[理学]第3章紫外可见.ppt

第三章紫外 可见分光光度法UltravioletandVisible UV Vis Spectrophotometry 1 紫外 可见吸收光谱 2 Lambert Beer定律 3 紫外 可见分光光度计 4 分析条件的选择 5 紫外 可见分光光度法的应用 概述 紫外 可见分光光度法是利用物质的分子对紫外 可见光谱区 一般认为是200 800nm 的辐射的吸收来进行分析的一种仪器分析方法 这种分子吸收光谱产生于价电子和分子轨道上的电子在电子能级间的跃迁 它广泛用于无机和有机物质的定性和定量分析 1 紫外 可见吸收光谱 一 分子吸收光谱的形成 物质分子内部3种运动形式及其对应能级 1 电子相对于原子核的运动 电子能级 Ee2 原子核在其平衡位置附近的相对振动 振动能级 Ev3 分子本身绕其重心的转动 转动能级 Er E Ee Ev Er 紫外 可见 Ee Ev Er 若用 Ee Ev Er分别表示电子能级 振动能级转动能级差 即有 Ee Ev Er 1 紫外 可见吸收光谱 使电子能级变化需要的能量是1 20ev相当于紫外及可见光能量范围 使振动能级变化需要的能量是0 05 1ev相当于红外光能量范围 使转动能级变化需要的能是为0 05ev以下相当于远红外光能量范围 用紫外 可见 光照射有机分子 分子吸收紫外 可见 光后 从电子能级基态跃迁到激发态 得到紫外 可见 吸收光谱 用红外光照射有机分子 分子从振动能级基态跃迁到激发态 可产生红外吸收光谱 用远红外光照射有机分子 分子从转动能级基态跃迁到激发态 可产生远红外吸收光谱 紫外 可见 光谱 红外光谱 远红外光谱是分子能级变化形成的 称为分子光谱 分之吸收光谱带状光谱 纯电子能态间跃迁 分子内电子跃迁 带状光谱 锐线光谱 各种化合物由于组成和结构上的不同都有各自特征的紫外 可见吸收光谱 若用一连续波的电磁辐射以波长大小顺序分别照射分子 并记录物质分子对辐射吸收程度随辐射波长变化的关系曲线 这就是分子吸收曲线 通常叫分子吸收光谱 图紫外吸收光谱图1 苯甲酸2 水杨酸 二 有机化合物的紫外 可见吸收光谱一个有机化合物分子对紫外 可见光的特征吸收 可用吸收最大处的波长 即最大吸收峰波长来表示 符号为 max max决定于分子的激发态与基态之间的能量差 分子外层电子有形成 键的 电子 形成 键的 电子和未成键的n电子 受到光的照射基态电子吸收能量后变为激发态 和 电子 同时产生吸收光谱 有机分子的电子跃迁类型 跃迁实现 跃迁所需的能量在所有跃迁类型中最大 因而所吸收的辐射的波长最短 处于小于200nm的真空紫外区 如甲烷的 max为125nm 乙烷为135nm n 跃迁含有杂原子 如N O S P和卤素原子 的饱和有机化合物 都含有n电子 因此 都会发生这类跃迁 n 跃迁所要的能量比 跃迁小 所以吸收的波长会长一些 可在200nm附近 但大多数化合物仍在小于200nm区域内 电负性越大 n电子被束缚得越紧 跃迁所需的能量越大 吸收的波长越短 如 CH3Cl max173nmCH3Br max204nmCH3I max258nm 跃迁含有 电子基团的不饱和有机化合物 都会发生 跃迁 如含有 等的有机化合物 跃迁所需的能量比 跃迁小 也一般比n 跃迁小 所以吸收辐射的波长比较长 一般在200nm附近 n 跃迁由n电子从非键轨道向 反键轨道的跃迁 含有不饱和杂原子基团的有机物分子 基团中既有 电子 也有n电子 可以发生这类跃迁 n 跃迁所需的能量最低 因此吸收辐射的波长最长 一般都在近紫外光区 甚至在可见光区 对于有机化合物的分析来说 最有用的吸收光谱是基于n 和 跃迁而产生的 电荷转移跃迁某些分子同时具有电子给予体和电子接受体两部分 这种分子在外来辐射的激发下 会强烈地吸收辐射能 使电子从给予体向接受体迁移 叫做电荷转移跃迁 所产生的吸收光谱称为电荷转移光谱 电荷转移跃迁实质上是分子内的氧化 还原过程 电子给予部分是一个还原基团 电子接受部分是一个氧化基团 激发态是氧化 还原的产物 是一种双极分子 某些取代芳烃可以产生电荷转移吸收光谱 如 电荷转移吸收光谱的特点是谱带较宽 一般 max较大 吸收较强 摩尔吸光系数通常大于104L moL 1 cm 1 在分析上也较有应用价值 下图为有机物各种电子跃迁吸收光谱的波长分布图 紫外与可见光谱区产生的吸收类型 三 无机化合物的紫外 可见吸收光谱 电荷转移吸收光谱与某些有机物相似 不少无机化合物会在电磁辐射的照射下 发生电荷转移跃迁 产生电荷转移吸收光谱 不少过渡金属离子与含有生色团的试剂反应所生成的配合物及许多水合无机离子 均可发生电荷转移跃迁而产生吸收光谱 如 配位体场吸收光谱这种谱带是指过度金属离子与配位体 通常是有机化合物 所形成的配合物在外来辐射作用下 吸收紫外可见光而得到相应的吸收光谱 配位场跃迁包括d d跃迁和f f跃迁 由于这两类跃迁必须在配位体的配位场作用下才有可能发生 因此又称为配位场跃迁 下图为配位体不同配置情况时d轨道的能级分裂示意图 配位场d轨道能量的影响 四 常用术语 吸收光谱吸收曲线 以波长 nm 为横坐标 以吸光度A或透射比T为纵坐标所绘的曲线 吸收峰吸收曲线上吸光度最大的地方 对应的波长为最大吸收波长 max 谷峰与峰之间的最低部位 对应波长为最小吸收波长 min 肩峰在一个峰旁边产生的曲折 称为肩峰 末端吸收在谱图短波端呈现强吸收但不成峰形的部分 称为末端吸收 生色团化合物中含有不饱和 电子和孤对n电子的基团 能吸收紫外或可见光 这种基团称为生色团 亦称发色团 例如 这些基团能引起n 跃迁 从而产生紫外或可见光的吸收 若生色团之间彼此形成共轭体系 那么原来各自生色团的吸收带将消失 而产生新的吸收带 注意 如果一个化合物的分子含有数个生色团 若生色团之间不发生共轭作用 那么生色团产生的吸收带的波长位置及吸收强度互相影响不大 C C C C C C 例如 吸收在175nm 吸收在213nm 新吸收带的吸收位置处在较长的波长处 且吸收强度显著增大 这一现象叫做生色团的共轭效应 助色团是一种能使生色团的吸收峰向长波方向位移并增强其吸收强度的官能团 例如 NH2 OH NR2 OR SH SR Cl Br等 一般是含有未共享电子的杂原子基团 这些基团中的n电子能与生色团中的 电子相互作用 使 跃迁能量降低 跃迁几率变大 红移由于共轭效应 引入助色团或溶剂效应使化合物的吸收波长向长波方向移动 称为红移效应 能对生色团起红移效应的基团 称为向红基团 蓝移有时某些生色团 如 的碳原子一端引入某取代基或溶剂效应 使化合物的吸收波长向短波方向移动 称为蓝移 或紫移 效应 能引起蓝移效应的基团 如 CH2 C2H5 等 称为向蓝基团 增色效应和减色效应由于化学结构的改变或其他原因 使吸收强度增强 称为增色效应 反之减色效应 五 影响紫外 可见光谱因素 共轭效应分子最高已占轨道能级 分子最低空轨道能级 max 立体化学效应 溶剂极性对 与n 跃迁能量的影响 溶剂极性的不同也会引起某些化合物吸收光谱的红移或蓝移 这种作用称为溶剂效应 溶剂效应 n max max 2 Lambert Beer定律 一 透射比和吸光度当一束平行光通过均匀的溶液介质时 光的一部分被吸收 一部分被容器表面反射 一部分透过 设入射光强度为I0 吸收光强度为Ia 透射光强度为It 反射光强度为Ir 则Io Ia It Ir由于用参比池调节仪器的零吸收点 再测量被测量溶液的透射光强度 所以反射光的影响可以从参比溶液中消除 则上式可简写为 Io Ia It 透射光强度 It 与入射光强度 I0 之比称为透射比 亦称透射率 用T表示 则有 T 表明溶液对光的吸收越弱 T 表明溶液对光的吸收越强 常用吸光度A表示物质对光的吸收程度 其定义为 A 表明物质对光吸收越强 反之越弱 透射比常以百分率表示 称为百分透射比 T 吸光度A为一个无因次的量 两者可通过上式互相换算 二 Lambert Beer定律朗伯 比耳定律 Lambert Beer 是光吸收的基本定律 俗称光吸收定律 是分光光度法定量分析的依据和基础 当入射光波长一定时 溶液的吸光度A是吸光物质的浓度C及吸收介质厚度l 吸收光程 的函数 朗伯和比耳分别于1760年和1852年研究了这三者的定量关系 朗伯的结论 此即称为朗伯定律 k 为比例系数 比耳的结论 此即称为比耳定律 k 称为比例系数 合并上述两式 即得到 此即称为朗伯 比尔定律 k为比例系数 k的数值除取决于吸光物质的特性外 其单位及数值还与C和l所采用的单位有关 l通常采用cm为单位 并用b表示 所以k的单位取决C采用的单位 a的单位dm3 g 1 cm 1 当C采用mol dm 3时 k称为摩尔吸光系数 以 表示 的单位dm3 mol 1 cm 1 三 吸光系数 当C采用g dm 3时 k称为吸光系数 以a表示 在吸收定律的几种表达式中 A bc在分析上是最常用的 与入射光波长有关 是在特定波长及外界条件下 吸光质点的一个特征常数 数值上等于吸光物质的浓度为1mol dm 3 液层厚度为1cm时溶液的吸光度 它是物质吸光能力的量度 可作为定性分析的参考和估计定量分析的灵敏度 有时吸收光谱的纵坐标也用 或lg 表示 并以最大摩尔吸光系数 max表示物质的吸收强度 四 偏离Lambert Beer定律的因素1 与样品溶液有关的因素通常只有当吸光物质的浓度小于0 01mol L 1的稀溶液中 吸收定律才成立 吸收物质在溶液中的浓度较高 溶剂及介质条件 溶液有胶体 乳状液或悬浮物质存在2 与测量仪器有关的因素 非单色光引起 例如 按右图的吸收光谱 谱带 波长宽度作为入射光吸光系数变化较小 测量造成的偏离就比较小 谱带 波长宽度作为入射光吸光系数的变化很大 测量造成的偏离也就很大 通常选择吸光物质的最大吸收波长 即吸收带峰所对应的波长 作为分析的测量波长 3 紫外 可见分光光度计 3 紫外 可见分光光度计 一 主要组成部件 紫外 可见分光光度计基本结构示意图 1 光源 辐射源 对光源的要求发射连续辐射 足够的辐射强度及良好的稳定性 辐射强度随波长的变化应尽可能小 光源的使用寿命长 操作方便 光源的种类 钨灯和碘钨灯波长范围为340 2500nm 须配备稳压装置 以保证光源的稳定 氢灯和氘灯波长范围为160 375nm 3 紫外 可见分光光度计 2 单色器3 吸收池4 检测器5 信号指示系统 二 紫外 可见分光光度计的类型1 单光束分光光度计其光路示意图如前面的图所示 国产722型 751型 724型 英国SP500型以及BackmanDU 8型等均属于此类光度计 2 双光束分光光度计其光路示意于下图 由于两束光同时分别通过参比池和样品池 因而能自动消除光源强度变化所引起的误差 这类仪器有国产710型 730型 740型等 3 紫外 可见分光光度计 单波长双光束分光光度计原理图 3 双波长分光光度计其基本光路如下图所示 双波长分光光度计光路示意图 A A A 1 A 2 对于多组分混合物 混浊试样 如生物组织液 分析 以及存在背景干扰或共存组分吸收干扰的情况下 利用双波长分光光度法 往往能提高方法的灵敏度和选择性 三 分光光度计的校正自己看书 4 分析条件的选择 一 仪器测量条件仪器测量条件的选择包括测量波长 吸光度范围 狭缝宽度 1 测量波长的选择最强吸收带的最大吸收波长作为测量波长 称为最大吸收原则 以获得最高的分析灵敏度 2 适宜吸光度范围的选择由于吸收定律中透射比T与浓度C是负对数的关系 当浓度较大或浓度较小时 相对误差都比较大 因此 要选择适宜的吸光度范围进行测量 以降低测定结果的相对误差 根据吸收定律 微分后得 或 将上式代入lambert Beer定律 则测定结果的相对误差为 要使测定结果的相对误差 c c 最小 对T求导应有一极小值 即 解得 或 A 0 434 T 36 8 表明当吸光度A 0 434时 仪器的测量误差最小 这个结果也可以从左图中看出 在吸光分析中 一般选择 A测量范围0 2 0 8T 65 15 此时如果仪器的透射率读数误差 T 为1 时 由此引起的测定结果相对误差 c c 约为3 浓度测量的相对误差 c c 与溶液透射比 T 的关系 在实际工作中 可通过调节待测溶液的浓度或选用适当厚度的吸收池的方法 使测得的吸光度落在所要求的范围内 3 仪器狭缝宽度的选择狭缝的宽度会直接影响到测定的灵敏度和校准曲线的线性范围 狭缝宽度过大时 入射光的单色性降低 校准曲线偏离比耳定律 灵敏度降低 狭缝宽度过窄时 光强变弱 势必要提高仪器的增益 随之而来的是仪器噪声增大 于测量不利 最佳狭缝宽度 减小狭缝宽度时 试样的吸光度不再增加 二 显色反应条件的选择显色反应条件的选择包括显色剂及其用量 反应酸度 温度 时间等的选择 1 显色剂及其用量 显色剂的选择原则 显色剂用量 配位数与显色剂用量有关 在形成逐级配合物 其用量更要严格控制 显色剂与待测离子显色反应的产物组成恒定 稳定性好 显色条件易于控制 产物对紫外 可见光有较强的吸收能力 即 大 显色剂与产物的颜色对照性好 即吸收波长有明显的差别 一般要求 60nm 2 反应的酸度介质的酸度往往是显色反应的一个重要条件 多数显色剂是有机弱酸 或弱碱 介质的酸度直接影响着显色剂的离解程度 从而影响显色反应的完全程度 Fe 与水杨酸的配合物 随介质pH值的不同而变化如下表所示 对于这一类的显色反应 控制反应酸度至关重要 例如 在实际分析工作中 是通过实验来选择显色反应的适宜酸度的 具体做法是 固定溶液中待测组分和显色剂的浓度 改变溶液 通常用缓冲溶液控制 的酸度 pH 分别测定在不同酸度下溶液的吸光度A 绘制A pH曲线 从中找出最适宜的pH范围 3 显色的时间 4 反应的温度 三 参比溶液的选择1 溶剂参比当试样溶液的组成较为简单 共存的其他组分很少且对测定波长的光几乎没有吸收 以及显色剂没有吸收时 可采用溶剂作为参比溶液 这样可消除溶剂 吸收池等因素的影响 2 试剂参比如果显色剂或其他试剂在测定波长有吸收 按显色反应相同的条件 只是不加入试样溶液 同样加入试剂和溶剂作为参比溶液 这种参比溶液可消除试剂中的组分产生吸收的影响 3 试样参比如果试样基体 除被测组分外的其它共存组分 在测定波长处有吸收 而与显色剂不起显色反应时可按与显色反应相同的条件处理试样 只是不加显色剂 作为参比溶液 4 平行操作溶液参比用不含被测组分的试样 在相同条件下与被测试样同样进行处理 由此得到平行操作参比溶液 四 干扰及消除方法干扰物质的影响有以下几种情况 干扰物质本身有颜色或与显色剂形成有色化合物 在测定条件下也有吸收 在显色条件下 干扰物质水解 析出沉淀使溶液混浊 致使吸光度的测定无法进行 与待测离子或显色剂形成更稳定的配合物 使显色反应不能进行完全 可以采用以下几种方法来消除这些干扰作用 1 控制酸度根据配合物的稳定性不同 可以利用控制酸度的方法提高反应的选择性 以保证主反应进行完全 2 选择适当的掩蔽剂3 利用生成惰性配合物例如 钢铁中微量钴的测定 常用钴试剂为显色剂 钴试剂与Co2 Ni2 Zn2 Mn2 Fe2 等都有反应 但它与Co2 在弱酸性介质中一旦完成反应后 即使再用强酸酸化溶液 该配合物也不会分解 而Ni2 Zn2 Mn2 Fe2 等与钴试剂形成的配合物在强酸介质中很快分解 从而消除了上述离子的干扰 提高了反应的选择性 4 选择适当的测量波长5 分离若上述方法不易采用时 也可以采用预先分离的方法 如沉淀 萃取 离子交换 蒸发和蒸馏以及色谱分离法 包括柱色谱 纸色谱 薄层色谱等 此外 还可以利用化学计量学方法实现多组分同时测定 以及利用导数光谱法 双波长法等新技术来消除干扰 5 紫外 可见分光光度法的应用 一 定性分析1 比较吸收光谱曲线法最大吸收波长 max max 吸收峰的数目 位置是定性分析的光谱依据 比较法有标准物质比较法和标准谱图比较法两种 利用标准物质比较 在相同的测量条件下 测定和比较未知物与已知标准物的吸收光谱曲线 利用标准谱图或光谱数据比较 常用的标准谱图有以下的四种 1 SadtlerStandardSpectra Ultraviolet Heyden London 1978 萨特勒标准图谱共收集了46000种化合物的紫外光谱 2 R A FriedelandM Orchin UltravioletandVisibleAbsorptionSpectraofAromaticCompounds Wiley NewYork 1951 本书收集了597种芳香化合物的紫外光谱 3 KenzoHirayama HandbookofUltravioletandVisibleAbsorptionSpectraofOrganicCompounds NewYork Plenum 1967 4 OrganicElectronicSpectralData JohnWileyandSons 1946 这是一套由许多作者共同编写的大型手册性丛书 所收集的文献资料由1946年开始 目前还在继续编写 2 计算不饱和有机化合物最大吸收波长的经验规则有伍德沃德 Woodward 规则和斯科特 Scott 规则 当采用其它物理或化学方法推测未知化合物有几种可能结构后 可用经验规则计算它们最大吸收波长 然后再与实测值进行比较 以确认物质的结构 伍德沃德 Woodward 规则它是计算共轭二烯 多烯烃及共轭烯酮类化合物 跃迁最大吸收波长的经验规则 p37 例1 解 基值 253nm 5nm 15nm 273nm 环外双键 烷基取代基 3 5 环外双键 例2 解 基值 烷基取代基 环外双键 2 5 214nm 25nm 共轭系统延长 1 30 30nm 10nm 279nm 5 5 例3 没有取代基的 有取代基的 基值 取代基 1 12 1 18 环外双键 1 5 共轭系统的延长 1 30 215nm 18nm 12nm 5nm 30nm 280nm 计算 并指出在不饱和酮分子中的哪个位置有取代基 解 小结 1 选准母体 2 环外双键 指整个共轭体系中的双键 且与环相连 3 烷基取代基 指整个共轭体系中碳上的烷基取代 4 共轭系统延长 在母体基础上每增加一个共轭双键算一次延长 斯科特 Scott 规则是计算芳香族羰基化合物衍生物的最大吸收波长的经验规则 计算方法与伍德沃德规则相似 二 结构分析1 某些特征基团的判别有机物的不少基团 生色团 如羰基 苯环 硝基 共轭体系等 都有其特征的紫外或可见吸收带 紫外 可见分光光度法在判别这些基团时 有时是十分有用的 2 共轭体系的判断 210nm以上无强吸收带 可以认定该化合物不存在共轭体系 215 250nm区域有强吸收带 则该化合物可能有两至三个双键的共轭体系 例如 1 3丁二烯 max为217nm max为21 000 260 350nm区域有很强的吸收带 则可能有三至五个双键的共轭体系 例如 癸五烯有五个共轭双键 max为335nm max为118 000 3 异构体的判断包括顺反异构及互变异构两种情况的判断 顺反异构体的判断生色团和助色团处在同一平面上时 才产生最大的共轭效应例如 肉桂酸顺 反式的吸收如下 顺式 反式 max 280nm max 13500 max 295nm max 27000 由于反式异构体的空间位阻效应小 分子的平面性较好 共轭效应强 因此 max及 max都大于顺式异构体 互变异构体的判断某些有机化合物在溶液中可能有两种以上的互变异构体处于动态平衡中 这种异构体的互变过程常伴随有双键的移动及共轭体系的变化 因此也产生吸收光谱的变化 例如 乙酰乙酸乙酯就是酮式和烯醇式两种互变异构体 max 272nm max 16 max 243nm max 16000 n 两种异构体的互变平衡与溶剂有密切关系 在乙烷这样的非极性溶剂中 由于形成分子内的氢键 且形成共轭体系 使能量降低以达到稳定状态 所以烯醇式异构体比率上升 在水这样的极性溶剂中 由于可能与H2O形成氢键而降低能量以达到稳定状态 所以酮式异构体占优势 三 定量分析1 单组分的定量分析标准对照法 标准曲线法 标准对照法在相同条件下 平行测定待测溶液的吸光度Ax和已知浓度标准溶液的吸光度As 则由Cs可计算试样溶液中被测物质的浓度Cx 标准对照法因只使用单个标准 引起误差的偶然因素较多 故结果往往较不可靠 标准曲线法这是实际分析工作中最常用的一种方法 配制一系列不同浓度的标准溶液 以不含被测组分的空白溶液作参比 测定标准系列溶液的吸光度 绘制吸光度 浓度曲线 称为校正曲线 也叫标准曲线或工作曲线 C A Cx 标准曲线法 在相同条件下测定试样溶液的吸光度 从校正曲线上找出与之对应的未知组分的浓度 Ax 2 多组分的定量分析根据吸光度具有加和性的特点 在同一试样中可以同时测定两个或两个以上组分 a 情况表明两组分互不干扰 可以用测定单组分的方法分别在 1 2测定A B两组分 混合物的紫外吸收光谱 a 不重迭 b 部分重迭 c 相互重迭 情况表明A组分对B组分的测定有干扰 而B组分对A组分的测定无干扰 则可以在 1处单独测量A组分 求得A组分的浓度CA 然后在 2处测量溶液的吸光度及A B纯物质的和值 根据吸光度的加和性 即得 b 则可以求出CB 情况表明两组分彼此互相干扰 此时 在 1 2处分别测定溶液的吸光度及 而且同时测定A B纯物质的 及和 然后列出联立方程 c 解得CA CB 3 双波长分光光度法当试样中两组分的吸收光谱重叠较为严重时 用解联立方程的方法测定两组分的含量可能误差较大 这时可以用双波长分光光度法测定 双波长分光光度法定量测定两混合物组分的主要方法有等吸收波长法和系数倍率法两种 等吸收波长法 试样中含有a b两组分 若要测定b组分 a组分有干扰 采用双波长法对b组分测量时方法如下 选择待测组分b的最大吸收波长 2为测量波长 从 2与组分a吸收曲线的交点作一条平行于波长轴的直线 交于组分a吸收曲线的另一点 该点所对应的波长为参比波长 1 组分a在 2和 1处是等吸收点 由吸光度的加和性可知 混合试样在 2和 1处的吸光度可表示为 2 1 b A a a b 测量波长 参比波长 双波长分光光度计的输出信号为 A 则 因 所以 可见仪器的输出讯号 A与干扰组分a无关 它只正比于待测组分b的浓度 即消除了a的干扰 A 测量波长 参比波长 系数倍率法 当干扰组分A的吸收光谱曲线不呈峰状 仅是陡坡状时 不存在两个波长处的等吸收点时 如下图所示 原理自己看书 在这种情况下 可采用系数倍率法测定B组分 并采用双波长分光光度计来完成 4 示差分光光度法 用普通分光光度法测定浓度很稀或很浓溶液的吸光度时 测量误差都很大 若用一已知合适浓度的标准溶液作为参比溶液 调节仪器的100 透射比点 即0吸光度点 测量试样溶液对该已知标准溶液的透射比 则可以改善测量吸光度的精确度 这种方法称为示差分光光度法 当测定低透射比 高吸光度 的高浓度试液时 用比试液浓度C1稍低的标准溶液C2作参比溶液 这种示差法叫高吸收法 其原理如下 待测试液浓度C1 标准溶液浓度C2根据Beer定律A1 Lc1A2 Lc2 测定时 先用比试样浓度稍小的标准溶液 加入所需试剂后作为参比 调节透射比为100 即吸光度为0 然后测量试样的吸光度 这时的吸光度实际是两者差 A A A A1 A2 L c1 c2 L c A与两者的浓度差 c成正比 且处在正常的读数范围 以 A与 c作校准曲线 根据测得 A 查相应的 c 则c1 c2 c 当测定高透射比 低吸光度 的低浓度试液时 用比试液浓度稍高的标准溶液作参比溶液 这种示差法叫低吸收法 若同时用浓度不同的两种标准溶液 试液的浓度需介于两标准溶液之间 分别调仪器的100 透射比点及零透射比点 这种示差方法叫最精密法 5 导数分光光度计法解决干扰物质与被测物质的吸收光谱重叠 消除胶体和悬浮物散射影响和背景吸收 提高分辨率的一种技术 将 对波长 求导 在整个波长范围 I0内可控制在恒定值 则 导数分光光度法的一阶导数信号与浓度成正比例 不需要通过对数转换为吸光度 对于二阶导数光谱 三阶导数光谱 由数学推导可知 经n次求导后 导数信号与仍然浓度成正比 藉此可以用于定量分析 由图可见随着导数的阶次增加 谱带变得更加尖锐 分辨率提高 导数分光光度法最大的优点是可以提高检测的灵敏度 右图是用导数分