柑橘是世界上重要的经济作物.docx

柑橘是世界上重要的经济作物，广泛栽培于热带和亚热带地区。由于柑橘品种较多，各自起源中心相距较远1，因此柑橘的分类、进化和重要栽培（杂）种的起源等问题一直未能得到很好的解决 2 。各种分子标记及相关检测技术的出现，为解决这些问题提供了强有力的工具。微卫星或简单重复序列（Simple SequenceRepeat，SSR）是短的核苷酸序列，通常为23 个碱基长度的串联重复系列，由于序列间串联重复数量的不同而揭示出扩增的多态性 3 。SSRs 分子标记具有共显性、高的信息含量、中性、描述基因型特征的有用工具等优点4，是实验室中常用的分子标记之一5。本文主要介绍了SSRs 在柑橘研究中的应用最新进展，以期对柑橘研究工作起到一定的帮助。1 S S R s 在柑橘起源、分类、进化和遗传多样性研究中的应用Sergio Pietro Ferrante 等6为获得柠檬（lemon）、宽皮柑橘（mandarin）的无核品种，分别选育了二者的2 种四倍体杂交种，一种为双二倍体（2n=4x）细胞杂交种，另一种为同源四倍体（2n=4x）杂交种，并用SSRs 研究了这2 种新的柑橘四倍体的杂交起源。在筛选出的21 个SSRs 中，有6 个SSRs 的分析结果显示四倍体杂交苗中的等位基因分别来自杂交亲本，揭SSRs 分子标记在柑橘研究中的应用最新进展综述了SSRs 分子标记在柑橘遗传多样性分析、遗传图谱构建、亲本起源推导、品种及杂交苗区分与鉴定以及进化和分类等方面的应用最新进展。柑橘; 分子标记; 遗传分析中图分类号: Q7; S666 文献标识码: A：示了四倍体杂交苗的杂交起源。Roberto Luis Weiler 等7用SSRs 描述了以Clementina Fina (Citrus clementinaHort. ex Tan.)为母本、以Montenegrina (Citrusdeliciosa Ten.)为父本的杂交子代的特征。他们用12 对SSRs 引物（平均多态性信息含量PIC 为0.270.65）区分出93 个杂交子代，并将各子代按与父母本的接近程度进行了分组。所有分析的Clementina Fina及Montenegrina的子代为杂交种，它们的杂交起源可以清楚地通过SSRs 分析表现出来。M. Jannati 等8用SSRs 分析了23 个柑橘品种的亲缘关系，并研究了一些重要的柑橘品种的起源，研究结果发现15 个SSRs的多态性较高，每个S S R 的等位基因数量范围为4（TAA41）12（AT01、ATC09、AG14）个，平均为8.72 个等位基因。用UPGMA 分析法基于23 个SSRs 获得的相似基数对所研究的柑橘品种进行聚类分析并构建进化树，结果显示这些柑橘品种分为2 个大的类群:类群A 包含Yuzo and Poncirus; 类群B 分为3 个亚群: Fortunella sp， Mandarin ubgroup， CitrusLimon，Citrus aurantifolia，Citrus aurantium，Citrusmedica 和Citrus grandis。该研究结果与地理起源和亲缘谱系表现一致，在育种时可用于亲本植物的选择。A. Ghanbari 等9运用SSRs 研究了Mazandaran 的7 个温州蜜柑未知品种（unknown unshiu）、12 个本地温州蜜柑（local unshiu）、10 个Wase 温州蜜柑、7 个Wase衍生品种、5 个Owari 品种及3 个对照品种（Citrusclementina，Citrus reticulate，Citrus page）的41 个基因型，结果显示扩增产生的多态型带和单态型带集中于103270 bp，对照组和Owari 组的遗传最大距离为0.25，本地温州蜜柑和Wase 温州蜜柑的遗传最小距离为0.97，表明本地温州蜜柑和Wase 的相似性最高。这6 个居群用UPGMA 法构建的进化树分成3 个类群: 温州蜜柑未知品种，本地温州蜜柑，Wase 温州蜜柑和Wase 衍生品种; Owari 品种; 对照组。上述研究表明SSRs 能够很好地区分温州蜜柑的不同品种，而且运用NTSYS 软件基于UPGMA 的方法分析基因型，栽培品种和研究种类的相似性的变化范围从0.35 到1，表明这些品种的基因型多态性较高。龚桂芝等10应用SSRs 分析了枳属28 个品种的遗传多样性及它们与近缘柑橘属的亲缘关系，实验结果表明普通枳的遗传差异较大，22 个SSRs 的PIC 为0.51，平均期望杂合度为0.52，表明中国枳种质资源具有较丰富的遗传多样性。在遗传距离约0.16 时，22 份普通枳可以分成4 个类型。富民枳与普通枳在核基因组上存在较大差异，支持富民枳种的地位。韩国辉等11利用SSRs 分析沙田柚2 个杂交组合159 株后代的杂种性质，采用UPGMA 聚类分析法分析子代群体和亲本的遗传关系。4 对SSRs 引物可以从104 株沙田柚强德勒柚的杂交后代鉴定出103 株杂种，鉴定率达到99.04%，且引物AGC9 的扩增图谱中有70 个子代出现了双亲都没有的新条带; 5 对引物鉴定出沙田柚红江橙的全部杂交后代均为杂种，并发现一个纯合显性标记AAT12，在引物GA18 和AGC9 的扩增结果中出现了亲本条带的缺失; UPGMA 聚类分析结果显示，2 个杂交组合后代群体均出现较显著的遗传变异，2 个组合的遗传多样性也有较大的差异。杂交是获得柑橘遗传变异株系的有效途径，SSRs 可以广泛用于柑橘杂种的鉴定和遗传多样性分析。Noelle A. Barkley 等12研究了11 个不同柑橘品种（来源于3 个不同的属）等位基因中SSRs 的数量，分析了SSRs 之间的相似程度，并用SSRs 对柑橘品种及相关柑橘属进行了分类。该研究从祖先柑橘品种（citrus species）及与其亲缘关系较近的椪柑属（Poncirus)和金橘属（Fortunella）的65 个等位基因中，获得了3 个SSRs。其中25 个基因含有CCT01 SSR，3bp 重复序列的插入或缺失皆发生在SSR 区域内。长度相近的等位基因虽然来源不同，但形态相近。例如: 来自柚子长为158bp 等位基因的CRC64 混合模式为(TCC)3(ACC)2(TCC)2，也存在(TCC)3ACC(TCC)3 和(TCC)3(ACC)(TCC)4 模式。CRC64 中有ACC 中断或两边TCC 缺失的情况出现。SSRs 中大量的点突变是同型演化的基础。2 S S R s 分子标记与柑橘抗性相关性的应用将SSRs 与柑橘的抗病性、抗旱性、抗寒性等性状联系起来，发掘与抗性相关的SSRs，可以简化优良品种的筛选过程，有利于育种与生产。彭祝春等13用抗柑橘溃疡病的宜昌橙2586与易感病的岭南沙田柚进行杂交，随机选取80 株F1 代在田间接种溃疡病，并进行抗性鉴定。采用集合分离分析法(Bulked Segregant Analysis，BSA)，结合SSRs 技术，筛选到1 个与柑橘溃疡病抗性相关的标记CCR-110。将含有CCR-110 的F1 代和已知抗溃疡病柑橘对CCR-110标记进行验证分析，该标记与溃疡病抗性的相关系数为0.79，而且发现易感病的甜橙类、柚类、枳类没有此标记，抗病的金柑类、宜昌橙类、香橙类、宽皮柑橘类的多数材料出现此标记，证实该标记与溃疡病抗性相关。3 EST-SSRs 在柑橘遗传图谱构建和遗传多样性分析中的应用表达序列标签- 简单重复序列（Expressed SequenceTag-Simple Sequnce Repeats，EST-SSRs）是基于表达序列标签开发的一种新型的分子标记。Fran?oisL Luro 等14为了增强EST-SSRs 在基因图谱构建以及柑橘系统研究中的作用，分析了二或三核苷酸的多态性以及它们在编码区的分布。从克里曼丁的37000个EST 克隆中获得的11391 个单基因中发现了1692 个SSRs。在1501 个单基因中至少含有一个SSR。克里曼丁EST 数据库中SSRs 的频率分别为: 三核苷酸重复为曾 培，李 翀，黄 勇：SSRs分子标记在柑橘研究中的应用最新进展53.9%，二核苷酸重复为37.6%，四核苷酸重复为3.7%，六核苷酸重复为2.4%，混合核苷酸重复占2%。SSRs集中分布于cDNA5端的前100 个核苷酸（大约占75%）。二核苷酸重复主要分布于cDNA 的5 端翻译起始部分以及非编码区，50% 分布在5端100 个核苷酸以前，75% 分布于非编码区。而三核苷酸重复则均匀地分布于EST 的编码区。Chunxian Chen等15用甜橙（母本）与椪柑（父本）的141 个杂交子代为材料，获得了大量的EST 序列，并研究了这些EST 序列中EST-SSR 的情况。在甜橙的11 个连锁群中，总共有113个EST-SSRs（9个不连锁位点）; 在椪柑的8 个连锁群中，共有45 个EST-SSRs（4 个不连锁位点）。4 c p S S R 在柑橘的遗传多样性研究中的应用叶绿体微卫星（chloroplast microsatellite，cpSSR）是近几年发展起来的新型高效分子标记，在植物系统发育和基因漂移研究中有广泛应用。王福生等 1 6 将cpSSRs 与EST-SSRs 结合揭示了柑橘及其近缘属的系统发育关系，阐明了保存于国家果树种质柑橘圃内一些特异种质资源的遗传背景。用cpSSR 分析了50份材料，用EST-SSRs 分析了44 份材料。22 对cpSSRs引物扩增出146 个多态性条带，平均每对引物可扩增出6.64 个多态性条带，Shannon 的多样性指数为0.32;18 对EST-SSRs 引物扩增出240 个多态性条带，平均每对引物可扩增出13.3 个多态性条带，PIC 为0.73，平均期望杂合度为0.78。根据cpSSRs 和EST-SSRs 的分析结果，结合形态学证据，证明莽山野橘、元橘、宜昌橙有较近的亲缘关系。龚桂芝等9应用cpSSRs 分析了枳属28 个枳品种的遗传多样性及它们与近缘柑橘属的亲缘关系。叶绿体基因组SSR 分析则发现普通枳间基本无差异，表明以母系遗传