复苏后体外培养时间对冻-融胚胎移植结局的影响.doc

复苏后体外培养时间对冻-融胚胎移植结局的影响 范晓玲1 胡蓉2 （1. 宁夏医科大学，银川 750004；2.宁夏医科大学总院生殖医学中心，银川 750004）【摘要】目的：探讨胚胎冷冻-复苏后体外培养时间对移植结局的影响。方法：回顾性分析本生殖中心2009.01-2011.12 行FET助孕治疗的264对夫妇337个周期资料，根据复苏后体外培养时间不同分为短时培养（1-3h）和过夜培养组（16-20h），分别比较各组患者一般情况、临床妊娠率、种植率、流产率、多胎率，活产率有无差异。结果：2组间患者一般情况、临床妊娠率、种植率、多胎率、活产率、流产率差别均无统计学意义（p0.05）。结论：冷冻胚胎复苏后短时培养和过夜培养对FET移植结局影响无差别，冷冻前高质量胚胎可获好的FET移植及妊娠结局。 【关键词】 冻融胚胎移植 复苏后培养 临床妊娠率 着床率 流产率 Influnence of post-thawed culture period on the outcome of frozen-thawed embryos transfer 【 Abstract 】Objective:The purpose of this study is to explore the influnence of post-thaw culture period on the outcome of frozen-thawed embryos transfer. Methods: In this retrospective evaluation, that spanned a 2-year period(2011.01-2012.12),a total of 264 patients were undergoing the FET treatment,and 337cycles were divided into two study groups,depending on their post-thawed cultuer period:short cultrue (1-3h) group and long culture (throughnight:16-20h) group,groups were compared regarding clinical pregnency rate,implantation rate,spontaneous abortion rate,multiple pregnency rate,live birth rate per cycle transferred. This comparison was corrected for the most common confounding factors such as maternal age ,body mass index, developmental day at freezing. Results: The outcome of the two approaches are no significant differences in frozen-thawed embryos transfer cycles, embryos with high-quality before freezing associated with higher clinical pregnency rate and implantation rate. 【Kay words】Frozen-thawed embryos transfer（FET）, Post-thawed culture，Clinical pregnency rate, Implantation rate, Spontaneous abortion rate 冷冻-复苏胚胎移植（Frozen-Thawed Embryo Transplantation,FET）作为辅助生育技术（Assisted Reproductice Technology,ART）的重要组成部分，目前广泛应用于各种原因取消新鲜周期胚胎移植或新鲜周期移植后未孕的患者。其有效预防卵巢过度刺激综合征的发生，增加了单次促排卵的累积妊娠率，减轻了患者的痛苦和经济负担。然而，与新鲜胚胎移植相比，冻融胚胎移植的临床妊娠率仍较低1。影响冻融胚胎移植结局的因素很多，包括女性年龄、体重指数、冷冻方法、胚胎质量、内膜准备方案、所用移植管及移植时机等等，其中，胚胎质量是最关键的关键，高质量的胚胎具有较高的妊娠率2。目前，FET胚胎选择的形态学依据主要为两种观察结果，一种是观察到解冻后胚胎卵裂球的复苏、存活，这个过程需短时培养（1-3小时左右）即可（他的优点在哪？）；另一种方法是胚胎解冻后过夜培养，再观察胚胎是否继续生长，如细胞期胚胎卵裂球的分裂，囊胚是否扩张等。至于哪种培养时间可获更好的FET结局，目前这方面的报道较少，也未达共识。本研究拟就复苏后体外培养时间对FET结局的影响进行分析，以探讨FET移植的最佳时机。1 资料与方法1.1 研究对象 收集2009.01-2011.12在我中心行FET助孕治疗的447对夫妇，590与摘要数据不符个周期资料，纳入标准：女方年龄35岁、体重指数：18BMI25（体重/身高2）、采用长方案促排、IVF/ICSI2周期、程序化慢速冷冻方法、胚胎均为受精后第3天冷冻、内膜准备方案：自然周期或激素替代；排除标准：女方年龄35岁、BMI25或18、短方案或其他方式促排卵、IVF/ICSI周期3、内异症或子宫畸形、促排方式准备内膜。剔除不符合条件的，最终进入研究的资料为264对夫妇337个周期。1.2 方法1.2. 1 分组 337个周期按复苏后体外培养时间不同分为2小时组（短时培养1-3小时）和过夜培养组；按照冷冻前胚胎卵裂球数目不同分层：小于6细胞亚组（6c）和大于等于6细胞（6c）亚组。1.2.2 胚胎评价标准及冷冻胚胎选择对卵裂期胚胎评价参照Peter3评分系统，评分标准：I级：卵裂球大小均匀，形态规则，胞浆均质透明，碎片10%；II级：卵裂球大小稍不均匀，形态略不规则，胞浆折光性有轻微改变，碎片20%；III级：卵裂球大小均匀或轻度不均匀，形态欠规则，碎片50%。将受精后48h细胞数4个，72h细胞数6个的级和级胚胎，定为优质胚胎进行移植和冷冻。我中心通常选择受精后第3天，评分44细胞II级以上的正常受第三天是48小时吗，不是的话就比通常的标准要低了。请统一时间点精胚胎，在征得患者夫妇同意后冷冻保存。冻存过程采用程序慢速冷冻（Planer程序冷冻仪），复苏时采用快速解冻法，均完全按照标准操作程序进行。胚胎解冻指标观察计数冻融后的胚胎卵裂球数，以50%冷冻前卵裂球数量完整无损伤为存活，细胞数6、碎片20%为优质胚胎，细胞数4、碎片20%为可移植胚胎，可行胚胎移植。所有卵裂球均完整无损伤为完整存活胚胎。1.3 内膜准备方案 我中心常规FET内膜准备方法：新鲜周期或取卵后3个月行FET 治疗，根据患者既往月经周期及排卵情况分2种内膜准备方案：自然周期(Natural cycle,NC)准备方案: 对月经规律,有排卵的患者，在月经周期第10天开始采用B超监测卵泡，优势卵泡发育至16mm时检测血促黄体生成素( LH)、血清雌二醇(E2)水平，排卵后3d或LH 峰后4d且内膜8mm时开始肌注黄体酮60-80mg 行黄体支持，3日后行FET；按照排卵3天及肌注黄体酮后3天算移植排卵后第7天了，移植的是囊胚还是4细胞的胚。激素替代周期(hormone replacement cycle,HRT) 准备方案: 对排卵障碍或周期不规律及既往NC内膜7mm的患者采用：于月经周期或撤退性出血的第2-3天起开始口服戊酸雌二醇，采用递增方案，剂量在月经第2-8天为4mg/d,第9-14天为 6mg/d; B超监测子宫内膜厚度，200pg/ml时，开始加服黄体酮60-80mg/d行黄体支持，4日后解冻胚胎行FET，移植日开始肌注黄体酮80-100mg/d。一次解冻几枚胚、移植几枚胚？1.4 妊娠判断 胚胎移植后14d测晨尿HCG阳性，血HCG25mIU/mL为生化妊娠，继续行黄体支持；移植后4周行B超检查，有孕囊及原始心管搏动为临床妊娠，继续黄体支持至孕12周。1.5 率的计算 复苏率=复苏胚胎数/解冻胚胎数100%；种植率（着床率）=B超下孕囊数/移植胚胎数100%；临床妊娠率=临床妊娠周期数/移植周期数100%；多胎率=多胎妊娠周期数/临床妊娠周期数100%；流产率=流产周期数/临床妊娠周期数100%；活产率=活产周期数/临床妊娠周期数100%；取消移植率=取消周期数/融胚周期数100%。1.6统计学方法 采用SPSS19.0统计软件进行数据分析，计量资料以均数标准差（x）表示，均数的比较采用两独立样本检验，率的比较采用2检验；p0.05，表1）可否简洁一些，具体结果可看表1.。 表1 FET周期患者一般情况比较指标短时培养组过夜组t x2 P值n 135158周期数157180女方年龄（x）29.483.6229.073.581.032 0.303不孕年限（x）4.353.304.352.930.001 0.999内膜厚度（x）9.981.5910.291.49-1.862 0.063体重指数（x）21.482.0421.292.000.839 0.402移植胚胎数（x）2.270.612.170.571.48 0.14内膜准备方案（NC%）17.83（28/157）23.89（43/180） 1.848 0.174受精方式（IVF%）56.7（89/157）52.2（94/180） 0.674 0.412原发不孕（%）66.2（104/157）60.6（109/180） 1.166 0.28不孕原因 输卵管因素（%）64.3（101/157）61.11（110/180） 0.371 0.542 男方因素（%）22.3（35/157）21.11（38/180） 0.069 0.793 排卵障碍（%）13.4（21/157）12.22（22/180） 0.1 0.7522.2 复苏后体外培养时间对冻融胚胎移植结局的影响 337个周期中，短时培养（1-3h）157周期，过夜培养组（16-20h）180周期。两组的临床指标中胚胎复苏率、临床妊娠率、流产率短时培养组高于过夜培养组，但差异无统计学意义；而种植率、多胎率、活产率过夜组高于短时培养组没有统计学意义，且高出点几个百分点，不能说高或低，但差异无显著性（P0.05，表2）。 表2 不同体外胚胎时间FET及妊娠结局比较短时培养组（1-3h）过夜培养（16-20h）x2P值周期数（n）157180解冻胚胎数（n）428470复苏胚胎数（n）356391复苏率（%）83.17（356/428）83.1（391/470）1.7240.189种植率（%）23.03（82/356）24.29（95/391）0.1640.685临床妊娠率（%）45.23（71/157）45.00（81/180）0.0020.967多胎率（%）15.49（11/71）17.28（14/81）0.0880.766活产率（%）77.46（55/71）87.65(71/81)1.750.186流产率（%）19.72（14/71）11.11（9/81）2.1830.142.3 冷冻前胚胎质量对移植结局的影响 按照冷冻前胚胎卵裂球数目多少分为6细胞亚组及6细胞亚组，在同一培养时间内，两亚组间各临床指标比较均有显著性差异，6细胞亚组的种植率及临床妊娠率明显高于0.05，表4）。 表3 冷冻前胚胎卵裂球数对FET结局影响 6细胞 6细胞 x2 P周期数（n）28236种植率（%）8.06（5/62）26.65（137/514）10.2920.001临床妊娠率（%）17.86（5/28）50（118/236）10.3920.001多胎率（%）16.10（19/118）活产率（%）174.66（94/118）流产率（%）018.64（22/118） 表4 复苏后培养时间对冷冻前不同卵裂球数胚胎FET结局影响 短时培养 过 夜培养6细胞6细胞6细胞6细胞x21P1x22P2周期数（n）1112017116种植率（%）4.34（1/23）25.41(62/244)10.26(4/39)27.78(75/270)0.1170.7320.2450.621临床妊娠率（%）9.09（1/11）45.83（55/120）23.53（4/17）54.3（63/116）0.2200.6393.0060.083多胎率（%）12.73（7/55）19.05（12/63）0.8680.351活产率（%）72.73（40/55）85.71（54/63）3.1850.074流产率（%）25.45（14/55）12.70（8/63）3.1500.076注：x21和x22分别为短时培养和过夜培养组中你不同卵裂球数亚组间比较卡方值，x21为0.05。3.讨论3.1复苏后体外培养时间与FET结局的关系 自从1984年Zeilmaher GH等4报道第1例人类冻融胚胎移植获得活产婴儿以来，冷冻胚胎技术广泛应用于各生殖中心，FET也已成为ART的重要组成部分，Ferraretti AP等5的一项调查显示，在欧洲，截至2008年，FET占所有ART比例已经超过了20%。目前，FET主要应用于新鲜胚胎移植未孕尚有剩余胚胎或因各种原因取消新鲜胚胎移植周期而行全胚冷冻的患者，在预防和减少卵巢过度刺激综合征（OHSS）、预防和减少妊娠合并症发生、减轻患者经济负担、增加单次促排卵的累积妊娠率等方面起着重要作用，然而，近年来只有一项Mata分析指出，对于控制性超排卵周期中表现正常或高反应的人群，在胚胎-子宫内膜容受性较好同步性的前提下，FET可以提高ART临床妊娠率和妊娠结局5。大多数的研究发现FET的临床妊娠率仍低于新鲜胚胎移植，而流产率高于新鲜胚胎移植7。影响FET结局的因素很多，包括取卵时患者年龄、不孕年限、体重指数、冷冻及复苏过程和方法、冷冻前及复苏后胚胎质量、内膜准备方法、移植管的类型、批号、移植方法等等8。其中胚胎质量是最重要的影响因素，在新鲜周期，高质量胚胎会获得较高临床妊娠率和活产率9；在FET周期，冷冻前高质量的胚胎可获较高复苏率和临床妊娠率10-11。因此，可以认为在相同条件下选择高质量的胚胎即可获得较好的移植结局和妊娠结局。高质量冻融胚胎的评判标准是：冷冻时具有良好的形态、复苏后无卵裂球损伤以及过夜培养后恢复有丝分裂能力12。在冷冻前具有相似形态前提下，胚胎复苏后不同培养时间段可以观察到不同的形态学特点，移植前短时培养（1-3h）可以观察到卵裂球的复苏情况，过夜培养可以更好地观察胚胎有丝分裂的恢复情况。但是对于复苏后体外培养时间对移植结局的影响尚未达共识。一些生殖中心倾向于胚胎复苏后短时培养（1-3h）后即移植：Rato ML等13则认为与过夜培养相比，短时培养与高临床妊娠率和种植率相关，另外，该研究还强调，冻融周期胚胎的选择应严格以复苏后卵裂球的存活能力为基础，并认为延长体外培养时间会增加胚胎卵裂球丢失几率，增加冷冻保护剂对胚胎的毒性作用，从而影响胚胎发育潜能；罗金等14也认为延长冻融胚胎体外培养时间不能显著提高FET妊娠率和种植率，但是可以通过观察胚胎复苏后的生长情况评估胚胎的发育潜能，这与龚绍琼15的研究结果相似，而后者还认为自己研究结果中流产率的增加与延长体外培养时间有关；而另外一些生殖中心则选择延长体外培养时间，并认为临床结局优于短时培养：我国学者吴黎等16通过分析同济医院498个FET周期发现延长冻融胚胎体外培养时间，可以更好的根据胚胎发育潜能挑选优质胚胎移植，提高妊娠率、改善妊娠结局，减少多胎率及流产率；柴三明17等也认为延长体外培养时间可以使胚胎与子宫内膜发育同步，还可使冷冻保护剂充分代谢，减少其对胚胎后续发育的影响，显著提高胚胎发育潜能及临床妊娠率；这与我们的研究结果相似，我们的研究在消除了年龄、体重指数、不孕原因、促排卵方式等混杂因素的影响后，结果也显示：冷冻胚胎复苏后过夜培养可以提高移植后临床妊娠率、种植率、活产率、多胎率，降低流产率，但差异无统计学意义，可能与选取的患者年龄均较轻，胚胎质量均较好有关。还有学者认为，体外培养时间对妊娠结局影响无差别：Lei Guo等18的研究结果也显示当移植的冻融胚胎中包含至少1枚优质胚胎时，两种体外培养时间对移植结局的影响无明显差异，但该研究选取的对象均为至少移植一枚优质胚胎，与我们的结果还是有区别的。3.2 冷冻前胚胎质量对冻融胚胎移植结局的影响目前ART实验室对胚胎质量评估的主要依据是胚胎的分裂速率，将受精后第3天卵裂球数目6视为正常发育胚胎，而将6个卵裂球的胚胎视为发育较慢胚胎，王贺等19研究认为胚胎冷冻前分裂速率对冻融胚胎移植结局的预测价值高于胚胎复苏率及100%卵裂球存活率，高红，孙莹璞等20研究显示，胚胎的分裂速率与胚胎的发育潜能及冷冻复苏后移植结局密切相关。在冷冻和复苏过程中，冰晶的形成及冷冻保护剂的毒性作用均会造成胚胎细胞的损伤，但是损伤的程度各个胚胎却并不相同，Karlstrom等21研究发现：胚胎冻存前形态学分级好，发育潜就能好，耐受胚胎降温和复温损伤能力强；邓爱民等22的研究也显示冷冻前胚胎质量及解冻后胚胎卵裂球的存活状况是影响冻融胚胎移植周期妊娠结局的最重要的因素，该研究中优质胚胎组的冻融结局明显优于非优质胚胎组，并指出冻存胚胎质量越好，抵抗冷冻损伤的能力越强。先前的研究显示冻融后只有30-48%胚胎可以完整复苏10，而最近的一项研究表明，冷冻前均为优质胚胎的完整复苏率可达79%，相对于低评分胚胎，冷冻前高质量的胚胎具有更强的存活能力23，因此认为新鲜胚胎质量是复苏后胚胎质量和移植结局的保证。以上这些研究均与本研究结果相似：在本研究中，因为短时培养无法观察到胚胎有丝分裂的恢复，而我们知道冷冻前胚胎质量对影响FET结局的影响尤为重要，目前各中心胚胎质量评价仍依据其形态学特点，主要是胚胎卵裂球分裂速率。所以，本研究为了排除冷冻前胚胎质量因素对研究结果的干扰，按照冷冻前胚胎卵裂球数目多少分为6细胞亚组及6细胞亚组，分别比较不同培养时间内各亚组之间临床结局的差异，结果发现：在同一培养时间内，两亚组间各临床指标比较均有显著性差异，6细胞亚组的种植率及临床妊娠率明显高于6细胞亚组，差异有显著性；而在2组培养时间之间，相同亚组间各项临床指标比较提示：过夜培养组的种植率、临床妊娠率、多胎率、活产率均高于短时培养组，而流产率低于短时培养组，但差异无统计学意义；本研究还发现，对于发育缓慢及质量较差的胚胎，移植后也有可能获得妊娠并最终获得健康儿的可能，所以，对于获卵数少、冷冻胚胎数量较少患者，也不能轻易放弃形态学评分差的胚胎。本研究的不足之处有两点：首先，由于是回顾性研究，不可避免其固有的缺点，诸如研究对象不能随机化分组等；其次，由于冷冻前胚胎卵裂球数目均小于6细胞例数较少，所以在分层研究做卡方检验时，该组出现流产率、多胎率为0的情况以致于无法与对照组比较。虽然存在上述不足，但是在收集资料时，为了减少混杂因素引起的偏倚，我们在患者年龄、体重指数、不孕原因、胚胎冷冻时间及冷冻方法、促排方案及内膜准备方案、移植管的应用等方面做了严格筛选，大大增加了结果的可信度；另外，我中心患者进入周期及移植、妊娠结局均为专人管理，所有研究对象无一例失访，随访结果确实可信。 综上所述，通过对我中心所提供完整数据的回顾性分析，我们发现，冷冻胚胎复苏后过夜培养和短时培养（1-3h）后移植结局还是有差别的，其中前者的临床妊娠率、种植率、活产率、多胎率高于后者，而流产率低于后者，但差异无统计学意义；冷冻前优质胚胎组临床妊娠率、种植率明显高于形态学评分较差组，差异具有显著性，冷冻前胚胎质量是决定冻融胚胎移植结局的关键因素。 在影响FET结局的众多因素中，冷冻前胚胎质量是最关键的因素，高质量的胚胎总是与较好的结局密切相关。无论是将胚胎复苏后过夜培养还是短时培养，应根据患者的具体情况综合判断：如果患者剩余胚胎数量少，质量较差，经过夜培养后可能就无可移植胚胎，从而失去移植机会；而对于冷冻胚胎数量较多者，解冻后可以考虑过夜培养，从而挑选发育潜能较好的胚胎移植，确保提高移植结局；如果胚胎发育与子宫内膜同步，可以选择任何一种培养时限，而不会显著影响移植结局。建议在患者无其他可移植胚胎时，也不能轻易放弃，只要移植，就有希望，就有妊娠可能。讨论需要抓住重点 参 考 文 献1EdgarD H，Bourne H，SpeirsAL，et al. 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