）。当艾德精确的还原剂（地面）是用来在我们的准备工作，出现这些交联分子迷你后。滴定法测定多酚氧化酶提取缓冲液的增加浓度的还原剂（地面）逐步重新移动都多，高先生的形式从原油中提取，同时，乙方和聚焦的多酚氧化酶同工酶，清楚表明这些分子被氧化的文物（17）。制备电泳多酚氧化酶，使用高浓度的还原剂关键，因为氧化修饰蛋白具有改变植物价值。在这项研究中，多酚氧化酶的纯化型腺毛由berthaultii在一个步骤的制备电泳程序，以明显的同质性最小的共价修饰和有限的蛋白质。叶绿体中，多酚氧化酶45000先生是目前对甲基akoid膜在潜在的形式（10，12，21，30）。在体内，先生45000当前存在的活性氧化酶在衰老或受损的组织，和多酚氧化酶可以激活在孤立你lakoid制剂添加洗涤剂，碱，和蛋白酶，即条件模仿衰老或损伤质体膜（19 - 21，31，32）。膜协会与延迟。虽然交叉反应45000先生多酚氧化酶的anti-trichome多酚氧化酶（59000）抗体表明，一些抗原位点是保守的是吐温这些酶，多酚氧化酶是不membrane-asso腺毛相关和不显示延迟，完全主动释放从毛（17）。虽然45000先生马铃薯叶和块茎当前的十字架反应anti-trichome多酚氧化酶抗体，腺毛多酚氧化酶大大不同于美国马铃薯块茎中的多酚氧化酶底物特异性。而多酚氧化酶显示一个严格的腺毛特异性氧化o-dihydroxyphenylpropenoids，该45000米，块茎多酚氧化酶显示大量的甲酚酶活性没有启动，利用p -香豆酸，对甲酚，酪氨酸，和香豆酸（3，23）。在其底物特异性而