ultra-centrifuge超速离心.ppt

超离心实验技术分子生物学研究手段之一 您真正了解离心分离的原理吗 您知道如何正确的使用离心机吗 您知道如何利用现有的文献 使用现有离心设备离心吗 四种超离心转头 应该使用哪种转头分离我的样本 又该如何分离 哪些不当使用会导致离心机出现故障 您了解吗 系统生物学的研究是这时代最令人关注的前沿研究方向 它所研究的已经不是某一个特定的基因 蛋白或细胞的功能 而注重将基因组 蛋白组 细胞生物学作为一个整体来研究 看看它们在生命状态及特定条件下的相互作用 从而进一步认识生命本身 揭示疾病的发生发展过程 为新药的开发提供更精确的信息和技术平台 在整个系统生物学的研究过程中 离心技术可说是 无处不在 不论在核酸 蛋白还是细胞 我们都可以使用不同的离心机 不同的离心技术作分离的工具 此外 离心机更可作分析的手段 蛋白的结构 蛋白与蛋白或小分子的相互作用及分子量的测定等等 这都是分析超速离心机可以帮助科学家进一步研究蛋白的不同层面 所以 离心技术可以说是整个系统生物学研究不可缺少的重要部分 内容 重要参数转头的介绍离心技术的选择不同生物样本的分离模式 重要参数离心力 离心力才是样本分离的重要实验参数离心技术的基本功能是将不同大小的颗粒从溶液中分离 对于生物医学样品来说 颗粒意味着像细胞 细胞器 病毒 核酸或大分子之类的东西 如蛋白 由于不同颗粒的沉降系数各异 分离所需的时间亦有不同 而时间的长短就大大取决于分离时作用在颗粒上的离心力 因此 在众多的参考文献中都是以离心力 gforce 作为实验参数的说明而非转速 rpm 因此 体现离心机最高功能的指标就是离心力 重要参数相对离心力 g 离心分离时 作用在悬浮颗粒上的力常用相对离心力数值来表示 这就是说 同一颗粒在离心时同地球重力相比较后得到值称为相对离心力 RCF RCF 离心力 重力 m 2x mg 2x gRCFmax 1 12rmax RPM 1000 2OrRPM 103 RCF 1 12rmaxr 旋转中心至转头内离心管某一部分的半径 以mm为单位 RPM 转头每分钟旋转的转数 离心力的大小与旋转速度以及旋转半径成正相关性 下图为离心管在不同类型转头中的Rmax及Rmin 重要参数RCF与RPM的关系 RCFmax 1 12rmax RPM 1000 2RPM 103 RCF 1 12rmaxt1 RCF1 t2 RCF2 重要参数沉降系数 颗粒在单位离心力的作用下的移动速度称沉降系数S dx dt 2xdx 颗粒与转子中心之间的距离 dt颗粒沉降所需时间 2x角速度与转子半径1S 1 10 13S 例 10S 10 10 13S沉降系数以秒为单位 其物理意义是被测定颗粒达到极限速度时所需时间 换句话说 如100S的颗粒 从原来静止状态 速度等于零 在加速经过100 10 13S的时间后 颗粒便达到极限的速度 重要参数沉降系数 如何计算沉降系数 V d2 Pp P g 18uv 颗粒沉降速度d 颗粒直径Pp 颗粒密度P 溶液密度u 溶液介质粘度g 重力 重要参数沉降系数 生物颗粒及大分子的沉降系数 重要参数沉降系数 Table Sedimentationcoefficientsofmarkermolecules 重要参数沉降系数 几种蛋白质的物理性质 重要参数沉降系数 重要参数沉降系数 OptimaMAX是现时唯一超过一百万离心力 1 019 000 g 的超速离心机 比其他厂家高出100 000 g 因此可以覆盖广泛应用 MLA 130定角转头 离心力高达1 019 000 g 重要参数沉降系数 沉降系数 S 参考表蛋白 酶 肽2 25S核酸3 100S核糖体20 200S病毒40 1000S溶酶体4000S细胞膜100 100 103S线粒体20 103 70 103S细胞核4000 103 40000 103S OptimaMAX实验时间参考蛋白质的区带分离时间 1小时病毒分离 1小时亚细胞组分分离 20分钟内细胞膜分离 15分钟RNA分离 1小时以氯化铯进行质粒DNA提取 30分钟脂蛋白分离 2 5小时 重要参数k因子 离心时间的计算 K因子与每个转头的离心效率有关 可以用于推算颗粒经过水溶液形成沉淀所需要的时间 小时 离心头的K值一般由出售离心机公司提供 知道k因子和S值 沉降系数 就可以计算出离心时间t K S提供的k因子是指最高速度时的k值 但并不是所有的离心都在最高速度 减低速度后所需的离心时间 则应Kadj K reterspeedofrotor runspeed 2由上可以看出k值越小 离心时间短 离心头的离心效率高 k值越大 离心时间长 离心头的离心效率低K Inr2 Inr1 2 5 1011 r min 2 r1 最小半径 r2 最大半径 重要参数 转头的性能指标 能形成的RCF k因子 根据此值可以算出沉降已知S系数的颗粒所需的时间t K SK1 t1 K2 t2 如在甲转头中沉降某种颗粒所需时间为t1 可根据下式算出在乙转头中沉降同样颗粒所需时间t2t2 K2 t1 K1 t1 RCF1 t2 RCF2t2 t1 RCF1 RCF2 重要参数 离心转头的减速计算离心转头只能在样品密度不超过厂家设计的密度 一般为1 2g cm3 也有为1 7g cm3 时 才可采用最高速度 在离心高于规定密度的样品时要减速 对水平离心转头尤为重要 用下列公式可计算出在所用样品密度时应采取的最高离心速度 Qd Qn D E D为离心转头设计的密度 E为离心样品的密度 Qn是正常最高离心速度 Qd是所求的离心速度 重要参数 颗粒在介质中的速度大小同下列因素有关沉降速度大小与颗粒直径的平方 d2 成正比沉降速度与颗粒密度同介质密度之差 Pp Pm 成正比 当颗粒密度等于介质密度时 沉降速度接近于零沉降速度与外加离心场 2X 成正比沉降速度ui介质粘滞度成反比 随着粘滞度增加速度减慢沉降速度与颗粒形状有关 当颗粒偏离球形越大 则f f0的摩擦比也越大 导致速度减慢 f f0非球形颗粒受到阻力f与同等体积球形颗粒受到的阻力相比的值 归纳 离心方法已被广泛地应用于生物化学 生物物理学 细胞学 分子生物学和医学研究之中 分离细胞或其他的悬浮颗粒 去除细胞周围的杂质 从混有多种细胞的悬浮液中分离出来某一细胞 从组织匀浆中分离各种细胞器 包括细胞核 线粒体 叶绿体 高尔基体 溶酶体 过氧化酶体 质膜 内质网和多聚核糖核蛋白体亚单位等等 分离病毒和大分子 包括DNA RNA 蛋白质和脂类 测定大分子的物理参数 如沉降系数 分子量 浮动密度和扩散系统等 通过离心分离或离心分析有的可直接获得有关细胞 细胞器 病毒和生物大分子的信息 有的为进一步作化学分析 生物学功能测定以及形态学上观察超微结构提供了基础 归纳 超速离心超速离心是生物化学和分子生物学不可缺少的技术手段 广泛应用于大分子 细胞 细胞器等的分离 纯化 根据不同的目的 可以采用不同的方法和技术 溶液经过超速离心可以分为上清与沉淀 但得到的沉淀与上清都是不均一的 前者含有最初溶液中所有的颗粒 而后者也仍含有少量的颗粒 但其大小必沉淀颗粒要小得多 这样得到的上清 可进一步用更高速度的离心来分离其中的成分 称为差速离心 如需得到纯的物质 则应采用分析超离技术 应用密度超速离心可以了解物质的某些物理性质 如沉降系数及近似密度并得到一定量的较纯物质 细胞结构 真核细胞结构 典型的植物细胞 典型的动物细胞 转头 转头时离心技术的核心利用离心转头分离样本 除了离心机是必需之外 转头也是不可缺少的内容 要达到良好的分离效果 转头的选择是非常重要的 样品分离后的纯度 分离的时间及转头类别的关系大致如下 纯度 分离速度 垂直转头 近垂直转头 固定角转头 水平转头 转头 Table Typeofrotorsandtheirapplications aNVTrotorsarenotrecommendedforpelletingsamples 离心方法 差速离心法等密度梯度离心法速率区带法 密度梯度离心 离心方法 差速离心法 差速离心法 differentialcentrifugation 特点 最常用的方法操作简便 但其分离的纯度不高 基本原理 逐次增加离心力 每次可沉降样品溶液中的一些组分 在这种方法中 离心管在开始时装满了均一的样品溶液 见图 通过在一定速度下一定时间的离心后 就可得到两个部分 沉淀和上清通常在第一次离心时把大部分不需要的大粒子沉降去掉 这时所需的组分大部分仍留在上清液中 然后将收集到的上清液以更高速度离心 把所需的粒子沉积下来 离心的时间要选择得当 使大部分不需要的更小粒子仍留在上清液中 对于得到的沉淀和上清液可以进行进一步的离心 直至达到所需的分离纯度为止 离心方法 差速离心法 差速离心后的细胞组分 组织样品的亚细胞分离 离心管中离心前后的样品 离心方法 差速离心法 固定角转头 离心方法 密度梯度离心法 密度梯度离心法 densitygradientcentrifugation 特点 可以同时使样品中几个或全部组分分离 具有很好的分辨率这方法在操作上比差速离心稍为负责 但可以补偿差速离心之不足 共有两种不同方法 速率区带法 rate zonal 等密度离心法 Isopyonic 离心方法 区别沉降速度离心和沉降平离心 离心方法 速率区带法 速率区带法基本原理 根据样品中不同粒子所具有的不同尺寸大小及沉降速度 S 来分离 样品粒子的密度必须大于梯度溶液中任一点的密度 而离心过程必须在区带到达管子底部前停止在分离过程中 见图 1 在离心管中装入密度梯度溶液 溶液的密度从离心管顶部至底部逐步增加 正梯度 2 将所需分离的样品小心地加至密度梯度溶液的顶部 样品在梯度溶液表面形成一负梯度 3 由于不同大小的粒子在离心力作用下梯度中移动的速度不一样 所有经过离心后 会形成几条分开的样品区带 离心方法 速率区带法 速率区带离心常用的介质 离心方法 速率区带法 等密度梯度介质的应用 很好 好 可以 不适用 离心方法 速率区带法 各种大分子在蔗糖梯度溶液中的大约密度 离心方法 速率区带法 离心方法 速率区带法 梯度形状的选择 梯度形状对于分离是否成功非常重要 下图列举了常用的梯度形状 1 线形密度梯度 分离蛋白质 酶 激素 核糖体和一些植物病毒有良好的分离效果 2 向下凹的梯度 适用于脂蛋白或一些需要上浮分离的样品 3 不连续或阶梯式梯度 最适用于分离整个细胞 植物或动物组织匀浆中的亚细胞组分 以及纯化一些哺乳动物病毒或昆虫病毒 此外 等速梯度是指这样一种梯度 其中粒子的沉降速度和梯度液柱的长度无关 各区带沉降速度不变 常用的5 20 蔗糖线形梯度就是这样一种梯度 巨大分子如核糖亚基 多核糖体以及一些植物病毒 需要一种陡峭以及长液柱以增进分离能力 样品铺置到梯度液柱上去的方法 Distancefrommeniscus mm Conditionsfordensitygradientseparations 加样 阶梯梯度分离效应 转头 水平转头 从鼠肝匀浆的组分经不连续蔗糖梯度纯化的亚细胞组分 不同细胞器纯度鉴定 电子显微镜下的形态学 morphology 鉴定 标志酶鉴定 测定为某种细胞器所特有的某种专一的酶 这种酶不存在于细胞的其他部位 过氧化氢酶 过氧化氢酶体琥珀酸脱氢酶 线粒体组织蛋白酶C 胞质溶胶酸性磷酸酶 胞质溶胶碱性磷酸酶 质膜 离心方法 等密度离心法 基本原理 根据粒子的不同密度来分离 离心过程中 粒子会移至与它本身密度相同的地方形成区带 在分离开始前 样品可与梯度介质混合在一起 或铺在密度梯度液上面 在离心力的作用下 梯度物质在离心管中重新分布 因而形成了所需要的浓度 和密度 梯度 同时 样品颗粒 开始时就分布在整个管子中的 沉降或悬浮到它们的等密度位置上 见图 这种自我生产梯度技术 常常需要很多小时的分离 例如 等密度DNA带在氯化铯自我形成梯度情况下 就需要36 48小时 特别要注意 增进转速并不能缩短运转时间 其结果只是改变了在离心管中带的位置 因为在更大的离心力下 梯度物质将重新分布而更进一步的下到管底部 而密度梯度的选择要使梯度的范围包括所有待分离粒子的密度 垂直转头 a b Centrifugalforce 固定角转 水平转头CsCl自成梯度状况 Bottom Top ShortTechnicalReports 细胞分离的假象问题 1 细胞凝块 凝聚 现象 影响纯化 降低回收率 采用低细胞浓缩 增进组合 白蛋白 血清 DNase 减少凝胶化 蛋白酶或EDTA于介质中 工作于4 减少凝块 例 窦状活细胞 分离初期遭受到凝块 可采取工作稳定大约20 细胞分离的假象问题 2 含有细胞样品液超负载合适的细胞数量 不能超过梯度液容量 超负载细胞梯度液会造成宽区带 表面粘团 细胞沉淀 细胞分离的假象问题 3 壁效应 离心管不平行离心管 固定角转头 由于本身密度梯度增进 引起干扰梯度的稳定性 增长从旋转中心到离心管间距梯度 减少壁效应 细胞丧失 水平转头 细