生物工业下游技术——PPT后问题.doc

以下内容全部出自12章PPT课件（共14章课件，除第十章蛋白质、多肽、抗体药物和细胞产品和最后一章糖尿病的没有课后问题）事先声明，这一份并不是什么重点，仅仅是课后问题的解答；希望对大家有帮助；1. 什么是生物工业下游技术？一般工艺过程？特点？生物工业下游技术：对于由生物界自然产生的或由微生物菌体发酵的、动植物细胞组织培养的、酶反应等各 种生物工业生产过程获得的生物原料，经提取分离、加工并精制目的成分，最终使其成为产品的技术； 一般工业流程： 特点：1.四个原则：时间短；温度低；pH适中（选择在生物物质的温度范围内） ；严格清洗 消毒（包括厂房、设备及管路） 2.重要的独立技术体系：个体化工程过程，国家计划； 3.占成本费用的大部分： 传统发酵工业中下游部分的费用占整个工厂投资费用的， 而对重组生 产蛋白质等基因工程产品，下游加工的费用可占整个生产费用的；2. 主要技术的原理、适用范围、主要步骤、注意事项和应用实例？3. 名词解释：沉降速度、澄清指数、相对离心力、密度梯度离心沉降速度（ sedimentation velocity）： 在强大离心力作用下,单位时间内物质运动的距离。 当p m，则S0，粒子顺着离心方向沉降。 当p m，则S0，粒子到达某一位置后达到平衡。 当Pm，则S0，粒子逆着离心方向上浮澄清指数（K系数k factor）：描述在一个转子中，将粒子沉降下来的效率，即溶液恢复成澄清程度的一个指数；K系数越小，则越容易，也愈快将颗粒沉降（如已知粒子S为80S，转子的K系数是323，那么预计T（沉降时间）k/S4h）；相对离心力（RCF, relative centrifugal force）： 实际离心加速度转化为重力加速度的倍数， “ x g ”。 只要RCF值不变，一个样品在不同的离心机上获得相同的结果。密度梯度离心：又称区带离心（rate zonal centrifugation）包括差速区带离心（rate zonal centrifugation）和平衡区带离心（isopychic）:等密度离心；差速离心最常用； 原理：利用不同粒子在离心场中的沉降速度的不同，通过不断增加相对离心力，使 一个非均匀混合液内不同大小性状的离子分步沉淀。 方法：离心后倾倒上清液与沉淀分开。 缺点：分辨率不高。 适用：粗制品的提取。差速区带离心（rate zonal centrifugation）： 原理：各组分由于沉降系数的差异产生与组分对应的区带。 方法：先装入密度梯度介质，待分离样品铺在梯度液的顶部。 常用介质：蔗糖 适用：不完全沉降，应用在物质大小相异而密度相同的情况。 缺点：严格控制离心时间。离心时间过长，所有的样品可全部到达离心管底部； 离心时间不足，样品分离不完全。平衡区带离心(等密度梯度离心)： 原理：依赖于样品颗粒的不同密度来进行分离。 方法：离心前预先配制介质的密度梯度，也可依靠离心力来形成梯度，样品可铺在 梯度液之上、之下或混在一起。 常用介质：CsCl 适用：蛋白质、核酸等大分子物质的分离。 缺点：处理量小、限实验室规模。4. 过滤与分离技术的比较？过滤分离原理依据过滤介质的孔隙大小进行分离在离心产生的力场作用下，加快颗粒的沉降特点大颗粒固体分离，操作简单，适工业应用颗粒小，热稳定性差物质回收，实验室适用缺点速度慢，分离效果差异大，劳动强度大操作成本高，产量小，效率低应用丝状菌（霉菌、放线菌）等110um单细胞的细菌、酵母菌5. 离心机的分类？按作用原理分：沉降式、过滤式离心机按分离目的（功能）分：制备型、分析型离心机按转速分：常速（低速）、高速、超速离心机按操作方式分：间歇式(分批)、连续式离心机按设备结构特点分: 管式、蝶式、螺旋式(倾析式)6. 简述分离人外周血单个核细胞的方法和过程？聚蔗糖-泛影葡胺（Ficoll-Urografin）密度梯度离心法分离外周血单个核细胞(PBMC)目的：测定细胞免疫功能。方法：首先要从人或动物外周血中获取有活性的细胞，如淋巴细胞、巨噬细胞、粒细胞原理：利用密度梯度介质-聚蔗糖-泛影葡胺（淋巴细胞分离液），相对密度 1.0770.001。过程：1.在离心管中加入适量的淋巴细胞分离液（Ficoll），取肝素抗凝采血与等量的 RPMI1640充分混匀，用滴管沿管壁缓慢叠加于分层液面上，注意保持清楚地 界面； 2.2000rpm水平离心20min，离心后管内分三层，上层为血浆和RPMI1640液； 下层主要为红细胞和粒细胞；中层为淋巴细胞分离液；在上，中界面处有一个 以单个核细胞为主的白色云雾层； 3.用毛细管插到云雾层吸取单个核细胞，至于新的离心管中，加入5倍以上体积 的RPMI1640，1500rpm离心10min，洗涤两次； 4.末次离心后，弃上清，加入含10%小牛血清的RPMI1640，重悬细胞； 5.取10ul的细胞与10ul的0.2%的台盼蓝混合，于血球计数板上，计数后得细胞 浓度； 细胞浓度= 台盼蓝染色：死细胞染成蓝色，活细胞不着色呈透明； 分离PBMC： 90%以上纯度，80%90%得率，活细胞比率可达95%7. 蛋白质表面的特性极性（亲水性）和非极性（疏水性）：8. 蛋白质沉淀的主要方法 盐析法： 有机溶剂沉淀法：9. 盐析的原理及影响因素 蛋白质在高离子强度的溶液中溶解度降低、发生沉淀的现象称为盐析 原理： 影响因素： 1.无机盐种类：(NH4)2SO4 阴离子盐析作用顺序：柠檬酸盐PO43SO42CH3COOClNO3SCN 阳离子盐析作用顺序（一价）：NH4+K+Na 2.温度：一般规律是：温度越低越不容易形成沉淀 在高离子强度溶液中，升高温度有利于蛋白质的失水，使之溶解度下降。 在低离子强度溶液或纯水中，蛋白质的溶解度在一定温度范围内一般随温度升 高而增大。 3.pH值：在接近蛋白质等电点的溶液中进行盐析有利于蛋白质的沉淀； （高盐溶液中蛋白质的等电点会发生偏移） 4.盐浓度：一般而言，中性盐浓度越高，越容易发生沉淀；10. 有机溶剂沉淀原理及影响因素 原理：1.向溶液中加入有机溶剂能降低溶液的介电常数，减小溶剂的极性，从而削弱了 溶剂分子与蛋白质分子间的相互作用力，增加了蛋白质分子间的相互作用，导致 蛋白质溶解度降低而沉淀。 2.由于使用的有机溶剂与水互溶，它们在溶解于水的同时从蛋白质分子周围的水 化层中夺走了水分子，破坏了蛋白质分子的水膜，因而发生沉淀作用 3.破坏蛋白的氢键； 影响因素： 1.有机溶剂的选择：（乙醇、丙酮、异丙醇、氯仿等） 2.温度的控制：（一般要求在低温下进行，要考虑有机溶剂与水混合时的放热现象） 3. pH值：（在等电点附近，注意目的药物的稳定性） 4.离子强度：（盐析沉淀后，如需再用有机溶剂沉淀法纯化，一定要先透析除盐）11. 膜分离的基本原理利用膜的选择性（孔径大小），以膜的两侧存在的能量差作为推动力，由于溶液中各组分透过膜的迁移率不同而实现分离的一种技术；12. 何谓膜过滤（膜分离技术）？膜通常是由什么材料制成？利用膜的选择性（孔径大小），以膜的两侧存在的能量差作为推动力，由于溶液中各组分透过膜的迁移率不同而实现分离的一种技术；膜材料： 1.有机高分子膜：纤维素酯类（葡萄糖基通过1, 4糖甙链连接起来）； 非纤维素酯类：聚砜、聚酰胺、芳香杂环聚合物和离子聚合物等 2.无机膜：多以金属及其氧化物、多孔玻璃、陶瓷为材料；13. 压力差为推动力的膜分离技术主要有哪些？ 微滤（MF）：孔径分布范围在0.025 14m之间；液体或气体的悬浮颗粒超滤（UF）：孔径为0.001 0.02m；大分子有机物 纳滤（NF）：孔径分布在平均2nm；糖类等小分子有机物，二价盐或多价盐反渗透（RO）：孔径范围在0.00010.001nm之间；单价盐（渗析是浓度差，电渗析是电位差作为推动力；） 14. 浓差极化与错流过滤浓差极化：在膜分离过程中，一部分溶质被截留，在膜表面及靠近膜表面区域的浓度越 来越高，造成从膜表面到本体溶液之间产生浓度梯度； 错流过滤：悬浮液流动方向与过滤介质平行； （可以带走留在过滤膜上的滞留物，避免浓差极化，减轻污染；）15. 细胞破碎方法的分类？ 机械法：固体剪切作用：珠磨法；压榨法； 液体剪切作用：高压匀浆法；超声破碎法； 非机械法：干燥处理 溶胞作用：物理法（渗透压冲击法；冷冻-融化法）； 化学法（碱处理；酸热法；化学渗透法）； 生物法：（溶酶法；自溶） 超临界 珠磨法常用方法： 原理：细胞悬浮液与研磨剂（极细的玻璃小珠、石英砂、氧化铝（d球菌） 实验室操作； 不适用：酵母菌效果差, 不适用于大规模操作。 干燥法： 原理：使细胞结合水分丧失，改变细胞的渗透性。当用丙酮、丁醇或缓冲液等对 干燥细胞进行处理，胞内物质就容易被抽提出来； 适用：气流干燥适用于酵母菌，25-30的气流； 真空干燥多用于细菌； 冷冻干燥适用于不稳定的生化物质。 缺点：易造成蛋白变性； 渗透压冲击法最温和： 原理:：细胞置于高渗介质中（甘油、蔗糖），当平衡后，介质骤然被稀释或将细 胞转入低渗缓冲液，胞外的水迅速渗入胞内，引起细胞快速膨胀而破裂； 优点：选择性高，工艺简单，易放大。 缺点：高盐引发样品污染。 冷冻-融化法： 原理:：细胞反复冷冻（-10-30）和融化多次，由于突然冷冻使胞内形成冰晶， 细胞膜的疏水键结构破裂，增加其亲水性和通透性，同时胞内外产生浓度 差，引起细胞膨胀而破裂。 碱处理主要用于两性物质（蛋白质）： 原理：碱（pH 11.512.5）加入细胞悬浮液中，与细胞壁进行多种反应，包括磷 脂皂化，使细胞壁的成分溶于表面活性剂，释放内溶物； 酸热法： 原理：利用HCl对细胞壁中的某些成分（多糖和蛋白质）的水解作用，使原来 结构紧密的细胞壁变得疏松，同时经沸水浴处理，造成细胞膨胀并加速水 解，破坏细胞壁； 化学渗透法： 原理：利用化学或生化试剂改变细胞壁或细胞膜的结构，增大胞内物质的溶解速 率或完全溶解细胞壁，形成原生质体后，在渗透压作用下，使细胞膜破裂 而释放胞内物质； 螯合剂EDTA（乙二胺四乙酸）： G-菌的外层膜通常靠Ca2+或Mg2+结合脂多糖和蛋白质来维持，一旦EDTA 将Ca2+或Mg2+螯合，大量的脂多糖分子将脱落，使细胞壁外层膜出现洞穴 有机溶剂法： 能分解细胞壁中的类脂，使细胞膜表面发生变化，胞内产物选择性释放出来； 表面活性剂（SDS、CTAB（十六烷基三乙基溴化铵）和Triton-X）： 两性化合物分子中有一个亲水基团和一个疏水基团，在适当的pH值和离子 强度下，他们聚集在一起形成微胶束，使膜的通透性改变或使之溶解； 变性剂（盐酸胍；尿素）： 变性剂与水中氢键作用，削弱溶质分子间的疏水作用，从而使疏水性化合物 溶于水溶液 酶溶法研究较广： 原理：利用酶反应分解、破坏细胞壁上特殊的化学键。 自溶酶溶另一种方式：通过调节温度、pH值或添加有机溶剂等激活剂，诱使细 胞产生溶解自身酶的方法。 超临界细胞破碎技术： 原理：温度和压力的微小变化可引起溶质溶解度的急剧变化 16. 超临界流体的特性及超临界破碎。 超临界流体：指温度和压力处于临界条件之上的流体；如CO2, N2O。 特性：受压力和温度的影响很大 具有类似于气体的性质，如低黏度； 具有类似于液体的高密度、流动性能、传质性能和溶解性能； 超临界破碎： 原理：温度和压力的微小变化可引起溶质溶解度的急剧变化。 优点：条件较温和； 有利于分布在细胞膜附近的目标产物的高活力释放。 适用于各类细胞的破碎。 缺点：防止因升温而引起的失活。 17. 选择结合两种或两种以上破碎方法，对原核细胞表达的重组蛋白进行细胞破碎。18. 名词：色谱、保留时间/体积、死时间/体积、相对保留时间/体积色谱(chromatography)：一类分离技术的总称，是依据组分在两相（固定相和流动相） 间的溶解、吸附、分配、离子交换或其他亲和作用的差异为依据 而建立起来的各种分离分析方法；保留时间 (retention time)tR：从进样至特定成分以峰的形式出现在二维图上经历的时 间; 保留体积(retention volume)VR：从进样至特定成分以峰的形式出现在二维图上这段时间 里流动相通过的体积;死时间(dead time)T0：不被固定相滞留的组分，从进样至出现浓度最大值时所需的时间死体积(dead volume)V0：不被固定相滞留的组分，从进样至出现浓度最大值时流动相通 过的体积称为死体积，（柱中流动相的体积）相对保留时间：扣除死时间后的保留时间。tR = tR t0相对保留体积：扣除死体积后的保留体积。VR = VR V019. 塔板理论色谱柱比作蒸馏塔；连续的色谱柱设想成由许多小段组成；简单地认为：在每一块塔板上，溶质在两相间很快达到分配平衡，然后随着流动相按一 个一个塔板的方式向前移动； 所以n=L/H n与半峰宽及峰底宽的关系式为：分离度(resolution)R：:相邻两色谱峰保留值之差与两组分色谱峰底宽度平均值之比；20. Van deemter 方程 H = A + B / u + C u u为流动相的线速度；A、B、C、为常数，分别代表涡流扩散项系数、分子扩散项系 数、传质阻力项系数； A 项 + B 项 + C项 在低线速（0u最佳之间）时： u越小，B/u项越大，Cu项越小。此时，Cu项可以 忽略，B/u项起主导作用，u增加，H降低，柱效高； 在高线速时（uu最佳）：u越大，Cu项越大，B/u项越小，Cu项起主导作用。u增 加，H增加，柱效降低；21. 概念：内水体积、外水体积、洗脱体积、等外水体积（Vo）：是指凝胶柱中凝胶颗粒周围空间的体积。内水体积（Vi）：是指凝胶颗粒中孔穴的体积。支持物体积（Vs）：是凝胶骨架所占体积柱的总体积为（Vt）：包括填料的骨架体积Vs，填料的孔体积Vi (内水体积)以及填料颗 粒之间的体积V0（外水体积）。 Vt=Vi+V0+Vs洗脱体积（Ve）：是指将样品中某一组分洗脱下来所需洗脱液的体积。它包括自加入样 品时算起，到组分最大浓度出现时所流出的体积“全排阻”：最先流出物质A，A分子量最大，完全不能进入颗粒内部，只能从颗粒间 隙流过， 其流经体积等于外水体积Ve= V0“全渗入”：最后流出物质C，它分子量最小，其分子可以自由进出凝胶颗粒， 流经体 积是外水体积与内水体积之和Ve= V0+Vi“部分排阻”或“部分渗入”：物质B，分子量介于渗入限与排阻限之间，其分子能够 部分地进入凝胶颗粒中。 流径体积Ve是全部外水体积加上内水体积的一 部分，即Ve=V0+KdVi；分配系数Kd 与溶质分子量M的对数相关。不依赖柱变化的参数；22. 排阻色谱的分离原理 凝胶内具有一定大小的孔穴，体积大的分子不能渗透到孔穴中去而被排阻，较早地被 淋洗出来；中等体积的分子部分渗透；小分子可完全渗透入内，最后洗出色谱柱。这 样，样品分子基本上按其分子大小，排阻先后由柱中流出。23. 排阻色谱的应用 1.脱盐： 高分子（如蛋白质、核酸、多糖等）溶液中的低分子量杂质，可以用凝胶层析法除 去，这一操作称为脱盐。本法脱盐操作简便、快速、蛋白质和酶类等在脱盐过程中不 易变性。适用的凝胶为SephadexG-10、15、25。柱长与直径之比为5-15，样品体积 可达柱床体积的25-30。2.用于分离提纯： 凝胶层析法已广泛用于酶、蛋白质、氨基酸、多糖、激素、生物碱等物质的分离提纯；3. 测定分子物质的分子量：标准曲线法 用一系列已知分子量的标准品放入同一凝胶柱内，在同一条件下层析，记录每一成分 的洗脱体积，并以洗脱体积对分子量的对数作图，在一定分子量范围内可得一直线， 即分子量的标准曲线。测定未知物质的分子量时，可将此样品加在测定了标准曲线的 凝胶柱内洗脱后，根据物质的洗脱体积，在标准曲线上查出它的分子量；4. 高分子溶液的浓缩： 通常将SephadexG-25或50干胶投入到稀的高分子溶液中，这时水分和低分子量的 物质就会进入凝胶粒子内部的孔隙中，而高分子物质则排阻在凝胶颗粒之外，再经 离心或过滤，将溶胀的凝胶分离出去，就得到了浓缩的高分子溶液；24. 离子交换层析概念，原理？离子交换层析（Ion Exchange Chromatography简称为IEC）： 是以离子交换剂为固定相，依据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可 逆交换时的结合力大小的差别,而进行分离的一种层析方法；原理：1.同类型的带点离子间可以自由的相互交换和竞争结合； 2.带相同电荷类型的离子会竞争性的结合与其电荷相反的色谱填料离子交换 剂。（吸附） 3.离子间的作用力可通过调节缓冲液的酸碱度和离子强度而改变，从而将与离子 键不同程度结合的蛋白按一定顺序洗脱下来。（洗脱）25. 离子交换剂的选择电荷基团的选择：被分离的物质带正电，则选择阳离子交换剂；带负电，则选择阴离子 交换剂（被分离物质带什么电，则用什么离子交换剂）；电荷基团强弱的选择：1.强酸或强碱型离子交换剂适用的pH范围广，常用于分离一些 小分子物质或在极端pH下的分离； 2.弱酸型或弱碱型离子交换剂不易使蛋白质失活，故一般分离蛋 白质等大分子物质常用弱酸型或弱碱型离子交换剂；基质的选择：1.疏水性较强的离子交换剂(聚苯乙烯)，一般常用于分离小分子物质，如 无机离子、氨基酸、核苷酸等； 2.亲水性较强（纤维素、葡聚糖、琼脂糖），适合于分离蛋白质等大分子 物质；颗粒大小：一般呈球形，颗粒的大小通常以目数（mesh）或者颗粒直径（mm）来表示， 目数越大表示直径越小； 1.大颗粒的离子交换剂-对分辨率要求不高的大规模制备性分离； 2.小颗粒的离子交换剂-需要高分辨率的分析或分离；26. 缓冲液的离子强度和pH的选择缓冲成分选择：1.阴离子交换剂要用阳离子缓冲液（如Tris、吡啶、咪唑、铵、乙二胺、 烷基胺、氨基乙醇等缓冲液） 2.阳离子交换剂则用阴离子缓冲液（如醋酸、柠檬酸、甘氨酸、磷酸以 及巴比妥等缓冲液）离子强度选择：1.离子强度低时，竞争结合能力弱，蛋白质与交换剂的结合较强； 2.增加离子强度则增加竞争作用，降低了交换剂与靶蛋白质的结合能 力，结果将蛋白质从交换剂上洗脱；pH选择：pH=pI (0)；pHpI(-)；平衡缓冲液的离子强度和pH的选择： 平衡缓冲液是指装柱后及上样后用于平衡离子交换柱的缓冲液； 首先要保证各个待分离物质如蛋白质的稳定； 最佳的选择要平衡选择性和结合容量；（pH远离 pI：结合容量高 ；选择性差）洗脱缓冲液的离子强度和pH的选择要求： 1.所有待分离组分都是稳定的。 2.使结合在离子交换剂上的所有待分离组分在洗脱液梯度范围内都能够洗脱下来。 3.在离子交换层析中一般常用梯度洗脱；27. 何谓双水相萃取?常见的双水相构成体系有哪些？ 双水相萃取：当两种聚合物或是一种聚合物与一种盐溶于同一溶剂，由于聚合物之间 或聚合物与盐之间的分子空间阻碍作用，无法相互渗透，当聚合物或无 机盐浓度达到一定值时，就会分成互不相溶的两相，形成双水相；当物 质进入双水相体系之后，由于表面性质，电荷作用，以及各种力，如疏 水键，离子键氢键等的作用和溶液环境影响，使其在上下相中的浓度不 同，即各成分在两相间的选择性分配，从而达到萃取的目的； 常见体系：聚乙二醇（PEG）/葡聚糖（Dx）体系、聚乙二醇/盐（磷酸钾）体系；28. 简述影响双水相萃取分配平衡的因素及其特点。分配系数：表示为平衡状态下上相与下相中溶质浓度之比，即 影响蛋白质k的综合因素： 1.成相聚合物浓度和分子量； 分子量(Mr)：Mr减小，蛋白易于分配于富含该聚合物的相中； 浓度：总浓度越高。蛋白质越容易分配于其中的某一相； 2.盐的种类和浓度(成相盐）； 种类：主要通过影响相间电位和蛋白疏水性来影响分配系数； 浓度：当盐的浓度很大时, 由于强烈的盐析，pro溶解度很大，表观分配系数增大， 此时k与pro浓度有关； 3.pH值： pH值影响蛋白的解离度，改变表面电荷数； 影响系统中缓冲物质的解离程度，影响相间电位差； 4.温度： 温度影响小 成相聚合物PEG对蛋白质有稳定作用,常温下蛋白质不会发生变性； 5.细胞： 细胞破碎的程度以及细胞壁和细胞膜不同的化学结构； 29. 什么是正胶团和反胶团？反胶团制备常用的方法？ 正胶团：表面活性剂分子在极性溶剂中 亲水性（Hydrophilic）极性头朝外 疏水性（hydrophobic）非极性尾朝内 中间形成非极性的“核”； 反胶团：表面活性剂分子在非极性溶剂中 亲水极性头朝内 疏水非极性尾朝内 含有水分子内核的聚集体。 微水相或“水池”(water pool)：反胶束内溶解的水 反胶团制备：相转移法 注射法最常用方法 溶解法30. 简述反胶团萃取的基本原理及其制备常用方法。原理：在有机相和水相两宏观相界的表面活性剂，与蛋白分子之间的静电吸引而变性， 形成含有pro的反胶团，扩散到有机相中；反胶团制备：相转移法 注射法最常用方法 溶解法31. 何谓超临界流体萃取？其特点有哪些？超临界流体萃取（SFE）： 1.利用超临界流体在临界点附近某一区域与待分离混合物的溶质具有异常相平衡 的行为和传递性能； 2.对溶质溶解能力随压力和温度改变而在相当宽的范围内变动这一特性而达到分 离的一项技术； 最常见的超临界流体：CO2 临界温度：31.06；临界压力：738Mpa；临界密度：468 kg/m3；特点： 1.常温的条件下操作，能耗低，适于热敏性物质和易氧化物质的分离。 2.高压、密闭、惰性环境中，选择性萃取分离天然产物。 3.工艺简单，效率高无污染。 32. AC的原理亲和层析（AC）：是利用生物大分子所具有的专一亲和力或特异的相互作用而设计的纯 化技术；AC原理：通过将具有亲和力的两个分子中一个固定在不溶性基质上，利用分子间亲和 力的特异性和可逆性，对另一个分子进行分离纯化；33. 亲和配基具备的条件 具备条件：1.与被分离大分子间专一、可逆结合 2.结合常数大小适当； 3.能够进行一定的化学改造（便于固定于介质上）；34. 影响KL的因素 KL为平衡解偶联常数：L为游离配体浓度；E为游离靶分子浓度； EL为配体与靶分子复合物浓度；影响因素：pH；温度；离子强度；其它参数；35. AC竞争性洗脱中，KLComp 与KL 的关系 KLComp自由竞争配基平衡解离常数 ； C 自由竞争配基浓度； T 自由目的蛋白浓度； CT 竞争配基/目的蛋白复合体的浓度； 关系： 是竞争性液体与胶体积比，一般为1-10 KL 是偶合配基的解离常数 KLComp 是自由竞争配基的解离常数 Co 是竞争性配基的浓度，通常为10-2 - 10-1 M Lo 是偶合配基的浓度, 通常为10-4 - 10-2 M36. AC洗脱策略1.pH洗脱： 改变配体或靶蛋白荷电基团的离子化状况； 直接影响结合位点降低亲和性 改变构象间接改变亲和性2. 离子强度洗脱： 温和 线性、阶段式洗脱 酶的洗脱 1M NaCl3. 竞争性洗脱： 竞争剂的浓度与偶联的配体浓度相当； 高成本； 对洗脱下来复合物的分解；4. 促溶性洗脱： 打断蛋白质的三级结构； 促溶性盐破坏离子键、氢键； 使蛋白变性； 盐酸胍、脲； 注意事项： 1.如果抗原不能用简单的条件洗脱，更换抗体可能比试用各种条件要容易些。 2.试用梯度洗脱方法，使抗原的洗脱峰清晰而陡峭 3.避免使用二硫苏糖醇和其他还原剂，因其能破坏抗体重链和轻链间的链间二硫键；37. 概念：亲和膜分离技术，亲和双水相萃取，亲和沉淀分离技术，分子印迹分离技术；亲和膜分离技术：将亲和分离技术和膜分离技术结合，它将亲和配基结合在分离膜上， 利用膜作为基质，对膜进行改性，再按照吸附、清洗、洗脱和再生的 顺序，对生物产品进行分离纯化；亲和双水相萃取：该技术对成相聚合物进行修饰，即将亲和配基通过化学交联或分配的 方法结合到成相聚合物上，有选择性地将某种蛋白萃入该相中，而杂 蛋白仍旧留在另一相中；亲和沉淀分离技术：将生物专一性识别与沉淀分离相结合的分离纯化技术。亲和配基在 溶液中和目标分子专一性结合后，在一定条件下形成可逆性沉淀， 从而将目标分子沉淀形成固相分离出来。 包括一次作用亲和沉淀和二次作用亲和沉淀；分子印迹分离技术：运用分子印迹技术获得在空间结构和结合位点上与目标分子完全 匹配的聚合物，再用制备的聚合物与溶液中目标分子相结合，而后 通过交联剂将目标分子与聚合物形成的复合物固定下来，服从溶液 中分离出来，最后将目标产物脱去；38. 简述亲和膜的制备过程1. 膜材料的选择： 特性：惰性；亲水性；物理、化学性质稳定，同时机械稳定性好；多孔性，内外表 面积大；具有足够多可利用的化学基团；非特异性吸附低； 常用的亲和膜介质材料：脂肪族烃类（聚乙烯、聚丙烯等）， 芳香族共聚物（聚碳酸脂、聚砜等）， 脂肪族聚酰胺（尼龙6、尼龙66）2. 亲和配基的选择： 亲和配基：分生物特异性配基和通用性配基 特异性配基：只与其对应的分子特异性结合 抗原-单克隆抗体； 荷尔蒙受体蛋白 核酸互补碱基链段、核酸结合蛋白； 酶底物、产物、抑制剂 通用性配基：与某一类物质结合 酶辅酶； 凝集素糖、糖蛋白、细胞、细胞表面受体 酶、蛋白质-活性色素（染料） 酶、蛋白质-过渡金属离子（铜、锌等）3. 间隔臂的建立：（不用一定需要） 当配基分子量较小时，为了排除空间位阻作用，需要在配基和载体之间连接一个“间 隔臂” 间隔臂：具有一定长度（太长会导致配基与目标分子的亲和力减弱）、自身不带电荷、 疏水性不能太强，不带附加的活性中心； 常用的间隔臂：含2个活泼氨基的二胺类化合物（乙二胺、丙二胺、己二胺等）4. 膜材料的改性： 膜材料必须改性后才可用于亲和膜的分离； 目的：增加亲水性、生物相容性，降低非特异性吸附； 方法：羟基活化法、化学修饰法；39. 简述二次作用亲和沉淀的机理1.利用在物理场改变时溶解度下降，发生可逆性沉淀的水溶性聚合物为载体固定亲和配 基，制备亲和沉淀介质。 2.亲和介质结合目标分子后，通过改变物理场使介质与目标分子共同沉淀，分离沉淀。 3.溶解带有目标蛋白的沉淀聚合物，聚合物再沉淀，分离目标蛋白。40. 一次作用亲和沉淀原理 1.水溶性化合物偶联多个配基，蛋白质表面含有两个以上亲和结合位点； 2.化合物与蛋白质因亲和作用产生亲和交联； 3.交联形成的交联网络因分子量较大而沉淀；41.简述分子印迹技术的机理与方法1.功能单体和烙印分子在一定条件下形成某种可逆的复合物； 2.加入交联剂将这种复合物“冻结”起来,制得高聚物；3.将烙印分子抽提出来,这样在聚合物的骨架上便留下了一个对烙印分子有选择性的分 子识别位；42. 简述凝胶电泳、等电聚焦、双向电泳、毛细管电泳的原理及特点； 电泳分离技术：在电场的作用下，由于待分离样品中各种分子带电性质以及分子本身大 小、形状等性质的差异，使带电分子产生不同的迁移速度，从而对样品 进行分离、鉴定或提纯的技术。凝胶电泳：主要介质是琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶； 琼脂糖凝胶特点： 优点：1.因不含硫酸根和羧基，几乎消除了琼脂的电渗 2.对蛋白质吸附极微，故无拖尾现象。 3.凝胶结构均匀，孔径较大，可用来分离酶的复合物、核酸、病毒 等大 分子物质。 4.透明度较好，可直接或干燥成薄膜后进行染色。 5.不吸收紫外光，可直接利用紫外光吸收法作定量测定 6.有热可逆性 缺点：1.机械强度差，易破碎，浓度不能太低。 2.易被细菌污染，不易保存，临用前配制。 3.琼脂糖支持层上的区带易于扩散，电泳后必须立即固定染色。 4.与PAGE相比，分子筛作用小，区带少。 应用：1. 适用于大分子的核酸、核蛋白等的分离、鉴定及纯化 2. 临床生化检验中常用于LDH、CK等同工酶的分离与检测 3. 为不同类型的高脂蛋白血症、冠心病等提供生化指标； 常规聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）： 原理：由于PAGE是多孔介质，不仅能防止对流，把扩散减少到最低；而且其 孔径大小与生物大分子具有相似的数量级，能主动参与生物分子的分 离，具有分子筛效应； 特点：1.pH应在310之间，并且保证蛋白质的溶解性能、稳定性以及生物活性； 2.缓冲液的离子强度为0.010.1 mol/L之间； 3.凝胶浓度：太大，则孔径过小，样品不能进入，滞留在上样处； 太小，则孔径过大，各蛋白分子均进入，分离效果差； 4.染色方法：考马斯亮蓝染色：检测灵敏度：0.20.5ug 银染色法：检测灵敏度：0.38ng； 优点：可以在天然状态分离生物大分子； 可分析蛋白质和别的生物分子的混合物； 电泳分离后仍然保持生物活性； SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳（十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳）： 原理：在样品和凝胶中加入SDS和还原剂后，蛋白质分子被解聚为组成它们的 多肽链，解聚后的氨基酸侧链与SDS结合后，形成带负电的蛋白质-SDS 胶束，所带电荷远远超过了蛋白质原有的电荷量，消除了不同分子间的电 荷差异；同时，蛋白质-SDS聚合体的形状也基本相同，这就消除了在电 泳过程中分子形状对迁移率的影响； 特点：设备简单、操作简便、测定快速、重复性高、样品无需纯化； 运用：测定蛋白质亚基分子量以及未知蛋白质分子量的测定；等电聚焦（IEF）： 原理：利用蛋白质的等电点不同，在一个稳定、连续、线性的PH梯度中进行蛋白质 分离，并根据蛋白质的位置来测定蛋白质的等电点的技术； 关键：pH梯度的建立 特点：优点：分辨率高；很稀的样品都可分离，且重现性好； 可用于测定蛋白质或多肽的等电点； 缺点：1.要求使用无盐溶液，而某些蛋白质在无盐溶液中溶解度低，可能产生 沉淀； 2.样品中各组分都聚焦到其等电点，对一些在等电点不溶解或发生变性 的蛋白质不适用； 运用：由于其分辨率可达0.01pH单位， 因此特别适合于分离分子量相近而等电点不同的蛋白质组分；双向电泳： 原理：双向PAGE，是在平板凝胶上由两个单向PAGE组合而成。在第一向电泳后， 再在与第一向垂直的方向上进行分离原理不同的第二向电泳； 例如：IEF/SDS-PA