改HCCB13086代谢产物的分离检测-赵绅宝20150623.doc

山东建筑大学毕业论文HCCB13086代谢产物的分离纯化题 目：HCCB13086代谢产物的分离纯化院 （部）：市政与环境工程学院专 业： 生物工程班 级： 生物工程112姓 名： 赵绅宝学 号： 2011041181指导教师： 钟传青 殷瑜（上海交通大学）合作单位： 上海交通大学药学院完成日期： 2015年6月20日目 录目 录I摘要IIABSTRACTIII第一章 前言- 1 -1.1研究背景- 1 -1.1.1纳他霉素的结构与理化性质- 3 -1.1.2纳他霉素活性与稳定性研究- 5 -1.1.3纳他霉素的检测方法- 6 -1.2纳他霉素的分离纯化方法- 9 -1.2.1相关分离纯化方法介绍- 9 -1.2.2纳他霉素的分离提取方法概述- 12 -1.3本次实验的相关检测方法- 13 -1.3.1超高效液相色谱（UPLC）- 13 -1.3.2质谱（LC-MS）- 15 -1.3.3二级质谱（MS/MS）- 15 -1.4本文的研究目的、意义- 16 -第二章 工程菌的构建与验证- 18 -2.1主要实验材料- 18 -2.2实验方法- 19 -2.2.1 导入目的基因的具体方法- 19 -2.2.2 vgb改造菌的扩增与DNA的提取与检测- 23 -2.2.3实验结果- 24 -2.2.4 vgb工程菌表达验证- 25 -2.2.5 实验结果- 25 -第三章 HCCB13086菌代谢产物的分离检测- 27 -3.1实验材料- 27 -3.2试验方法- 28 -3.2.1 纳他霉素产生菌的溶氧验证- 28 -3.2.2实验结果- 28 -3.2.3种子培养- 31 -3.2.4实验结果- 31 -3.2.5大量发酵并回收样品- 32 -3.3分离检测实验结果及分析- 33 -3.2.1 HPLC半制备- 33 -3.2.3UPLC-MS检测- 34 -第四章 总结- 41 -致谢：- 42 -参考文献- 43 -摘要纳他霉素是一种二十六元环的多烯大环内酯类天然抗真菌药物，已广泛用于生物性食品防腐剂和人体抗真菌感染药物。褐黄孢链霉菌(Streptomyces gilvosporeus)是生产纳他霉素的主要菌种。本文首先通过UPLC-MS对S. gilvosporeus HCCB13086的代谢产物分析发现，该菌除了产生次级代谢产物纳他霉素外，还产生其他一些物质，经过数据库Sciencefinder分析发现分子量为681的物质为一新化合物。为了进一步阐明该化合物的结构以及其与纳他霉素的相关关系，试图对其进行分离纯化、结构解析，但并未获得单一化合物，通过二级MS对该化合物解析推断其为纳他霉素的结构类似物13-OH-natamycin。通过考察发酵溶氧水平对褐黄孢链霉菌(S. gilvosporeus ) HCCB13086的产抗能力时，发现纳他霉素的产量跟溶氧呈正相关。为了克服溶氧的限制性素，利用异源表达透明颤菌血红蛋白vgb基因的方法，试图提高HCCB13086产纳他霉素的能力。将vgb的整合质粒pSET-ermEP-vgb通过属间接合转移的方法将去甲基化的的质粒转化入S. gilvosporeius中，利用抗性筛选可能的接合子，通过菌落PCR进行验证获得vgb过表达菌株S. gilvosporeius-vgb。通过发酵检测纳他霉素产量发现，S. gilvosporeius-vgb的纳他霉素产量较对照明显提高。关键词：褐黄孢链霉菌；纳他霉素；新化合物；透明颤菌血红蛋白；异源表达褐黄孢子链霉菌 ；分离检测； Separation and purification of biological metabolites of HCCB13086ABSTRACTStreptomyces gilvosporeus is the main strain of production of natamycin. Natamycin is a polyene macrolide a twenty-six membered ring of natural antifungal drug, which has been widely used in biological food preservative and human anti fungal drugsIn this study，above all,we find that，besides the bacteria produce secondary metabolites of natamycin, S. gilvosporeus also produced some other substances, through the database Sciencefinder analysis showed that the molecular weight of 681 material is a new compound by UPLC-MS . In order to further elucidate the structure of the compound and its relationship with Namibia natamycin, to carry out separation and purification, structure analysis, but did not get a single compound, by two MS on the compound analysis it was concluded that the nano structure of natamycin analogs.Through the investigation of dissolved oxygen level on the fermentation of Streptomyces brown spores (S. gilvosporeus) HCCB13086 producing resistant ability, found that the natamycin yield was positively correlated with the dissolved oxygen.Oxygen deficiency is a critical factor during the fermentation production of natamycin. In order to alleviate oxygen limitation and enhance the yield of natamycin, the vgb gene, encoding Vitreoscilla hemoglobin (VHb) was inserted into pSET-ermEP-vgb with its native promoter and integrated into the chromosome of Streptomyces gilvosporeus . The VGB integrated plasmid pSET-ermEP-vgb via intergeneric bonding method transfer will to methylated plasmid transformed into S. gilvosporeius, using resistance screening possible zygote, by colony PCR to verify the obtained VGB over expression strain s. gilvosporeius-vgb. The fermentation yield of natamycin was S. gilvosporeius-vgb, the yield of natamycin could significantly improve.Key Words: Vitreoscilla hemoglobin；Streptomyces gilvosporeus ；separation and testing；II第一章 前言1.1研究背景纳他霉素(Natamycin)也叫匹马菌素是一种近白色或奶油黄色结晶粉末。它是一种二十六元多烯大环内酯类抗生素,由纳塔尔链霉菌(Streptomyces natalensis)、恰塔努加链霉菌(Streptomyces chatanoogensis)和褐黄抱链霉菌(Streptomyces. Gilvosporeus)等经发酵生产,是一种高效、广谱的抗真菌抗生素而且纳他霉素对哺乳动物细胞的毒性极低。其是一种无臭、无味，低剂量且安全性高的食品防腐剂。纳他霉素(Natamycin)，是由纳他链霉菌受控发酵制得一种白色至乳白色的无臭无味的结晶粉末，通常以烯醇式结构存在。它的作用机理是与真菌的麦角甾醇以及其他甾醇基团结合，阻遏麦角甾醇生物合成，从而使细胞膜畸变，最终导致渗漏，引起细胞死亡。在焙烤食品用纳他霉素对面团进行表面处理，有明显的延长保质期作用。纳他霉素一般是由好氧链霉菌产生所以需要大量的供氧来维持它的代谢。这种抗生素不仅可以有效抑制酵母菌和霉菌，同时对丝状真菌也有很好的作用如表1.1真菌对纳他霉素的敏感性。由于其对广谱的抗真菌特性和对哺乳动物的低毒性，纳他霉素已经通过认证被作为食品添加剂使用，并被归为级。所以，纳他霉素已经广泛的使用在了食品工业中，用于保护霉菌发酵的奶酪和其他非灭菌环境下的食品，例如，香肠，火腿等。还有作为高效的广谱抗真菌生素，纳他霉素北港烦的应用到人类的抗真菌药物中。虽然纳他霉素在食品、医疗等领域显示了良好、广阔的应用前景,但目前世界上仅有美国和荷兰的几家公司在生产和销售纳他霉素,而国内的发展还处于起步阶段,仅有北京营养源研究所、天津科技大学等正在开发此产品。由于纳他霉素的发酵水平较低,导致成本太高,所以,国内主要依靠进口,还无法实现大规模生产,这样就严重限制了纳他霉素的应用。因此,对其展开研究和进行产品开发不仅具有重大的现实意义,也能创造良好的经济效益。因此,对纳他霉素发酵进行深入的研究和开发具有有重要的实际意义。由于纳他霉素是一种主要通过放线菌合成的抗生素，所以在发酵过程中很可能会由于丝状菌的生长特性经常导致培养基表现出过高黏性和低可塑性的非牛顿流体，从而降低了氧气在发酵液中的溶解浓度。因为纳他霉素的过生物合成过程中有多步的加氧过程，另外，一些酶在纳他霉素的合成路径上也是需要大量的氧，例如， P450 epoxi-dase (Mendes et al. 2005)和cholesterol oxidase (Mendeset al. 2007)。虽然这样的情况可以通过加快搅拌速度来减轻，但是过高的转速会给细胞带来很多的物理损伤降低抗生素的产量。工业上提高溶氧的方法通常是增加转速或增大通氧量这种物理方法，但剪切力过高则会导致菌体形态受损而降低代谢产物量。所以近年来，越来越多的研究聚焦于分子生物学手段来增加菌体携氧量，从而提高纳他霉素的产量。然而，一般的方法不能满足菌种在工业发酵生产中的应用。因此在整个纳他霉素工业发酵中，溶氧度是一个非常重要的限制因素，这样就可以解释为什么限氧条件下，纳他霉素的产量会下降。 表1.1真菌对纳他霉素的敏感性Table1.1 The sensitivity of the fungus to the natamycin透明颤菌血红蛋白（Vitreoscilla hemoglobin，VHb）是源于一种专性好氧的革兰氏阴性菌透明颤菌（Vitreoscilla stercoraria)的代谢产物,VHb在贫氧的条件下能被大量诱导合成，由于具有结合和传递氧的特性，VHb已成为应用广泛的一种血红蛋白。透明颤菌是一种专性好氧的革兰氏阴性丝状菌，属于贝日阿托氏菌属（Beggiatoe），在沼泽、腐烂植物等贫氧的环境中生长旺盛。VHb在透明颤菌中被发现，最初被认为是“细胞色素o(cytochrome o, Cyo)”蛋白，具有末端氧化酶的性质。Cyo在不同的环境条件下可呈现三种不同的状态，即氧化态、还原态、氧合态，并可以相互转化；其中还原态是生理活性态，而氧合态则是富氧条件下的表现形式。它在577、544和420 nm处有最大吸收峰，若向溶液中鼓入CO气体，则可形成蛋白-CO复合物，在566、535及419 nm处呈现特征吸收峰。为了达到可以提高纳他霉素产量的目的，将vgb的整合质粒pSET-ermEP-vgb通过属间接合转移的方法将去甲基化的的质粒转化入S. gilvosporeius中，利用抗性筛选可能的接合子，通过菌落PCR进行验证获得vgb过表达菌株S. gilvosporeius-vgb。Shaohua Wang在2014年的文章中报道过，他们成功的将vgb基因导入了宿主细胞一株普通的经过诱变后的S. gilvosporeus SD-807的纳他霉素高产菌中并且成功的表达了血红蛋白，证明了VHb血红蛋白能够提高细胞内的溶氧浓度，并且成功的提高了宿主的代谢产量。细菌通过摇瓶培养成功的将纳他霉素从3.31g/L提高到8.24g/L的培养量，这个结果是要比其他相关报告中所得到的结果要高很多，特别是LUO(2012)他们的研究，他们通过基因重组技术只将纳他霉素的产量提高到了4.69 g/L。所以加入此段基因对提高纳他霉素的实际生产是相当有必要的。 对菌种基因的定向改造同时也会对菌种的代谢路径产生很多的影响，因此，对改造后的菌种发酵产物和产物的相关同系物的研究也是非常重要的，尤其是对药用类的微生物有着重要的实际意义，同时，对其在将来投入使用后也有着非常重要的实际意义。1.1.1纳他霉素的结构与理化性质纳他霉素外观呈白色或奶油色,为无气味、无味道的白色结晶粉末,含有三分子以上的结晶水。它是一种多烯大环内醋类化合物,分子式为,分子量为665.73。其化学结构如图1.1所示。由图可知,纳他霉素具有一个26元的内酷环,环外有一个糖昔键连接的碳水化合物基团,即氨基二脱氧甘露糖。分子中还含4个共辆双键的多烯发色团,其中四烯系统是全顺式。图1.1 纳他霉素结构图Fig1.1 Structure of Natamycin 纳他霉素是一种两性物质,分子中有一个碱性基团和一个酸性基团,电离常数pKa值分别为8.35和.46,1967年,Raba报道纳他霉素的等电点为pH.65,熔点为280。纳他霉素在结构上存在两种典型构型:烯醇式结构和酮式结构,这就决定了它在许多溶剂中的低溶解性。纳他霉素不溶于非极性溶剂,溶于稀酸,冰醋酸及二甲基甲酞胺。在水中或低级醇中的溶解度很低,在中性pH下溶解度最低,但随着pH降低或升高而增加;而在pH值低于3或高于9时,溶解度显著增大。纳他霉素在各种溶剂中的溶解度见表1.2纳他霉素的溶解度。表1.2 纳他霉素的溶解度Natamycin of Solubility溶剂溶解度g/100ml水0.005-0.01乙醇0.01乙醇80%+水20%0.07丙二醇1.4-2.0丙三醇1.5甲醇3.3二甲基甲酰胺5.0冰醋酸18.51.1.2纳他霉素活性与稳定性研究纳他霉素是一种相对稳定的化合物,室温下保存几年只有很小部分失去活性。其三水化合物同样稳定,但无水形态较不稳定,在室封闭的瓶子中保存48小时后失去15%的活性。纳他霉素溶液在室温下稳定且活性最强,其分解过程见图1.1。纳他霉素溶液甚至能在100条件下稳定1到3小时(中性溶液约为3小时,酸性溶液约为l小时)。纳他霉素在含水乙醇中结晶,形成细长强烈双折折射针形,有平行的消光性和正的延伸率。其活性的稳定性受pH、温度、光照强度、氧化剂及重金属等条件的影响,所以,产品应避免与氧化物和硫氢化合物等接触,同时应存放在玻璃、塑料和不锈钢的容器中,也可以添加EDAT或聚磷酸盐来防止失活。以下为不同因素对纳他霉素的影响。图1.2纳他纳他霉素溶液的分解过程Fig1.2 Decomposition of natamycin solution1）pH值pH值对于纳他霉素的抗真菌活性没有明显影响。纳他霉素在pH值3-9内具有活性,在pH值5到7范围时活性最强。即使pH低于3或高于9,其抗真菌活性损失也不会超过30%。纳他霉素在大部分食品的pH范围内非常稳定,在极端pH值下会迅速失活,形成各种各样的分解产物。在低pH值时其主要的裂解产物是海藻糖胺;在高pH值时,如pH=12时,由于内酷皂化可形成纳他霉酸,用强碱处理导致进一步的分子破裂。2）温度纳他霉素具有一定的抗热处理能力,在室温条件下稳定,50放置几天或100短时处理,其活性几乎无损失。120条件下加热不超过lh仍能保持纳他霉素的部分活性。3）光照由于具有环状化学结构,在紫外线下分解,失去四烯结构。r射线也能使纳他霉素分解。4）氧化剂纳他霉素不宜与氧化剂如过氧化氢、漂白粉等接触,否则抑菌活性会明显下降。防止氧化的办法是添加抗氧化剂,如叶绿素、抗坏血酸、丁基轻基茵香醚、丁基甲苯等。5）重金属一些金属离子可以促进纳他霉素的氧化失活,尤其是铁、铅、汞等重金属。1.1.3纳他霉素的检测方法在纳他霉素产生菌的菌种选育和发酵工艺研究过程中,需要建立一种对纳他霉素组分和含量的快速检测方法。目前,纳他霉素的分析方法主要有分光光度计分析法、比色分析法、元素分析法、微生物分析法、色谱分析法、滴定分析法及电泳分析法等。由于干扰纳他霉素分析的因素较多,各种方法各有优缺点,应根据具体情况合理选择。1）生物检测法纳他霉素效价的生物检测法主要采用管碟法。管碟法利用抗生素在琼脂培养基中的扩散渗透作用,将己知浓度的标准溶液和未知浓度的样品在含有敏感性实验菌的琼脂表面进行扩散渗透,由于对被试菌的抑制作用而产生抑菌圈,抑菌圈的大小和抗生素的浓度之间有一定的比例关系。生物检测法利用抗生素抑制敏感菌的特点,符合临床使用的实际情况,而且灵敏度高,不需要特殊处理,因此被国际公认。纳他霉素的生测法是利用酵母菌ATCC9763作为测试微生物,用琼脂扩散法分析,这种方法被推荐用于溶液、物质浸出物中,制剂形式或生物材料中纳他霉素的测定,琼脂扩散法的敏感性接近0.5mg/L。2）紫外分光光度法采用紫外分光光度测定法,在3O3nm处可以测定纳他霉素的含量,称其为一点法,但该方法不能精确定量纳他霉素的生物活性。依据在303nm的最大吸收值,以及在295nm和311nm的吸收值,可以测定纳他霉素的含量,该法称为基线法,基线吸收可用下式计算:在含有0.1%醋酸的甲醇中纳他霉素的紫外光谱,乙酸作为波长稳定剂。纳他霉素的紫外光谱显示,在=290、303、318nm处有尖锐的最大吸收峰,在220nm处有宽峰,可以把它同制霉菌素和两性菌素区分开。在280-32nm之间出现的吸收峰是由于具有四烯环的性质。RetourisDJ等人研究了紫外分光光度计法分析奶酪和奶酪皮中的纳他霉素的方法。检测样品与酸性水合乙氰混匀,过滤,滤液在322.6nm下直接测定,测定范围.05-20mg/kg,可得到较好的线性关系(r=0.9988)。3）高效液相色谱法高效液相色谱法(HPLC)比紫外分光光度法具有更高的选择性,而且具有操作简单、精密度高等优点,已广泛应用于检测食品中残留的纳他霉素含量。该法检测纳他霉素时大部分采用反相柱,纳他霉素在303nm左右有最大吸收峰,故检测器采用UV检测器常见流动相如表1.3所示。1998年,王克利等人利用冰醋酸:水(5:40)直接提取沙拉酱中的纳他霉素,离心分离后在高效液相色谱上于波长305nm处进行测定。方法操作简易,精密度CV=2.4%;线性范围010ug/ml。也有以乙酸胺和氯化胺的水溶液、四氢吠喃和乙睛为流动相,用反相色谱进行纳他霉素检测的报道。表1.3 HPLC法测纳他霉素常用的流动相Table1.3 The usual mobile phase of the determination of natamycin by HPLC流动相配比甲醇水65:35甲醇水冰醋酸48:32：1甲醇水冰醋酸60:40:5甲醇水四氢呋喃44:47:2（含1%醋酸氨）甲醇水磷酸55:45:3乙腈30mM高氯酸35:65（PH1.6）4）比色分析法纳他霉素在强盐酸作用下瞬间显示蓝色,自身形成阳离子。在水浴中,四体积的甲醇(含30、90ug/mL的纳他霉素)中加入十体积的含20%乙醇的盐酸,1315min后,在635nm处测定其吸收。这种蓝色不遵守Beers法则,一定量的酸和纳他霉素的碱降解产物不会干扰测定。更敏感的测定(420ug纳他霉素/mL)是基于纳他霉素在氨基苯乙酮存在下,碱水解产物形成一种红色的发色团,但糖和纳他霉素的碱分解产物会干扰测定结果。5)元素分析法及滴定分析法由于干扰组分的存在(如灰分、有机不纯物、溶剂的结晶等),元素分析法实验数据与理论组分间往往产生不一致。有的实验值和理论值间相符得很好,有时误差却较大。滴定分析法是在冰醋酸的非水介质中,用高氯酸电势滴定检测纳他霉素。纳他霉素的滴定与通过电导分析法形成离子对的阳离子表面活性剂有关。纳他霉素的分析干扰因素较多,其中分光光度计法、比色法和滴定法较为简单,但是结果不能排除干扰因素的影响,难以精确定量;微生物分析法较为直观,操作也不复杂,易于在实验室实现;高压液相色谱法测定的结果较为准确,一次性设备投资较大。1.2纳他霉素的分离纯化方法1.2.1相关分离纯化方法介绍1）扩张床吸附层析技术有高性能和高效性，在过去几十年成为主要的分离技术之一用于生物技术工业纯化生物分子。扩张床吸附是一种创新的层析方法，集澄清，浓缩，粗纯化于一步。因此，扩张床的孔隙率随着流体速率的增加而增加。大的颗粒间空隙部分使得包含微粒物质如细胞，细胞碎片和别的可能的细小颗粒的粗原料穿过而不破坏扩张床。一般，扩张床吸附技术能够减少工艺步骤，于是减少加工时间，增加工序的产量和总的成本高效益。比较经典的填充床吸附层析，扩张床层析使用专门设计的吸附剂，这种吸附剂在有向上液相的柱子里扩张完美地形成分类的流化床（术语扩张床）。扩张床的柱子被设计用于在柱的入口提供均匀的液相分布，且柱的顶端接头被设计允许柱子在不同的床高度操作。固体材料是商业可得的，比如流线型的基于6%交联度的琼脂糖的一系列吸附剂含有透明的晶核作为增浓剂。颗粒的尺度在100-300m之间，平均浓度大约1.2g/ml。流线型吸附剂的物理性质表明它能用于流速在200-400cm/h的水中，相应的膨胀系数2-3。扩张床应用的增加主要是通过特殊设计的柱子，固体基质在确定的大小和浓度的有效性和配体化学在基质中的应用。用于扩张床工序的完美的吸附剂被设计去得到最大生产率，吸附剂有高的动力学能力，允许最小的原料稀释。有两个方法增加吸附剂在扩张床中的合适的操作流体速率：增大颗粒大小和浓度。需要高浓度的基质用于在高流速下的稳定操作，合适的大小分布对减小柱中的混合很有作用。为了保证扩张床的效能，在合成基质时应考虑吸附能力和的质量转移特性。为了形成稳定的扩张床，吸附剂应该被分类在柱子上且扩张系数一般保持在2-3的范围。同样，另外的一些无规则形状的基质被提供可能导致不稳定的扩张行为，大颗粒的尺寸超过600m要求长的物质运输距离因此减慢了吸附动力。虽然近些年来扩张床柱子基本的设计没有改变，但许多薄膜大孔径，高浓度和聚合物包裹的基质已经被发展和应用在扩张床上。更加优良的支持基质已被生产，更稳定的用不同的配体制造的多功能的吸附剂，比如离子交换，固定化金属亲和染料配体亲和吸附剂。2）分配色谱分配色谱利用固定相与流动相之间对待分离组分溶解度的差异来实现分离。分配色谱的固定相一般为液相的溶剂，依靠图布、键合、吸附等手段分布于色谱柱或者担体表面。分配色谱过程本质上是组分分子在固定相和流动相之间不断达到溶解平衡的过程。3）离子交换色谱离子交换色谱利用被分离组分与固定相之间发生离子交换的能力差异来实现分离。离子交换色谱的固定相一般为离子交换树脂，树脂分子结构中存在许多可以电离的活性中心，待分离组分中的离子会与这些活性中心发生离子交换，形成离子交换平衡，从而在流动相与固定相之间形成分配。固定相的固有离子与待分离组分中的离子之间相互争夺固定相中的离子交换中心，并随着流动相的运动而运动，最终实现分离。4）凝胶色谱凝胶色谱的原理比较特殊，类似于分子筛。待分离组分在进入凝胶色谱后，会依据分子量的不同，进入或者不进入固定相凝胶的孔隙中，不能进入凝胶孔隙的分子会很快随流动相洗脱，而能够进入凝胶孔隙的分子则需要更长时间的冲洗才能够流出固定相，从而实现了根据分子量差异对各组分的分离。调整固定相使用的凝胶的交联度可以调整凝胶孔隙的大小；改变流动相的溶剂组成会改变固定相凝胶的溶涨状态，进而改变孔隙的大小，获得不同的分离效果。5）亲和色谱亲和色谱也称为亲和层析，是一种利用固定相的结合特性来分离分子的色谱方法。亲和色谱在凝胶过滤色谱柱上连接与待分离的物质有一定结合能力的分子，并且它们的结合是可逆的，在改变流动相条件时二者还能相互分离。亲和色谱可以用来从混合物中纯化或浓缩某一分子，也可以用来去处或减少混合物中某一分子的含量。6）高压液相色谱（HPLC）高效液相色谱法（英语：high performance liquid chromatography，缩写 HPLC），又译高效液相层析法，以前曾指高压液相层析法（high pressure liquid chromatography），是一种色谱分析技术，用来分离混合物，以确认并量化各个成分的比例。它依赖泵加压样品以令其通过填充有吸附剂的压力柱，导致样品的各个成分因而分离。高效液相色谱法常用于生物化学和分析化学。高效液相层析仪根据各种各样的化工互作用力来分离混合物。这种互作用力通常是分析物及分析管柱之间的一种非共价性质。使用高效液相色谱时，液体待检测物在不同的时间被注入色谱柱，通过压力在固定相中移动，由于被测物种不同物质与固定相的相互作用不同，不同的物质顺序离开色谱柱，通过检测器得到不同的峰信号，每个峰顶都代表一个另外化合物的种类，最后通过分析比对这些信号来判断待测物所含有的物质。以液体为流动相而设计的色谱分析仪器称为液相色谱仪。采用高压输液泵，高效固定相和高压灵敏检测器等装置的液相色谱仪成为高效液相色谱仪。高效液相色谱仪种类繁多，但不论何种类型的高效液相色谱仪，基本上都分为4个部分：高压输液装置，进样系统，分离系统和检测系统。高效液相色谱作为一种重要的分析方法，广泛的应用于化学和生化分析中，常用于医药品、化学、环保、生命科学、与食品工业的研究上。高效液相色谱从原理上与经典的液相色谱没有本质的差别，它的特点是采用了高压输液泵、高灵敏度检测器和高效微粒固定相，可将液体混合物中的成分分离、成分定性及定量分析。适于分析高沸点不易挥发、分子量大、不同极性的有机化合物。制备型高效液相色谱仪色谱法的应用可以根据目的分为制备性色谱和分析性色谱两大类。制备性色谱的目的是分离混合物，获得一定数量的纯净组分，这包括对有机合成产物的纯化、天然产物的分离纯化以及去离子水的制备等。相对于色谱法出现之前的纯化分离技术如重结晶，色谱法能够在一步操作之内完成对混合物的分离，但是色谱法分离纯化的产量有限，只适合于实验室应用。分析性色谱的目的是定量或者定性测定混合物中各组分的性质和含量。定性的分析性色谱有薄层色谱、纸色谱等，定量的分析性色谱有气相色谱、高效液相色谱等。色谱法应用于分析领域使得分离和测定的过程合二为一，降低了混合物分析的难度缩短了分析的周期，是目前比较主流的分析方法。在中华人民共和国药典中，共有超过600种化学合成药和超过400种中药的质量控制应用了高效液相色谱的方法。本次的分离方法使用的为HPLC分离，柱内填料为碳十八。1.2.2纳他霉素的分离提取方法概述纳他霉素是分泌到细胞外的抗生素,由于它在水容易中的溶解度很小,往往吸附在菌丝体表面或形成微小的结晶。纳他霉素的分离提取方法很多。大多为专利报道,给出的提取条件较为模糊。最早的描述其回收过程的专利一般都要求多种纯化步骤,并包含一些相对来说比较昂贵的单元操作。英国专利GB846933发现了一种吸附洗提的方法,可以用水溶性极性溶剂如甲醛,丁醇和丙酮从发酵液中提取纳他霉素。美国专利USP3892850提出了一种方法,他们用不易溶于水的有机溶剂从发酵液中萃取纳他霉素,然后从溶剂中回收纳他霉素。美国专利USP3378441声称可以用盐析的方法从发酵液中分离纳他霉素,并辅以溶剂溶解和浓缩沉淀。最新的专利GB2106498,描述了用真空浓缩或丁醇萃取过滤了的发酵液来得到一种原始的抗真菌复合体,而从这种复合体中可以得到纳他霉素。世界专利wo92/10550发现纳他霉素易溶于低pH的甲醇,之后只要除去固形物,提高pH以沉淀析出纳他霉素即可。本此实验使用的为HPLC半制备的方法从发酵液中提取纳他霉素，骆健美（2008）中所提到的溶解度关系和闫磊（2010）中的相关方法制定方案建立一种测定乳制品中纳他霉素含量的高效液相色谱法。样品经甲醇萃取后进样， 采用 C 18 250 mm4.6 mm色谱柱分离，流动相为甲醇： 水=64 （体积比 ） ， 紫外检测； A-R303 nm， RSD 为 056 082 （n=5 ） ， 标准曲线 R=0.999 8，平均回收率分别为 97.89 ，最低检出限为 0.03 mg/kg。1.3本次实验的相关检测方法1.3.1超高效液相色谱（UPLC）超高效液相色谱（Ultra Performance Liquid Chromatography，UPLC）色谱理论认为提高色谱柱的效能（efficiency）就能增加仪器的解析度（resolution），而运用粒径低于2m的小颗粒无疑是增加效能的好方法。但减小固定相的粒度以增加色谱柱效能一直是色谱仪器科学的瓶颈，因为小颗粒不仅要求系统能承受高于目前极限压力（比如6000psi/400bar），需要更小的系统体积（死体积），并且需要能适应可能只有几秒峰宽的高速检测器。与传统的高效液相色谱（HPLC）相比，UPLC具有以下优势：1）高分离度（ultra resolution）而根据范迪姆特（Van Deemter）色谱理论，柱效反比于系统固定相粒度大小。UPLC系统运用的固定相粒度能达到1.7m，根据上述方程，该系统达到的效能将比5m粒度系统高70%，而比3.5m高40%。2）高速度（ultra speed）在保证得到同样质量数据的前提下，UPLC能提供单位时间内更多的信息量。在不影响解析度的的情况下，小粒度能提供更高的分析速度，同样也能使柱长减少，根据Van Deemter色谱理论，最优流速反比于粒度大小。例如，运用1.7m的颗粒，相对于5m颗粒，在不影响柱效的情况下，柱长将可以立方级的减少，而且可以在3倍的流速下运行，相同的解析度情况下，分离速度提高了9倍。3）灵敏度（sensitivity）过去对于提高灵敏度的研究大都集中于检测器上，不论是光学检测器还是质量检测器。但是，其实运用UPLC也能提高分析的灵敏度。UPLC能提高柱效N，从而使峰宽w变的更窄，而峰高却增加了，同时，由于UPLC运用了更短的柱子（柱长L更小），进一步增加了峰高。因此，在提高柱效的同时，运用1.7m的UPLC系统比5m和3.5m的系统灵敏度分别提高了70%和40%，而在柱效下相同情况下，能分别提供3倍和2倍的灵敏度。在仪器工艺方面，Waters ACQUITY UPLC采用了新型的色谱填料及装填技术，配备了优秀的超高压液相色谱泵、自动进样器、高速检测器，并优化了系统的综合设计，使仪器分析能力大大增强。由于UPLC是一个新兴的领域，Waters ACQUITY UPLC系统也出现不久，目前已发表的应用资料还很不足。与传统的HPLC相比，UPLC的速度、灵敏度及分离度分别是HPLC的9倍、3倍及1.7倍。目前，UPLC多应用于代谢组学分析及其他一些生化领域，在天然产物的分析方面运用也逐渐兴起，因为在这些领域深入研究需要更高的分析精度。使用UPLC与Q-Tof-MS或trap-tof-MS等质谱检测器连接，对天然产物分析，特别是中药研究领域的发展将是一个极大的促进。1.3.2质谱分析（Lc-MS）质谱（又叫质谱法）是一种与光谱并列的谱学方法，通常意义上是指广泛应用于各个学科领域中通过制备、分离、检测气相离子来鉴定化合物的一种专门技术。质谱法在一次分析中可提供丰富的结构信息，将分离技术与质谱法相结合是分离科学方法中的一项突破性进展。在众多的分析测试方法中，质谱学方法被认为是一种同时具备高特异性和高灵敏度且得到了广泛应用的普适性方法。质谱仪器一般由样品导入系统、离子源、质量分析器、检测器、数据处理系统等部分组成。质谱技术是一种鉴定技术，在有机分子的鉴定方面发挥非常重要的作用。它能快速而极为准确地测定生物大分子的分子量，使蛋白质组研究从蛋白质鉴定深入到高级结构研究以及各种蛋白质之间的相互作用研究。随着质谱技术的发展,质谱技术的应用领域也越来越广。由于质谱分析具有灵敏度高，样品用量少，分析速度快，分离和鉴定同时进行等优点，因此，质谱技术广泛的应用于化学，化工，环境，能源，医药，运动医学，刑事科学技术，生命科学，材料科学等各个领域。质谱仪种类繁多，不同仪器应用特点也不同,一般来说，在300C左右能汽化的样品，可以优先考虑用GC-MS进行分析，因为GC-MS使用EI源，得到的质谱信息多，可以进行库检索。毛细管柱的分离效果也好。如果在300C左右不能汽化，则需要用LC-MS分析，此时主要得分子量信息，如果是串联质谱，还可以得一些结构信息。如果是生物大分子，主要利用LC-MS和MALDI-TOF分析，主要得分子量信息。对于蛋白质样品，还可以测定氨基酸序列。质谱仪的分辨率是一项重要技术指标，高分辨质谱仪可以提供化合物组成式，这对于结构测定是非常重要的。双聚焦质谱仪，傅立叶变换质谱仪，带反射器的飞行时间质谱仪等都具有高分辨功能。质谱分析法对样品有一定的要求。进行GC-MS分析的样品应是有机溶液，水溶液中的有机物一般不能测定，须进行萃取分离变为有机溶液，或采用顶空进样技术。有些化合物极性太强，在加热过程中易分解，例如有机酸类化合物，此时可以进行酯化处理，将酸变为酯再进行GC-MS分析，由分析结果可以推测酸的结构。如果样品不能汽化也不能酯化，那就只能进行LC-MS分析了。进行LC-MS分析的样品最好是水溶液或甲醇溶液，LC流动相中不应含不挥发盐。对于极性样品,一般采用ESI源，对于非极性样品,采用APCI源。1.3.2质谱（LC-MS） 质谱法(Mass Spectrometry,MS)即用电场和磁场将运动的离子（带电荷的原子、分子或分子碎片，有分子离子、同位素离子、碎片离子、重排离子、多电荷离子、亚稳离子、负离子和离子分子相互作用产生的离子）按它们的质荷比分离后进行检测的方法。测出离子准确质量即可确定离子的化合物组成。这是由于核素的准确质量是一多位小数，决不会有两个核素的质量是一样的，而且决不会有一种核素的质量恰好是另一核素质量的整数倍。分析这些离子可获得化合物的分子量、化学结构、裂解规律和由单分子分解形成的某些离子间存在的某种相互关系等信息。质谱分析法对样品有一定的要求。进行GC-MS分析的样品应是有机溶液，水溶液中的有机物一般不能测定，须进行萃取分离变为有机溶液，或采用顶空进样技术。有些化合物极性太强，在加热过程中易分解，例如有机酸类化合物，此时可以进行酯化处理，将酸变为酯再进行GC-MS分析，由分析结果可以推测酸的结构。如果样品不能汽化也不能酯化，那就只能进行LC-MS分析了。进行LC-MS分析的样品最好是水溶液或甲醇溶液，LC流动相中不应含不挥发盐。对于极性样品,一般采用ESI源，对于非极性样品,采用APCI源。1.3.3二级质谱（MS/MS）1）定义二级质谱（MS/MS）是在质谱的基础上用第一个质量分析器选出某种质荷比的离子，使之与中性气体分子碰撞，激活分解生成碎片离子，再用串接的第二个质量分析器扫描给出质谱的分析方法。2）质朴图简绍在质谱图中，横坐标表示离子的质荷比（m/z）值，从左到右质荷比的值增大，对于带有单电荷的离子，横坐标表示的数值即为离子的质量；纵坐标表示离子流的强度，通常用相对强度来表示，即把最强的离子流强度定为100%，其它离子流的强度以其百分数表示，有时也以所有被记录离子的总离子流强度作为100%，各种离子以其所占的百分数来表示。1.4本文的研究目的、意义纳他霉素具有广谱抗真菌活性及对哺乳动物细胞的高安全性，很早就已经被美国的食品药品监督局（FDA）批准用作生物性食品防腐剂和人体抗真菌感染药物。纳他霉素目前市场需求较大，但是由于其发酵单位较低，其应用前景受到限制。前期通过UPLC-MS分析发现，在高产菌株的代谢产物中有新化合物的出现，并且该菌产纳他霉素的能力与溶氧水平呈正相关性。本文一方面希望通过分离纯化对该化合物结构解析，阐明该化合物跟纳他霉素之间的关系，为纳他霉素产量的提高提供思路；另一方面希望通过接合转移的方法，异源表达透明颤菌血红蛋白，增加菌体对氧的利用率，以期从分子水平对菌株进行改造，提高纳他霉素的产率。实验分为两部分，第一部分为，对细菌进行溶氧验证后利用基因工程技术对细菌进行改造，从而提高纳他霉素的产量，已获得更高产的高产菌株。基于以上的文献综述和相关结论,在本论文中将展开以下几方面的工作: 1） 通过实验将获得的外源基因通过pSET152-vgb基因导入到HCCB13086高产菌中；2）将获得的少量vgb工程菌进行扩增培养已获得足够的菌种进行之后的研究；3）提取培养后的菌种的DNA；4）通过PCR技术定向扩增vgb基因，检测菌种是否含有vgb基因；5）通过琼脂糖凝胶电泳检测DNA；5）与之前已经改造过的放线菌进行对比。6）培养基发酵比较构建过表达菌株的纳他霉素产量。第二部分为对成功改造后的菌种进行发酵培养，然后对其发酵培养物进行分离纯化，检测纳他霉素的化合物合成，检测是否有新的化合物产生。1)对第一部分的菌种进行溶氧验证实验；2）用第一部分构建成功的工程菌进行发酵实验产生纳他霉素；3）对菌种进行发酵培养4）收集培养物，并对培养物进行处理；5）分离检测所获得的培养物。第二章 工程菌的构建与验证2.1主要实验材料基因工程质粒：pSET152质粒，由华东理工大学老师提供，pSET152-vgb基因已经整合了VHb蛋白产生基因，可以直接用于对菌种进行改造。实验所用培养基配方放线菌生长培养基是培养基：表2.1 放线菌培养基配方Table2.1 Actinomycetes culture medium药品名称药品用量可溶性淀粉2.0 %NaCl0.05 %MgSO47 H2O0.05 %琼脂1.5 % 2.0 %K2 HPO40.05 %KNO30.1 %FeSO40.001%pH7.2 7.4在 121 高温高压灭菌 30 min。用以培养纳他霉素产生种子的牛肉膏蛋白胨培养基：表2.2 牛肉膏蛋白胨培养基配方Table2.2 Beef extract peptone medium药品名称药品用量牛肉膏3gNacl5g水1000mL蛋白胨10g琼脂1520gpH7.47.6在 121 高温高压灭菌 30 min。 放线菌发酵用黄豆粉培养基：表2.3发酵培养基配方Table2.2 Fermentation medium药品名称药品用量黄豆粉14g/LNaCl10g/LMg3(PO4)22.4g/L淀粉14g/LKH2 PO42.4g/LpH自然在 121 高温高压灭菌 30 min。表2.3种子培养基Table2.2 Seed culture mediumPH7.5 1L(g/ml)材料用量可溶性淀粉1.5%黄豆饼粉1.0%牛肉膏0.6%葡萄糖1.5%MgSO47H2O0.1%KH2PO40.05%NaCl0.2%CaCO30.3%2.2实验方法2.2.1 导入目的基因的具体方法1) 对目的基因进行PCR操作2) PCR片段回收3) 回收的PCR片段连A4) 回收的PCR片段连T载体5) 转化：将连接T载体的片段转入DH5a中6) 转化后，菌落/菌液PCR7) 抽提质粒，酶切验证PCR所使用方法和程序如下表所示；表2.4 PCR所用方法Table2.2 Mothed of PCR材料用量Takara Primestsar0.5l2GC Bf25ldNTPs (2.5 mM)4lPrimer 1 (20M)1lPrimer 2(20M)1l模板1lddH2O17.5l表2.5 PCR程序设定Table2.