冠心Ⅱ号方含药血清对心肌细胞缺血再灌注样损伤的比较.pdf

中药药理与临床2 佣7 23 4 冠心n 号方含药血清对心肌细胞缺血再灌注样损伤的比较药效学研究 束 云 李贻奎 李 中国中医科学院 西苑医院 彭 李连达 北京1 0 以 9 1 摘妥目的 比 较汤剂 徽未制别 有效成分重组复方三种冠心11 号方制刑的 含药 血清对体外培养心肌细胞缺血再灌注样 领伤的 影响 为临 床使用和药 物二次开 发提供依据 方法 大夙分别灌胃 给予合生药别15 吨的冠心n 号方汤剂 徽米制 j或有 效成分 重组复方 1 次 沙日 连续5日 末 次给药 后卯Imn 采血制备含药 血清 采用M 法观察含药血清对体外培养大风正常心肌细 胞活 性及生长情况的影响 并 检浏其对缺孰一 复氧模型或过氧化氮损伤心肌细胞培养上清乳酸脱氮酶 LDH 活性 肌酸激醉 C K 活性 丙 二醛 M D A 含童 细 胞胞蒙超氧化物峡化酶 S O D 活性的影响 结果 三种冠心11 号方的含药血清对体外培养大双正常 心肌细 胞活性及生长无显著影响 而三者均能显著减轻由 缺乳一 复氧或过氧化氮造成的心肌细胞培养上清中L D H及M D A含童增 高的变 化 对细胞胞装S O D 活性降低有明显的保护作用 并可降低培养上清中C K活性 但三者比校未观察到显著性差异 结论 不同 冠心n 号方的含药血清对体外培养 心肌细胞缺血再灌注样损伤均有明显的保护作用 但三者作用差异不显著 关健词冠心n号方 李药血清 心肌细危 体外培养 缺血再灌注杨枯 中 药药用形式的拓展是中医药技术发展和中药现代化的 重要组成部分 汤剂 饮片颗粒 微粉制剂 单味饮片提取物及 其重组复方等各类药剂的出现大大提高了临床应用中的可选 择性和 灵活度 然而有研究表明 相同的中药处方 由于生产工 艺 配制 剂型 药用形式的不同 服用后产生的药效 持续时间 作用 特 点 都可能 出 现较大的 差异 一 引 目 前 方剂的 药用形式 仍缺乏统一的选用标准 导致临床用药具有一定的不确定性 给医 患双方都带来了困难 冠心n号方是根据活血化安原理 由中国中医科学院西苑 医院等单位研制的方剂 由 丹参 红花 降香 川芍 赤芍五味中 药组成 具有活血化癖 理气止痛功能 主治 胸痹11 适用于冠 心病 心绞痛 心肌梗塞等 其疗效确实可靠 已有数十年的临 床应 用 史 阁 本 研究以 冠 心n 号方 为 研 究对象 通 过 含药血 清 对体外培 养心肌细胞缺血再灌注样损伤的影响 对比汤剂 微 米制剂 有效成分重组复方三种药用形式的作用差异 以期为 该药物的临床使用和二次开发提供依据 并为类似研究提供思 路参考n 1 材料与方法 1 1 试验药物冠心 n号汤剂 冠心n号微米制剂 冠心n 号各单味药 丹参 赤芍 红花 川芍 降香 有效成分由中国中 医科学院中药研究所提供 批号 2 仪 沁 朋伪 常温密封保存 有 效成分重组复方 依据全方比 例以单味药有效成分重新组合得 到 各受 试物有效成分含量见 表1 表1 冠心11 号方不同药用形式有效成分含母 m 盯 生药 黑 丹阶酸日 丹参酮 人 总 助酸 阿魏触 芍 药莎径 蕊红花陇 色盆 总挥发油 徽米制荆 有效成分宜组复方 67 日0 0 534 7 1 4洲0 41 0故 1 4 4 吕0 月 35吕 9 0 7 8心 卜 0 1 2 当3 62 1 2 动 物S D 大鼠1 一 2日 龄 雌雄不拘 25 只 雄性 2 00 土 209 抢只 均由 北京维通利华实验动物技术有限公司提供 动 物许可证编号 SCX K 京 2 的2 一 自 X 3 1 3 试剂 胰蛋白 酶 n 型胶原酶 M Tr A rne 生产 p M 5 0 北京精细化工厂生产 D M E M Gi悦0 生产 类标准胎牛血 清 天津TBD 公司生产 L D H检测试剂盒 北京北控生物科技 有限公司生产 肌酸激酶c K检测试剂盒 丙二醛M D A检测试 剂盒 超氧化物岐化酶soD检测试剂盒 考马斯亮兰蛋白定量 试剂盒 南京建成生物工程研究所生产 1 4 仪器 C 仇培养箱 S a n y 0 M c 0 1 7 5 紫 外可见分光光度 计 S hi m ad z 口 V一 1 02 一 0 2 半自 动生化仪 Screen M o le 门 K 川 1 5方法 1 5 1 实验用药与含药血清的制备 将成年大鼠按体重随机 分为4 组 每组3 只 汤剂组 微米制剂组 有效成分重组复方 组 灌胃给予5 酬k g 合生药 的相应药物或蒸馏水 体积均为 10 I n F k g 1 次 日 连 续5 次 末次 给药 前禁食1 2 卜 末 次给药 后 90 而 n 腹主 动 脉 取血 3 侧 甲 m离 心巧 m in 收 集未 溶血 血 清 同 组混匀 56 灭活30m in 过滤除菌 分装后一 20 短期保存备 用 152 心肌细胞分离培养与鉴定取 1 2日 龄大鼠心室 按 常规 方法进行分离培养 将心肌细胞悬液 4x l 护 ce u s 尸 耐 接 种于2 4 孔板 I JI 山孔 培养48 h 后换液 培养3 天后细胞基本 融合成片 实验采用原代培养的心肌细胞 选择生长良 好 搏动 规律的细胞用于实验 1 53 药物对正常培养心肌细胞活性的影响 M T T法 细 胞培养 3 天基本融合成片 搏动规律后 弃培养上清 加入含 1 0 空白或含药血清的D M E M培养基分别培养 24h 和7 2 h 培养结束后 加人l m 耐 M Tr 液继续培养4h 弃上清 吸干剩 余液体后加人D M 5 0 漩涡混匀后 于4 90nzn 处检测吸光度 1 54 连二 硫酸钠合并缺氧一 缺糖损伤模型的制备模型损 伤 组 洗 净旧 培 养基 每 孔加 人2 耐含l m m 心L N 玛 5 2 0 终浓 度 的从 饱和的无糖场记e 液 置自 制密闭盒中持续通以95 万方数据 中药药理与临床 2 0 0 2 3 4 凡十 5 C 斌 2 混合气体 15而n充分排尽盒中残余的氧气 置 3 7 5 凡细跑培养箱中培养肠 此为缺氧过程 4 h 后打开 密闭盒 弃培养上清 每孔加人0 5 耐含 1 0 空白或含药血清 的D M E M堵养基继续培养Z h 血清对照组 洗净旧培养基 在 培养的心肌细胞中分别加入含 1 葡萄糖的场司 七 液培养4 h 后 弃培养上清 换为含 10 空白或含药血清的D M E M培养荃 每孔0 5 耐 继续培养Z h 1 一 5 5 过氧化氢损伤模型的制备模型损伤组在洗净旧培养 基后 每孔分别 加人终浓度为l mlno F L H Z 造成缺血再 灌注样 损伤 损伤的同时加入含药血清或空白血清处理4h 血清对照 组除不加H Z 仇外其余处置与模型 损伤 组相同 1 56 培养上清 LDH活性 c K活性 M DA 含量 细胞胞浆 S O D活性的测定按试剂盒说明书进行 15 7 数据处理与统计分析药物作用 O D 二 模型损伤组 O D 一 血清对照组 O D 多组比较采用方差分析 组间比较 使用全 检验 到明显差异 各组可降 低培养上清中C K活性及 M O 人 含量 但 与空白 血清组比 较无显著性差异 见表4 表4 冠心n 号方含药血油对过饭化氮损伤心舰细胞的影响1 云 士 浑n 二 6 Mr AS OD 组别 幸白 对照5 76 恋 223 1 82 土 2 3 4 1 0 8 生 0 1 01 51 全 13 汤剂 61 3 4 二2 5 36 生 48 70如土 0 1 6 一 1 09 出 1 二 微米制剂4 7 0 出 2 冷二2 642 土 09 0 97士 0之 吕t og 大 1 甲 二 有 效 成 分 重 组 复 方 阴 8 宁 2 2 29 5 9 21 团士 1 复 叭 仓 全 L 6 口 3讨论 2结果 2 1 对正常培养心肌细胞活性的影响在实验条件下 冠心 n 号方不同药用形式含药血清在与正常心肌细胞共培养从h 和 72h 后 心肌细胞活性及生长与空白对照组比 较无显著差异 各 受试物作用未发现明显差别 见表20 表2 冠心皿 号方含药血清 对正常 培养 心肌细胞的影响咔士 j 二 6 组别 24 h7 2 h 空白对照 汤剂 微米制剂 有效成分重组复方 0 5 6 3生0 01 2 0 5 5 3士0 0 1 6 0 5 盯 土0 舵 3 fl 5 6 1全0 启 2 0 05 3 5士 00 2 4 05 3 1 t O049 0 t 5 34 士 0 0 1 6 O t 5 2 5士O t 们 1 2 2对连二硫酸钠合并缺级一复氧模型损伤心肌细袍的影叼 缺氧一 复教损伤导致心肌培养上清中LDH C K活性明显增 加 M D A含量增高 且心肌细胞胞浆5 O L 活性下降 在复氧同 时给予含药血清干预 三种受试物均能显著降低细胞培养上清 中L O H活性以 及 M D A 含量 并对胞浆SOD活性有明显的保护 作用 同时可减少c K渗漏 其中有效成分重组复方组在降低 幼H渗漏 保护SOD活性方面作用强于其余二者 但不同受试 物作用无显著性差异 见表30 农3 冠心n 号方含药血清对缺叙一 复叙模型损伤心肌细胞的影 晌 云 土 n 二 石 1 刀HC KMD AS O O 姐别 一 U L U L 脚心L U m 即 议 空白 对服6 3 8 士 5 1 87 生 77 81 2 土 0 佣一 1 5 6 上 5 5 汤剂出 4 土 4 6 2 甲 6 1 士 们 2氏79 士 0伪 一 11 4 生 2 7 户 徽米制 荆5 3 土 6 0 2 名 2 3 土 免 1 0 7 9 士 07 一 1 20 沈 2 5 有 效 成 分 重 组 复 方 烈 译 6 6 月士 盯 6 创士 众 13 竺二 红 里 全 丝 竺 与 空白 对照组相比 r 一 仍 和 P 城下同 2 一 3对过氛化氮损伤心肌细胞的影晌过氧化氢作用 4 卜 后 心肌细胞培养上清中L D H C K的活性明显上升 M D A含 量增加 细胞胞浆夕 D活性受损 在过氧化氢损伤的同时加人 含药血清干预 可显 著降低受损心肌细胞培养上清中1 刀 H的活 性 且对细胞胞浆S O D活性的保护作用明显 其中有效成分重 组复方组的保护作用强于其余受试物 但各受试物组间未观察 本研究着重比较目 前药物研究及临床使用的常见药用形 式的药效差异 其中 汤剂是中 药临床使用的传统形式 保留了 方剂中的基本有效成 分 其疗效已得到充分证实 有效成分重 组复方以 单味药提 取物为基础 以中医理论为指导 依据全方比 例重新组合 不仅物 质基础及作用原理相对清楚 而且能够按中 医辨证用药 临床适 应证明确且针对性好 同时质量 稳定可控 便于 产 业 化 推广是目 前中药现 代化 研究 的 热点困 微米制 剂 保留了全方的所有成分 避免了煎煮和提取过程所导致的已知 有效成分和未知有效 成分的遗失 并巨微粉化后指标成分的溶 出 量 较 传 统 饮片 显 著 升 高L 一 9 上 在 一些研究中 微粉 技 术工艺 被 证实 可 提 高 药 物活 性 少 J 被认 为 是提高 传 统中 药 临 床 应用 能 力 充分利用有限资源 改进中药制剂工艺 提高中药 质量的有 效途径之一 虽然 目 前针对以 上三者的药物化学特征己经进 行了较多的探讨 但 是 它们在疗效 代谢和生物利用过程中存 在的差异尚 待进一步 研究 与直接采用中 药 粗制剂进行体外实验相比 以 相应的含药 血清为研究对象 不 仅可有效克服制剂理化性质对实验结果产 生的干扰 且其实验条 件更接近于药物在体内产生效应的内环 境乏 叫 得到的结果也 更加可信 因此 本研究选用不同冠心n 号 方的含药血清为 受试对象进行实验 同时 为去除含药血清 本身所含生物活性物质 对检测指标的干扰 本研究对各组血清 均设立正常对照 针对正常培养组与造模损伤组在各待测指标 上的差异进行评价 更真实的反映了含药血清的生物效应 过氧化损伤是心肌缺血再灌注损伤的最重要病理基础之 一 咧 自 由 基 破 坏 正 常 膜结 构 可 导 致严 重 的LDH c K 渗 漏 M D A 生成增加 并可同 时抑制soD等抗氧化酣类活 性 进一步 加重损伤 本研究比 较在不同的冠心 n 号方含药血 清作用下上 述指标的变化情况 并采用缺氧一 复氧模型与过氧化氛模型进 行相互验证 以进一步 提高结果的可信性 在本研究中 对正 常培养心肌细胞的活性和增殖影响实验 发现 冠心n 号方三种药用形式的含药血清在本实验条件下 未 对正常心肌细胞产 生毒性作用 而含药血清对缺氧一 复氧模型 损伤心肌细胞的干预结果显示 三者均能明显减轻缺氧一 复氧 所导致的的L D H C K 渗漏以及M D A生成增加 并对细胞胞桨 5 以 活性有明显的保护作用 提示三种药用形式的冠心 n 号 方均可对抗心肌细 胞缺血再灌注损伤 虽然三者的 作用强度无 显著性差异 但有效 成分重组复方组的效果体现 了 更佳的趋势 在过氧化氮损伤模型实 验中也观察到了 类似的结果 中药复方 含药血清中有效成分的有无和浓度高低与有关药理作用及其 强度密切相关 们 在 本研究中 各单味药提取物以 水提取为主 万方数据 中药药理与临床2 仪 7 23 4 降香采用水蒸气蒸馏提取挥发油 其工艺与汤剂相似 但在 精制的过程中难免出现其他有效成分的流失 且忽视了全方同 时 煎 煮 时 不同 饮片 有效成 分溶出 时相 互作 用的 影响 泌 二 虽然 成分分析结果显示 该重组复方中指标有效成分含量较汤剂更 高 其 中 与 抗 教 化 活 性 相 关 的 丹 酚 酸B 川 丹 参总 酚 酸 阳 一 川 降 香 挥 发油 咧 等的 含 量 差 异 显著 相 关 数 据见 表1 但是 全方 煎煮可能促进微鱼有效成分的溶出 甚至生成新的有效成分 而这些成分在本研究的化学分析阶段未被检出 因此 有效成 分种类及含最的差异可能是重组复方抗缺血再灌注样损伤的 疗效虽优于汤剂 但无显著差异的主要原因 而另一方面 尽管 微米制剂最大限度地保留了全方有效成分 化学检测也证实微 米制 剂的有效成分含量明显高于汤剂和有效成分重组复方 但 其最终药效与后二者相比却并未显示出明显的优势 已有的 研究表明 虽然超微粉技术可提高药材中有效成分的体外溶出 率卜 J 但 微粉 制剂 的 生 物 利用度 却明 显低干 含等量 有效 成分 的提取物 在王雪莉等人的研究中前者仅为后者的一半左 右侧 因 此 微 米制 剂生物 利用度较低 含药 血清中 的 有效成 分含量与药品中的含量不平行 可能是本研究中微米制剂药效 未明显优于汤剂和有效成分重组复方的主要原因 由于细胞 试验 休外试验 有一定的局限性 有关结果尚须在整体试验 体内 试验 进一步验证 综上所述 汤剂 有效成分重组复方以及微米制剂这三种 药用形式的冠心n 号方虽然在有效成分的含量上存在一定的 差异 但三者对心肌缺血再灌注样损伤的保护作用却无明显差 别 因此 本方在临床使用中 可根据病症和患者的需要进行选 择 参考文献 1 陈惠 清 中 药剂峨特点与 疗效相关性探讨 中国中医 药信 息杂志 2 尾 扣 5 1 2 2 吕 6 一 盯 2 钟长 平 中药口 服给药新荆型的 研究 进展 中 草药 2 口 5 3 6 3 月 力 阳 盯5 3 史万 忠 徐德 生 沈 培芝 等 补肾益 精方 水提物和醉提物 化学指标 及药效的比 较研究 巾国中 药 杂志 2 阅卜娇贬 7 肠2 叫巧 4 杜晓敏 郭琪 何提 中成药传统斜剂与超细微粉制加的药效学比 权 中成药 2 众1 双 4 卜 3 0 了 3 0 9 李 连达 冠臼 u 号方研究 综述 冠心11号方研究集 1 卯 9 11 2 1 1 3 石 王阶 郭丽丽 王 永炎 中 药方 荆有 效成 组 分配伍研究 中国中 药杂志 2 1 兀 陌 36 1 5 一 9 张 陆 军 王 伟 邢 东 明 等 知母 微粉的 溶出及 活 性研究 中 草药 Z IX 巧 3 6 5 6 7 6 一 6 7 9 吕 蔡光先 张 水寒 杨永华 等 壳超微粉甲醇提取 物的高 效液相指纹 图谱初探 中 成药 2 仪 拓 28伍 7 81一 784 王雪莉 邢东明 盖国 胜 等 徽细化工艺制备的 葛根撤粉溶出 度和 生物利用度的研究 中国药学杂志 2 以 科 39 4 2 83 2 86 10 刘卫红 挑花汤微粉制 剂与煎剂的药效学对比 研究 河南中医 Z t 洲 巧备 石 2 1 一 23 月 洛娜 姚 尧 小平 夏汤 汤剂与 微粉制剂治疗呕吐作用的比 较 中 国 实盼丈 荆学杂志 2 肠 生 2 4 补 2 吕35 2 徐海波 吴清和 中药血清药理学研究进展 翻南中医药导报 9 卯 5 吕 1 1 一 1 4 玲F 血 m 阴M n v 牙 i R P d r D W M 忱卜 朋石 场 即d比 e 周冲成叼卜 伪 汕司 脾 而痴 卿ry C i 几 td 柱 闭 工 哭 幻 研 研 1 4 张礼和一我对中药复方有效成分研究的一些看法 化学进展 1 1刹 洲 1 1 1 2 1 肠一 1 87 巧 张 伯礼 王 水炎 方 剂关键科学问 题的基础研究一一以 组方配伍 研 制现代中 药 中 国天 然药物 2 005 奋 3 5 2 5 3 2 61 16 郭利平 高秀梅 张萌 等 丹酚酸B 预处理的 心脏微血 管内 皮细 胞延迟 保护作用 研究 天津中医 2 002 19 2 4 任42 叮 王洁 吴俊 芳 张均田 总 丹酚酸的抗 脑缺血 研究中国 药理学 通 报 1 9 的 1 5 2 1 64一 1 6 6 招 吴 俊 芳 王 洁 张 均田 总 丹 酚 酸 对局 灶 性脑缺 血 损伤及 执氧 化 碗 活 性的 影响 中 国新药 杂志 2 佣0 7 卜 452 一 朽5 份 姜爱莉 孙利芹 降香抗氧化成分的提取及活性研究 精细化工 2 侧 落 2 1 5 乃 5 28 砧M 诫 serv mofd i ff e r e l l t 胡k i n j 肠 r n l s 成以班 n 万 i n nfo n m l l a 冠心n号方 皿 触C h e 1 1 i a一r e 1 可u 卿 i n比l t u r e drat n l y 0 Car d ia l c e U s 防u y 叨 口石如j 儿Pen g LIU a l ld a X i y u anH os Pi 旧 C h i n a A c 习 d e 口 y JTCM B e ij i n g 1 0 仪 玲 1 0 川 代 公 v TOc o m p 晚 the e 玉c t ofd il re re n t o 币 c i 阎 fo 助3 5 1 c h 助m 司i c i n 己b r ot h m ic 功 m e t e r p raeP ara咖 a n d re c 咖断 at io n of挤 feCti v e c 皿时 i t ute 成G o a nx n l l fo 门 l ula 佣th e i s c he m a 一 re p e rfu 1 0 o 1 刊 u 俘主 n o ul t u re d rat叨沈 a 记 1吐倪 场t 压 竺r fo und at i o n 拓 r c l in 亡 a l 伞 肉 耐 t b e fu d h o r o x p 如 t at i ono f th e d ru gM 而团 5 孔e b 卜 叫 洲 1 5 如9 p re p a 二 d a t 如m in afte r 击 1 o t 耐 in i o t t欲 1owh t 坛 fi ve目 而n ist画曲 息 成姗e a d ay敏 d 佣 age ofs 扩吨 M 卿田 飞 七