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文档简介

红树植物基因多态性分析 海洋药学教研室 了解不同分子标记原理和方法 掌握RAPD技术原理和整体流程 了解基因组DNA提取原理 掌握植物基因组DNA提取原理和方法 熟悉PCR技术原理 了解PCR技术的改进应用 掌握核酸电泳技术和原理 熟悉相关生物软件和仪器的使用 锻炼整体实验设计的思路 了解研究过程中的结果分析手段 实验目的 不同种类 不同的生态环境下生长的植物体内的化学成分不同的现象 如药材的道地性贝母 川贝和浙贝桔生淮南为桔 移于淮北为枳 化学多态性chemicalpolymorphism 生物种群中存在的与等位基因相关的若干种表现型 ABO血型肤色等 多态性 在一个生物群体中 同时和经常存在两种或多种不连续的变异型或基因型 genotype 或等位基因 allele 亦称遗传多态性或基因多态性 基因多态性一般发生在基因序列中不编码蛋白的区域和没有重要调节功能的区域 对于一个体而言 基因多态性碱基顺序终生不变 并按孟德尔定律世代相传 基因多态性GeneticPolymorphism DNA位点多态性sitepolymorphism长度多态性lengthpolymorphism 基因多态性的表现 宏观角度种属差异环境因素基因结构与功能角度复等位基因 multipleallele 同一基因座出现的多个基因 形成系列称为复等位基因为数众多的复等位基因 是某些复合体 HLA 高度多态性的最主要原因共显性 condominance 一对等位基因同为显性 称为共显性共显性大大增加了种群中某些基因表型的多样化 基因多态性的形成 形态学标记Morphologicalmarker外部形态特征 如植物的矮秆 紫鞘 卷叶等细胞标记Cytologicalmarker染色体的核型 染色体数目 结构 随体有无 着丝粒位置等 带型 C带 N带 G带等 分子标记molecularmarker蛋白分子标记利用蛋白质的多态性来反映不同品种的差异 如同工酶 等位酶等DNA分子标记通过对品种DNA的多态性即DNA碱基序列的差异进行分析 从而鉴别不同品种 遗传标记Geneticmarker 极大的丰富性 多态性高 变异类型丰富 大多数DNA标记是共显性的 很容易区分杂合体和纯合体 DNA标记对性状的表达没有影响 DNA标记具有高度稳定性 不受环境条件和个体发育影响 无组织或器官特异性 准确性 稳定性和重复性较高 DNA分子标记的优点 限制性片段长度多态性RestrictionFragmentLengthPolymorphism RFLP 随机扩增多态DNARandomAmplifiedPolymorphicDNA RAPD 扩增片段长度多态性AmplicationFragmentLengthPolymorphismAnalysis AFLP 微卫星技术MicrosatelliteDNA单核苷酸多态性Singlenucleotidepolymorphism SNP DNA分子标记研究方法 由于DNA的多态性 导致DNA分子中限制酶切位点及数目发生改变 用限制酶切割基因组时 所产生的片段数目和每个片段的长度不同 即限制性片段长度多态性 这种多态性可通过特定探针杂交进行检测 从而可比较不同品种或个体间DNA水平的差异 即多态性 通过多个探针的比较则可以确立生物的进化和分类关系 广泛用于基因组遗传图谱构建 基因定位及生物进化和分类的研究 RFLP 以一系列不同的随机排列的寡聚核酸单链为引物 对所研究的基因组DNA进行扩增 扩增产物通过电泳分析 检测扩增产物的多态性 扩增产物的多态性反映了基因组的多态性 RAPD技术现已广泛用于品种鉴定 系谱分析及进化关系研究 RAPD 利用PCR检测酶切产生的特异片段 结合了RFLP和PCR技术特点 具有RFLP技术的可靠性和PCR技术的高效性 AFLP 微卫星DNA是一种广泛分布于真核生物基因组中的串状简单重复序列 每个重复单元的长度在1 10bp之间 不同数目的核心序列呈串联重复排列 SSR SimpleSequenceRepeats 而呈现出长度多态性 每个SSR序列的基本单元重复次数在不同基因型间差异很大 从而形成其座位的多态性 各SSR座位两侧一般是相对保守的单拷贝序列 据此可设计引物 微卫星技术 单链DNA片段呈复杂的空间折叠构象 这种立体结构主要是由其内部碱基配对等分子内相互作用力来维持的 当其中的一个碱基发生改变时 会或多或少地影响其空间构象 使构象发生改变 而空间构象有差异的单链DNA分子在聚丙烯酰胺凝胶中受到排阻力大小不同 通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 PAGE 可以特异性将构象上有差异的分子分离开 单核苷酸多态性 SNP RAPD技术原理 基因组中存在众多反向重复序列 每一随机引物进行PCR的过程中 单一引物可与反向重复序列结合 使重复序列之间的区域得以扩增 而引物结合位点DNA序列的改变以及扩增位点之间DNA碱基的缺失 插入或置换均可导致扩增片段数目和长度的差异 可通过电泳检测而显示出DNA片段的多态性 RAPD技术继承了PCR技术的优点 可在所研究的物种没有任何分子生物学基础下 对其进行DNA多态性的分析 所需样品量少 灵敏度高 效率较高 技术小结 模板制备 DNA提取 PCR扩增琼脂糖电泳检测PCR产物数据分析进化树构建 RAPD技术流程 基本仪器设备 台式高速离心机 移液器 水浴锅 PCR仪 电泳仪 水平电泳槽 凝胶成像系统 紫外分光光度计 微波炉等生物材料 不同属植物试剂和酶 石英砂 缓冲液A 消化液 含1 5 SDS KAc 酚 氯仿 异戊醇 异丙醇 RNaseA 随机引物 TaqDNA聚合酶 琼脂糖 TAE缓冲液 DNA上样缓冲液等 实验材料 保证DNA结构的完整性纯化后不应存在对酶有抑制作用的物质排除有机溶剂和金属离子的污染蛋白质 多糖 脂类等降低到最低程度排除其他核酸分子的污染 基因组DNA提取 SDS是一种阴离子去垢剂 在高温条件下能裂解细胞 使染色体离析 蛋白变性 释放出核酸 提高盐浓度并降低温度 冰浴 使蛋白质及多糖杂质沉淀 上清液中的DNA用酚 氯仿抽提 反复抽提后乙醇沉淀水相中的DNA 经典的SDS法 称取植物树叶0 5g 加入石英砂和1 5ml缓冲液A 临用前加入50 l 巯基乙醇 中快速研磨 叶片磨碎后加入3ml缓冲液A 12000rpm离心5min 去除上清 将沉淀悬浮于0 7ml的1 5 SDS消化液 65 预热 临用前加入50 l 巯基乙醇 中 65 水浴40min消化 间或混匀 加入1 3体积5MKAc pH7 0 混匀 冰浴30min 12000rpm离心5min 取上清 加入等体积酚 氯仿 异戊醇 25 24 1 抽提 12000rpm离心5min 上清转管 加入等体积氯仿抽提 12000rpm离心5min SDS提取植物基因组提取 上清转管 加入等体积异丙醇轻轻混匀 12000rpm离心5min 沉淀溶解于300 l无菌双蒸水中 加入2 lRNase 10mg ml 37 保温30min 消化RNA 在总体系中加入300 l无菌双蒸水 然后加入等体积酚 氯仿 异戊醇 25 24 1 抽提 12000rpm离心5min 上清转管 加入等体积氯仿抽提 12000rpm离心5min 上清转移至一洁净1 5mleppendorf管中 加入等体积异丙醇 混匀后 12000rpm离心10min 沉淀用无水乙醇洗涤2次 80 乙醇洗涤一次 沉淀晾干后 加入50 l无菌水溶解 获得DNA溶液 1 0 琼脂糖电泳检测DNA质量 SDS法提取植物基因组 红树植物多糖含量较高 可能严重影响后续试验 通过用缓冲液A对植物组织进行预处理 预先去除大量的多糖 以达到提取高纯度DNA的目的 巯基乙醇的作用 由于植物中含有大量多酚类物质 容易与DNA形成不溶性沉淀 造成DNA的损失 此外多酚类物质是氧化性物质 在溶液中形成氧化环境 易引起DNase对DNA的降解 在溶液中加入巯基乙醇以形成还原性环境 避免DNase的作用 酚 氯仿抽提 酚是有效的蛋白质变性剂 可以去除蛋白 但核酸提取过程中常采用酚和氯仿的混合液 这是因为 两种不同有机溶剂较之单一使用一种效果更佳 而且可以避免酚造成的核酸损失 接下来 在使用酚 氯仿后需用氯仿再次抽提主要是为了防止溶液中痕量酚对于后续操作中酶的影响 相关知识 硅膜吸附法原理 硅膜吸附法流程 植物组织 细胞 磨碎后经裂解液裂解 蛋白质 多糖 细胞残片被沉淀去除 然后基因组DNA在高盐状态下选择性吸附于硅膜 再通过一系列漂洗 离心步骤 进一步将多糖 多酚和细胞代谢物 蛋白等杂质去除 最后低盐的洗脱缓冲液将纯净基因组DNA从硅膜上洗脱下来 简化了繁琐的有机试剂抽提步骤 减少了环境污染和操作损失 操作要求低 重复性好 彻底去除可能抑制后续操作的抑制物 如乙醇 有机溶剂 提高产物稳定性 高效快速 易于自动化 基于细胞裂解的膜吸附法 RB1 ResuspensionBuffer1 重悬缓冲液重悬并裂解细胞 变性核蛋白体 释放核酸RNaseARNA酶A降解RNA 去除RNA干扰PB1 PrecipitationBuffer1 沉淀缓冲液沉淀细胞碎片 蛋白 多糖等杂质BB1 BindingBuffer1 结合缓冲液 已加入乙醇 作用于核酸表面水化层 通过电荷作用力促进核酸结合于硅膜CB1 CleanBuffer1 清洁缓冲液去除未能结合于硅膜表面的杂质 盐分等WB1 WashBuffer1 漂洗缓冲液 已加入乙醇 去除以弱离子力结合的杂质 盐分等 消除高盐环境 纯化产物ddH2O 无菌双蒸水 洗脱核酸制备管 含硅质膜 收集洗脱废液 试剂盒组成 取新鲜植物组织100mg在研钵中加入液氮充分碾磨成细粉 转移细粉至一个1 5ml离心管 加入250 l缓冲液RB1和15 lRnaseA 旋涡振荡 充分混匀以助裂解 55 水浴15分钟 在水浴过程中颠倒离心管2 3次 混合样品 12000rpm离心5min 轻轻吸取上清至另一洁净1 5ml离心管 加入100 l缓冲液PB1 充分混匀 冰浴5分钟 12000rpm离心5min 小心吸取上清至一新的1 5ml离心管 避免扰动和吸取界面物质 加入375 l缓冲液BB1 充分混匀 加入BB1可能出现絮状沉淀 但不影响DNA提取 取全部混合液 包括可能的沉淀 加入吸附柱中 吸附柱放入收集管 12000rpm离心30sec 弃去收集管中废液 吸附柱容量有限 先加650 l溶液离心 弃废液 再加入剩余的溶液 再次离心 植物基因组提取步骤 在吸附柱中加入500 l清洁液CB1 12 000rpm离心30sec 弃废液 在吸附柱中加入500 l漂洗液WB1 12 000rpm离心30sec 弃废液 并重复本步骤一次 将吸附柱放回空收集管中 12 000rpm离心2分钟 彻底去除残留的WB1 以免其中残留乙醇影响后续操作 取出吸附柱 放入一洁净1 5ml离心管中 在吸附膜的中间部位加100 l双蒸水 事先在60 水浴中预热 室温放置1分钟 12000rpm离心1分钟 获得基因组DNA溶液 取5 lDNA溶液 以1 0 agarose电泳检测 剩余DNA保存于 20 中 作为PCR扩增模板 植物基因组提取步骤 基因组DNA质量可通过琼脂糖电泳初步检测 基因组DNA片段应在20kb 30kb之间 高质量的基因组DNA带型单一无拖尾现象 预期结果 移液器的使用选择合适量程2个档位保养与维护离心机的使用配平时间配合 注意事项 基于DNA的半保留复制原理 通过温度变化控制模板变性 引物退火和引物延长的多个循环来扩增特异DNA序列的过程 上一轮的扩增产物又作为下一轮扩增的模板 使得扩增呈指数增长 因而可作为核酸检测的一种非常灵敏的技术 PCR扩增原理 PCR体系构成 Predenatue90 95 3 5minDenature 90 96 双链DNA模板在热作用下 氢键断裂 形成单链DNA30sec 1minAnneal 25 65 系统温度降低 引物与DNA模板结合 形成局部双链30sec 1mindependsontheduplexExtension 70 75 在Taq酶的作用下 以dNTP为原料 从引物的5 端 3 端延伸 合成与模板互补的DNA链About1min 30secper500bp 25 30cyclesFinalextension72 10min PCR步骤 PCR扩增 模板稀释 将提取的各组基因组DNA稀释20倍 作为模板 并分发给各组 稀释至200 l为各组分装10 l随机引物 全班选取16种随机引物 每组一种 PCR体系 25 l RAPD模板和引物组合 PCR条件 加样需在PCR专用的薄壁管中体系内同样的成分 水 buffer 引物 dNTP taq酶 可预先配置成预混液 再分装至各管 预混液的配制 按比例放大 并需考虑加样误差在各管中加入不同成分 模板DNA 加入反应预混液后 混匀 注意事项 琼脂糖是一种线性多糖聚合物 来源于海藻 琼脂糖溶液加热到沸点后冷却凝固将形成良好的电泳介质 糖链依氢键及其它力的作用使其互相盘绕形成绳状琼脂糖束 构成大网孔型凝胶 其密度由琼脂糖的浓度决定 可用于核酸与核蛋白的分离 鉴定及纯化分析 琼脂糖凝胶电泳 将凝胶成形模具封好 水平放置 并放置梳齿

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