缺血再灌注对大鼠血脑屏障物质转运的影响.doc

缺血再灌注对鼠血-脑屏障的影响先雄斌 先雄斌（1972，9-），男，四川泸县人，讲师，硕士研究生。从要从事脑缺血损伤机制的研究。综述 袁琼兰2审校1、四川泸州医学院神经生物学研究室，6460002、上海同济大学医学院解剖学教研室，200092血脑屏障(blood-biain barrier ,BBB)是存在于脑组织和血液之间的一个复杂的细胞系统，能控制血、脑两侧的物质转运，从而保证中枢神经组织内环境的相对稳定。血脑屏障受损是脑缺血再灌注损伤(cerebral ischemia reperfusion injury，CIR)的重要的病理生理因素。为深入探讨脑缺血再灌注损伤的病理生理机制,国内、外诸多学者对脑缺血再灌注后BBB的物质转运运机制等进行了大量卓有成效的研究。目前有关研究报道很多，现综述如下。1血-脑屏障的结构血脑屏障由中枢神经系统的脑毛细血管内皮细胞(brain capillary endothelial cells，BCEC)、内皮细胞之间的紧密连接(tight junctions，TJ)、基底膜(basement membrane)以及毛细血管周围的星形胶质细胞突起(process of the neuroglial cell)构成。其中血管内皮细胞及其紧密连接是血脑屏障的主要结构,它可以阻止多种物质进入脑,但营养物质和代谢产物可顺利通过,以维持神经系统内环境的相对稳定； 基底膜主要由型胶原、层黏蛋白和纤维连接蛋白构成，它能起到支持作用，防止由于静水压和渗透压改变引起的血管变形；星形胶质细胞对血脑屏障的完整性有诱导和维持作用。2血脑屏障的物质转运机制1血脑屏障的物质转运有两种形式：一种是物质从高浓度向低浓度移动不需要能量的被动扩散(Passive dispersa1), 它通过孔穴大小来控制物质在BBB的转运,如细胞间隙的亲脂通路和亲水通路。正常情况下，脑毛细血管内皮细胞的有效孔径为1.4nm-18nm，直径小于18nm的药物分子可由被动扩散方式穿过BBB。另一种是载体蛋白等参与的需要能量的逆浓度差和(或)逆电化学梯度的主动转运(Active transport)。现有研究表明主动转运有以下转运系统: 载体介导的转运系统。如己糖转运系统、氨基酸转运系统、单羧酸转运系统、胆碱转运系统胺转运系统、核苷转运系统、红细胞结合转运系统等。特定受体介导的内吞作用。如胰岛素通过内吞作用进入脑内。吸附介导的胞吞转运作用。它是通过物质正电部分与血-脑膜负电部分之间的静电作用，使物质胞吞透过BBB。 外排转运系统(Efflux transport system)。可主动将毒性代谢物和异源性物质外排，以维持大脑正常的生理功能。-糖蛋白和有机阴离子转运体被认为是药物BBB外排的主要转运载体。3.缺血再灌注后对血-脑屏障结构的影响王兴盛等2用线栓法并加以改进制作局灶性脑缺血再灌注模型。脑缺血再灌注24h后迅速断头处死。在缺血侧海马区切取新鲜脑组织处理后经透射电镜观察发现，神经细胞核常染色质疏松，异染色质不规则固缩，并向核周边聚集，核蛋白和胞浆蛋白成分松散、丢失，粗面内质网及核糖体肿胀，部分溶解，溶酶体部分呈板层结构；胶质细胞水肿，星形胶质细胞皱缩，核蛋白和胞浆蛋白成分松散、丢失，粗面内质网致密，突起肿胀，退行性变；微血管内皮细胞出现核皱缩、变性，核染色质松散退变，胞饮小泡增多，血管管腔狭窄。管腔内可见红细胞，内皮细胞间隙增大，通透性增加，胞浆和间质水肿明显；毛细血管内皮细胞有多个向管腔内伸入突起，呈伪足样。徐凯等3也发现缺血再灌注时血脑屏障的损伤随着缺血时间的延长而加重：缺血2小时神经细胞胞浆内水肿，线粒体轻度肿胀，髓鞘变性，内皮细胞肿胀，毛细血管基底膜尚完整。缺血6小时间质水肿严重，神经元密度明显减小，神经纤维肿胀明显，细胞坏死更重，神经细胞崩解，髓鞘肿胀明显，线粒体肿胀明显出现嵴断裂；内皮细胞固缩，毛细血管基底膜断裂，毛细血管管腔明显变形狭窄。4缺血再灌注对血脑屏障的通透性的影响王社军等4采用线栓法制备大鼠大脑中动脉阻塞再灌注模型，通过测定脑组织中伊文氏蓝)含量及免疫组化法来观察血脑屏障通透性的改变。结果表明示BBB的通透性改变与缺血后再灌流的时间密切相关，缺血再灌注3 h，BBB的通透性开始增加；再灌注6-12 h，BBB通透性逐渐增加；再灌注24 h，BBB的通透性明显增加，且达高峰；待再灌注72 h及120 h，BBB的通透性逐渐减小。这与Rosenberg等5通过测量脑组织中14C-蔗糖的方法对大鼠MCAO 2 h再灌注后BBB通透性研究的结果一致。5缺血再灌注后血脑屏障损伤的机制51 基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)细胞外基质(extracellular matrix，ECM)和血管基底膜与是维持BBB完整性的重要结构基础。ECM的重要成分，如胶原、糖蛋白、脂蛋白等均为MMP的作用底物。脑缺血和再灌注后MMP表达增加，尤以MMP-2和MMP-9活性增强最为明显， MMP通过降解ECM使BBB受损，通透性增高，引起毛细血管内水分和血浆蛋白外渗，导致细胞间隙内水分增多，即形成血管源性脑水肿。使用合成的金属蛋白酶组织抑制剂(tissue inhibitors of metalloproteinases，TIMP)可不同程度地抑制上述改变，减轻BBB损伤。王新高等6发现补阳还五汤药液灌胃可明显减少脑缺血再灌注损伤大鼠脑组织含水量，明显降低缺血侧伊文思蓝含量，电镜观察到血脑屏障的破坏减轻，而基质金属蛋白酶-9 mNNA和蛋白表达水平也明显低于对照组。提示补阳还五汤的作用机制可能是通过抑制基质金属蛋白酶-9的转录和表达来实现的。Liu等7也发现，雌激素能减轻缺血再灌注后脑水肿和神经细胞损伤程度，其机制就是通过下调MMP-2和MMP-9的表达和活性介导的。 52 细胞因子和黏附分子内皮细胞在脑缺血后能够分泌炎性细胞因子，这些因子也能作用于内皮细胞，促进其参与免疫应答或炎症反应。TNF-是-种具有广泛生物学功能的细胞因子，TNF-通过促进凝血、增加内皮细胞通透性及诱导黏附分子或其他炎性介质等表达，增加血脑屏障的通透性，加重缺血性脑损伤。MCAO(大鼠大脑中动脉闭塞)后lh即可诱导产生TNF-tmRNA。 Gong 等8研究了短暂性局灶性脑缺血时TNF-的表达与BBB损伤的关系：小鼠MCAO lh，再灌注2h，可见神经元、星形胶质细胞和室管膜细胞上有TNF-表达；再灌注6h，开始出现BBB破坏；12hBBB破坏范围明显增大；应用TNF-抗体可明 减轻BBB的破坏。白细胞介素-l(IL-l)是触发免疫和炎性反应的重要介质，可以通过刺激内皮细胞表达白细胞黏附分子，使白细胞聚集于缺血脑组织，从而加重脑缺血损伤。研究资料表明，IL-1作为一种炎症和免疫源性细胞因子，它不仅能够协同其他细胞因子促进B、T细胞活化，而且能够诱导其他炎性介质的产生，黏附分子的表达，增加白细胞浸润，促进NOS生成，使NO合成增加，诱导兴奋性氨基酸和自由基产生，启动多种细胞因子级联反应。脑缺血再灌注后，产生的TNF-、IL-6等炎性细胞因子激活了小胶质细胞和星形胶质细胞分泌大量的IL-1，IL-1本身又存在白分泌激素样功能。实验发现，局灶性脑缺血再灌注大鼠缺血侧皮层、神经元、星形胶质细胞和小胶质细胞IL-1mRNA及蛋白质表达明显增加9，。相反，侧脑室内注射抗IL-1中和抗体或IL-1受体阻断剂，可减轻缺血性脑损伤10。细胞问黏附分子(intercellular adhesion molecule，ICAM)是细胞膜表面的糖蛋白，主要位于脑血管内皮细胞和各种白细胞表面，其种类繁多，主要归属于免疫球蛋白超家族、整合素家族、选择素家族、钙依赖黏附素家族及某些尚未归类的分子，如CD44、CD36等。ICAM能够通过介导白细胞与BBB的黏附，产生细胞内信号，引起细胞骨架重新排列，细胞间隙增大，从而参与BBB的破坏过程。53 半胱氨酰天冬氨酸特异性蛋白酶-3在缺血再灌注损伤时除细胞坏死外，还存在另一种细胞死亡形式即细胞凋亡（apotosis）。脑缺血/再灌注后，由于多种因素如自由基释放和细胞内Ca2+超载等,最终通过相关调控基因的激活启动凋亡过程。近年来许多学者从形态学、生化，药物学、基因等方面研究证实，Caspase-3 (cysteing aspartate specific protease-3)和细胞凋亡关系密切，是细胞凋亡的主要执行者。如滕军放、方传勤等11 12 通过脑缺血再灌注损伤动物模型发现caspase-3的时空分布、动态变化与凋亡细胞一致。Harrison DC等13向大鼠脑室内注射选择性caspases阻滞剂z-DEVD-fmk后，可减少细胞凋亡。Caspase-3激活可作用于相应的底物，使细胞发生凋亡。这种细胞不仅可发生在神经细胞，也可发生在胶质细胞和血管内皮细胞，从而使血脑屏障的结构与功能受损。54 自由基由于在缺血过程中已经造成线粒体损伤，再灌注时不能提供足够的电子起到还原作用，因而产生大量的自由基，如02- 、H2O2、OH-等。过量的自由基可导致脂质、蛋白质及核酸过氧化，破坏BBB的完整性。向脑内注射或脑表面灌注自由基生成剂都可增加BBB的通透性；而自由基清除剂，如超氧化物歧化酶都能减轻缺血再灌注后BBB的损害和脑水肿。表明自由基是导致脑缺血再灌注后BBB破坏和脑水肿的重要物质。55血管内皮生长因子血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是一种内皮细胞特异性有丝分裂原，既可特异性促进血管内皮生长，又能增加BBB的通透性。正常情况下，VEGF在脑内仅有少量表达。大鼠MCAO再灌注后1 h后开始出现VEGF mRNA和蛋白表达，3 h达高峰。至今，VEGF在脑缺血及再灌注病理学过程中的作用仍存在争议。但多数研究表明VEGF能减轻缺血再灌注后BBB损伤和脑水肿，减轻恢复过程中的神经功能障碍14。56 水通道蛋白4(aquaporin-4，AQP-4)水通道蛋白-4主要分布于中枢神经系统，参与胶质细胞与脑脊液(CSF)以及血管之间的水调节和运输，与脑脊液重吸收、渗透压调节及脑水肿形成的生理、病理过程密切相关。原位杂交显示AQP-4 mRNA在侧脑室及导水管的室管膜细胞、脉络丛上皮、软脑膜、下丘脑、视上核、海马齿状回和小脑Purkinje细胞均有明显表达。免疫组化研究发现，AQP4蛋白主要在星型胶质细胞和室管膜细胞内表达，尤其在与毛细血管和软脑膜直接接触的胶质细胞上及血管周表达丰富，而在神经元、少突胶质细胞和小胶质细胞内均未见表达。Papadopoulos MC等15发现AQP-4与脑水肿密切相关，在大鼠缺血再灌注模型中发现缺血可以上调脑内AQP4蛋白的表达，在缺血周边区表达量高于缺血中心区。陈英辉等16也发现大鼠缺血再灌注后，实验组大鼠脑组织含水量及伊文氏蓝水平在缺血再灌注后不同时间点明显高于对照组；AQP4蛋白表达明显增高(均P005)，并随着缺血再灌时间的延长，其表达量亦逐渐增加，在再灌后24-48 h达到高峰；结果表明AQP4的高表达参与了脑缺血再灌注后继发的血-脑屏障的开放和脑水肿的发生，是脑水肿产生的重要分子基础。另外，无论是动物实验还是临床治疗，使用AQP4阻断剂均能减轻脑水肿的发生和发展17。57 凝血酶及其它因素凝血酶（thrombin，TM)是一种血清丝氨酸蛋白酶，是凝血级联反应过程中的关键酶。目前已经证实，凝血酶是一种神经毒性介质，与血脑屏障破坏及脑水肿的形成有关。陈志斌等18向脑内基底节区注射TM，6 h后同侧基底节区BBB通透性明显增加，24 h时达高峰，持续至48 h，然后逐渐消退；脑水含量的变化规律与BBB 通透性的变化类似。DERY O等19发现TM的许多生物活性都是由蛋白酶活化受体-1(protease activatedreceptor-1，PAR-1)介导。陈志斌等18发现CATG（是PAR-l受体的特异性抑制剂）,可明显抑制TM诱发的BBB通透性增加和脑水肿。另外，凝血酶活化后还可激活Ca2+ 依赖性肌球蛋白轻链激酶(myosin light chain kinase，MLCK)和蛋白激酶RhoA，导致内皮细胞收缩，细胞问连接松散，细胞间隙形成。这不仅加重了缺血后的脑水肿，还会增加凝血酶、纤维蛋白和组织型纤溶酶原激活剂等大分子进入脑组织间隙，引起炎症细胞浸润，炎性因子释放，进一步加重微血管损伤，形成恶性循环。其他因素如高血糖20、pH值、离子浓度等的异常以可损伤BBB，导致BBB的通透性增加和脑水肿。6、问题与展望血脑屏障作为机体维持中枢神经系统内环境稳定的结构基础，在脑缺血再灌注损伤中占有重要地位。对其病理生理机制的研究虽然取得了很大成绩，但是有诸多问题尚待前一步的探索：血管内皮细胞及其紧密连接是血脑屏障的主要结构,但对紧密连接的组装、功能调节以及星形胶质细胞-内皮细胞的相互作用和信号转导通路等问题还一知半解。BBB的存在仅能使小分子物质、脂溶性药物(如氯霉素、红霉素等抗生素类药物、巴比妥类中枢镇静药)通过BBB，大多数药物则无法通透BBB而不能进入脑内。如何有效地改变药物的理化特性或对BBB通透性进行有效调控？目前对缺血再灌注后血脑屏障损伤机制的研究虽然取得了很大成绩，但对血脑屏障的病理生理机制多停留在少数几种介质上，是否还有其它介质、这些介质之间的相互作用如何？中医药可改善血脑屏障的通透性、减轻脑水种、增加大脑局部血流量21，但是有关中医药对血脑屏障的影响的研究还不够深入：哪些中药能通过血脑屏障？通过何种机制干预血脑屏障损伤？中医不同治法对血脑屏障的影响有何不同？BBB对维持中枢神经系统内环境稳定具有重要意义，理应引起我们的重视和进行深入研究。随着缺血再灌注后血脑屏障损伤、调节、修复等机制的不断阐明和中医药的研究进展，必将为中枢神经系统疾病的临床诊治提供更多新的理论依据和方法。参考文献1、林凤云,朱照静。血脑屏障转运机制的研究进展。中国药房，2006，17(10):783-7852、王兴盛，苗莉，姚小梅等。大鼠脑缺血再灌注后血脑屏障超微结构的改变。天津医药，2006，34（3）：188-1893、徐凯，黄海东，沈天真等。大鼠急性脑缺血再灌注后血脑屏障的变化。中国医学影像技术，2005，21（4）：519-5224、王社军，杜长生，唐红等。大鼠脑缺血再灌注后血脑屏障通透性的改变。武警医学，2005，16（10）：745-7475、Rosernbery GA，Estrada EY，Encof JEMattix 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