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PCR扩增产物的分析 GelelectrophoresisRestrictionendonucleaseMolecularhybridizationNucleicacidsequence PCR扩增产物的电泳分析 琼脂糖凝胶电泳常用于临床检测 定性 聚丙烯酰胺凝胶电泳分离效果比琼脂糖好 条带比较集中可用于科研及检测分析 琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖凝胶电泳是一种非常简便 快速 最常用的分离纯化和鉴定核酸的方法琼脂糖是从海藻中提取的一种线状高聚物根据琼溶解温度 把琼脂糖分为一般琼脂糖和低熔点琼脂糖低熔点琼脂糖熔点为62 65 溶解后在37 下维持液体状态约数小时 主要用于DNA片段的回收 质粒与外源性DNA的快速连接等 凝胶浓度选择 琼脂糖凝胶的浓度与DNA分离范围 电泳缓冲液 常用三种缓冲液Tris 硼酸 TBE Tris 乙酸 TAE Tris 磷酸 TPE TBE与TPE 缓冲容量高 DNA分离效果好 但TPE在DNA片段回收时含磷酸盐浓度高 容易使DNA沉淀TAE 缓冲容量低 但价格较便宜 因而推荐选用TAE 缓冲液中的EDTA可螯合二价阳离子 从而抑制DNA酶的活性 防止PCR扩增产物降解 10 TBE缓冲液的配制 配方Tris108克EDTA9 3克硼酸55克H2O至1000mlpH应为8 0 8 2临用时用水稀至0 5 TBE 20倍稀释 核酸电泳的指示剂 指示剂 溴酚兰二甲苯青溴酚兰 在碱性液体中呈紫兰色电泳中 溴酚兰的迁移率与双链线性DNA片段 核酸电泳的指示剂 二甲苯青 水溶液呈兰色 电泳时 其迁移速率与双链线性DNA大致相当 载样缓冲液 指示剂一般与蔗糖 甘油或聚蔗糖400组成载样缓冲液作用 增加样品密度 使其比重增加 以确保DNA均匀沉入加样孔内 在电泳中形成肉眼可见的指示带 可预测核酸电泳的速度和位置 使样品呈色 使加样操作更方便 核酸电泳的染色剂 最常用的染色剂溴化乙锭银染色 核酸电泳的染色剂 溴化乙锭 ethidiumbromide EB 是一种荧光染料 EB分子可嵌入核酸双链的碱基对之间 在紫外线激发下 发出红色荧光可在凝胶电泳液中加入终浓度为0 5ug ml的EB 有时亦可在电泳后 将凝胶浸入该浓度的溶液中染色10 15min琼脂糖凝胶EB染色 肉眼可见核酸电泳带 其DNA量一般 5ng溴化乙锭太多 凝胶染色过深 核酸电泳带看不清时 可将凝胶放入蒸馏水浸泡30min后再观察 核酸电泳的染色剂 银染色 银染色液中的银离子 Ag 可与核酸形成稳定的复合物 然后用还原剂如甲醛使Ag 还原成银颗粒 可把核酸电泳带染色黑褐色主要用于聚丙烯酰胺凝胶电泳染色 也用于琼脂糖凝胶染色灵敏度比EB高200倍 但银染色后 DNA不宜回收 电泳 电泳装置电泳仪电泳槽灌胶模具等 电泳仪 普通电泳仪高压电泳仪 电泳槽 水平平板垂直平板 电泳方法 用蒸馏水将电泳槽和梳子冲洗干净 放在水平桌面上 并架好梳子根据核酸分子量的大小配制不同浓度的琼脂糖凝胶 一般200 400bp的DNA片段 可配制1 2 1 7 电泳方法配制琼脂糖凝胶及倒胶 0 5 TBE电泳缓冲液100ml于三角烧瓶中 称取一定量的琼脂糖粉放入后沸水锅或微波炉内加热熔化 冷却至60 需要时可加入EB 倒入电泳槽中 待凝固向电泳槽中倒入0 5 TBE 其量以没过胶面2mm为宜 小心移去梳子 如样品孔内有气泡 应除去 电泳方法上样与通电 在DNA样品中加入0 2体积的载样缓冲液 混匀后 加入样品孔内接通电源 一般红色为正极黑色为负极 切记DNA样品由负极往正极泳动 靠近加样孔的一端为负 电压为1 5V cm 长度以两个电极之间的距离计算 根据指示剂泳动的位置 判断是否终止电泳 一般200 400bp的PCR产物50V电压 电泳20 40min 电泳方法结果观察 紫外仪上观察电泳带及其位置并与核酸分子量标准比较被扩增产物的大小 聚丙烯酰胺凝胶电泳 适宜分离鉴定低分子量蛋白质 小于1Kb的DNA片段和DNA序列分析其装载的样品量大 回收DNA纯度高 长度仅相差0 2 即500bp中的1bp 的核苷酸分子即能分离 聚丙烯酰胺凝胶 由丙烯酰胺单体 在催化剂TEMED N N N N 一四甲基乙二胺 和过硫酸铵的作用下 丙烯酰胺聚合形成长链 聚丙烯酰胺链在交联剂 N N 一亚甲双丙烯酰胺参与下 聚丙烯胺链与链之间交叉联接而形成凝胶聚丙烯酰胺凝胶孔径的大小是由丙烯酰胺的浓度决定的 不同浓度丙烯酰胺和DNA有效分离范围 材料 电泳仪器 电泳仪垂直电泳槽及其附件 30 丙烯酰胺丙烯酰胺 29克N N 一亚甲基双丙烯酰胺 1克H2O 加至100ml装于棕色瓶内 4 可保存二个月 材料 10 过硫酸铵过硫酰铵 1克 加水至10ml4 可保存一周 20 可保存一个月1 TBE电泳缓冲液TEMED 四甲基乙烯基二胺 聚丙烯酰胺凝胶的制备与电泳 配胶 根据分离DNA片段的大小及需凝胶的容积 配制聚丙烯酰胺凝胶按要求装配好垂直电泳板 两块玻璃板的两侧及底部用1 的琼脂糖封边 防止封闭不严而使聚丙烯酰胺液漏出将装好的玻璃电泳板倾斜成45 60 角按表3配制所需 浓度凝胶的毫升数加入TEMED后 立即混匀 缓缓倒入两玻璃板间的胶床中 直到液体接近溢出时为止 聚丙烯酰胺凝胶的制备与电泳 立即插入适当的梳子 密切注意防止梳齿下产生气泡 用一有力的夹将梳子夹在一边的玻璃板上 然后将玻璃板斜靠在物体上 使成10 角 可减少液体泄漏的机会室温聚合一小时后 将玻璃板插入电泳槽中 上紧 倒入0 1 TBE缓冲液 聚丙烯酰胺凝胶的制备与电泳 小心取出梳子 立即用缓冲液冲洗加样孔 因为梳子取出后 梳子上吸附的及凝胶顶部未聚合的丙烯酰胺会流入加样孔内聚合 产生不规则的表面 将导致以后DNA电泳带型不规则将DNA样品与适量的载样缓冲液混匀后 加到样品孔内 加样时不要产生气泡 聚丙烯酰胺凝胶的制备与电泳 接好电极 电压为1 8V cm 进行电泳电泳毕 切断电源 取出胶床板 小心移去一块玻璃板 让凝胶吸附在另一块玻璃板上 浸入含0 5ug ml的溴化乙锭溶液中 15 30min后取出水洗 紫外仪下观察结果聚丙烯酰胺凝胶电泳只能检出 10ng以上量的DNA条带 要求更高的灵敏度 可用银染 电泳结果分析 DNAMarker DNA人工片段100bpladder 酶切分析 根据PCR产物中限制性内切酶的位点 用相应的酶进行酶切酶切产物电泳分离后 获得符合理论的片段此法既能进行产物的鉴定 又能对靶基因分型 还能进行变异性研究 分子杂交 检测PCR产物特异性的有力证据检测PCR产物碱基突变的有效方法主要的杂交Southern印迹杂交斑点杂交 Southern印迹杂交 在两引物之间另合成一条寡核苷酸链并作标记 探针 与PCR产物杂交此法既可作特异性鉴定 又可以提高检测PCR产物的灵敏度 还可知其分子量及条带形状 主要用于科研 斑点杂交 将PCR产物点在硝酸纤维素膜或尼龙膜薄膜上寡核苷酸探针杂交观察有无着色斑点主要用于PCR产物特异性鉴定及变异分析 RDB检测 地中海贫血突变基因 29 A G 28 A G 17 A T AAG TAG E CD26GAG AAG IVS I 1 G T IVS I 5 G C 27 28 C 41 42 CTTT 43 G T 71 72 A或 T 654 C T 微孔板夹心杂交法 通过一固定于微孔板的捕获探针与PCR产物的某一区域特异性杂交 使PCR产物间接地固定于微孔板上 然后 再用一生物素等非放射性标记物标记的检测探针与产物的另一区域特异性杂交 漂洗后显色即可判断结果该法使用了两个杂交过程来检测一个产物 其特异性较一次杂交的检测法高 Principle NOS 1 1014 cm2 N 羟化琥珀酰亚胺酯 Principle CCCCCC CaptureProbe NH2 DetectionProbe Biotin Principle NH2标记的探针 Biotin标记的探针 Avidin HRP显色系统 NOS基团 Principle 微孔板夹心杂交法 方法学评价 敏感度 该法检测HBV 敏感度达5个HBVDNA分子敏感性和特异性与PCR32P探针的Southern杂交法相当PCR微孔板夹心杂交法 操作简便 快速 避免了同位素标记探针的危害 显色反应类似于临床常规应用的ELISA 微孔板直接杂交 不是采用夹心法 而是直接将特异的探针固定于微孔板上 然后用生物素标记的PCR产物与之杂交只进行一次杂交 方法简单 但特异性不高 微孔板杂交的基本过程 DNA的固定探针的杂交酶联显色 DNA的固定 在一定盐浓度条件下 DNA单链的一端可固定在微孔板上不同来源的微孔板固定DNA时所需盐浓度不同 因此 必须用一系列的盐浓度 0 15 3 0mol LNaCl 来固定加热变性的核酸 然后 用固定浓度的标记探针杂交 显色后 判断合适的固定盐浓度 DNA的固定 固定方法的选择必须使DNA最大量的固定 且不影响杂交用合适浓度的NaCl或 NH4 2SO4可达到此目的 硫氰酸钠则无固定作用 盐浓度合适时 DNA应为一端固定到微孔板上 而太低或太高浓度的盐可能使DNA 平躺 固定在孔内而影响杂交 DNA的固定 Mg2 虽有促进DNA固定的作用 但它可激活Dnase 所以 一般不用被固定的DNA应大于300bp 否则影响杂交结果 每孔可固定高达200ng 624bp 的DNA盐浓度和固定量确定后 按下法固定DNA DNA的固定 待固定DNA100 加热5min变性 并立即冷却 与合适的固定液混合后 加入微孔板的孔内固定液 10mmol L磷酸钠 10mmol LEDTA pH7 0 合适浓度的NaCl 与DNA变性混合后 终浓度为最适固定浓度 用胶布封好 浸于37 水浴2h用PBS 0 05 Tween20漂洗3次立即用于杂交 或封闭于塑料袋内保存 杂交与显色 杂交可采用标准的杂交系统杂交夹心杂交时 是将变性的PCR产物与检测探针一并加入杂交与漂洗时间均较一般膜杂交短显色根据不同酶标 检测分子的不同来选择不同的底物 终止剂和测定波长 颜色互补分析法 A 利用三原色原理 当不同DNA片段 A和B 同时扩增时 用引物5 端修饰技术将不同引物用不同颜色荧光素标记 A片段引物标记绿色的荧光素 B标记红色的罗丹明 如果仅有一条片段被扩增 扩增产物激发后 只有一种颜色 红色或绿色 如果两条不同大小的片段均被扩增 可通过电泳分离 紫外激发后可观察到不同颜色的两条带如果两条被扩增片段大小相同 电泳后可见一条红绿互补色 黄色带如果不用电泳法分离扩增片段 通过一定手段除未掺入引物 亦可观察到扩增产物的颜色 此时 扩增产物无论大小 只要均被扩增 就可见一条红绿互补的黄色条带 颜色互补分析法 方法学评价 该法简便 易于自动化可用于检测基因 缺失 染色体转位 和病原微生物只判断产物的有无在检测多种基因实变 多种病原菌和HLA分型时 可用复合PCR 此时 不同引物可用不同荧光素标记 如绿色的ROX 蓝色的COUM等 PCR ELISA法 本法避免了电泳和杂交的步骤 适于常规ELISA记数仪检测5 端修饰后仍可进行常规PCR扩增特异靶序列 因此 可以通过修饰其中一个引物的5 端使其携带便于PCR产物固定的功能基团 而通过另一引物5 端的修饰使产物便于检测操作过程 1链亲和素包被 聚丙乙烯微孔板 包被效果差异并不显著亲和层析纯化的链霉亲和素 13U mg Sigma公司 用PBS Tween液140mmol LNaCl 2 7mmol LKCl 4 3mmol LNa2HPO4 1 4mmol LK2HPO4 0 05 w v Tween20 pH7 2配成1 g ml向微孔板的每孔内加入100 l 封好 室温过夜用PBS液漂洗 2扩增产物与包被板的结合 PCR产物1 l用50 1PBS Tween液稀释后加入包被孔内室温下作用30min用PBS