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灵芝多糖结构分析方法研究进展 宋 莉 师俊玲 西北农林科技大学食品科学与工程学院 陕西杨凌 712100 摘要综述了目前用于多糖结构分析的主要方法及其在灵芝多糖结构研究中的应用 以及灵芝多糖结构方面的研究进展 关键词灵芝 多糖 结构 分析 中图分类号S567 3 1 文献标识码A文章编号0517 6611 2012 10 06177 03 Advances in Analysis Methods of the Structure of Ganoderma lucidum Polysaccharide SONG Li et al College of Food Science and Engineering Northwest A F University Yangling Shaanxi 712100 AbstractThe main methods for analyzing the structure of polysaccharide were summarized moreover the application of these methods in the structure of G lucidum polysaccharide and the research progress were reviewed Key wordsGanoderma lucidum Polysaccharide Structure Analysis 作者简介宋莉 1987 女 重庆人 硕士研究生 研究方向 食品生 物技术 通讯作者 教授 博士 从事食品生物技术研究 E mail sjlshi2004 yahoo com cn 收稿日期2011 12 26 多糖是由多个单糖分子以糖苷键结合而成的大分子化合 物 广泛存在于植物 动物和微生物组织中 是生命有机体的重 要组成部分 并具有多种生物活性 真菌多糖则是从食药用真 菌子实体 菌丝体和发酵液中提取出来的一类活性多糖 灵芝是多孔菌科灵芝属的子实体或菌丝体 是一种白腐 菌 有滋补强壮 扶正固本之功效 自古便被列为名贵药材 尤其在中国 日本和韩国 1 灵芝多糖是灵芝的主要生物活 性成分之一 具有免疫调节 抗肿瘤 抗病毒 抗衰老 抗氧 化 降血糖 降血脂等生物活性 2 灵芝多糖的结构与生物 活性存在重要的构效关系 对结构的研究是深入了解多糖 改造多糖的基础 3 但多糖结构的复杂性为结构分析带来了 很多困难 近年来随着分析技术的发展 对灵芝多糖结构的 研究取得了重要进展 笔者在相关研究的基础上 对多糖结 构的研究方法进行了总结 并对灵芝多糖的最新研究成果进 行了综述 1多糖的结构特点 多糖的结构分为初级结构和高级结构 初级结构即一 级结构 高级结构为二 三 四级结构 一级结构是指糖基组 成 糖基排列顺序 相邻糖基的连接方式 异头碳构型以及糖 链有无分支 分支的位置与长短等 4 5 二级结构是指多糖 主链间以氢键为主要次级键而形成的有规则的构象 三级 结构和四级结构是指二级结构在有序的空间里产生的有规 则的构象 多糖的高级结构与其活性的关系更加密切 研究 也更为困难 6 2灵芝多糖结构分析方法 多糖结构的分析方法主要分为化学分析法 仪器分析法 和生物学方法 3 类 近年来发展较快的是仪器分析法和生物 学方法 7 2 1化学分析法化学法在多糖结构分析中的应用已经 较为成熟 主要包括水解法 高碘酸氧化法 Smith 降解法 甲 基化反应和气质联用等 其中水解法是分析多糖链组成的 主要手段 包括完全酸水解 部分酸水解 乙酰解和甲醇解 等 高碘酸法可用于判断糖苷键的位置 直链多糖的聚合度 和支链多糖的分支数 Smith 降解法由降解的产物可推断糖 苷键的位置 甲基化反应可确定单糖残基的连接位置 何晋浙等 8 以改良 Hakmori 法将多糖甲基化 将甲基化 产物进行 GC MC 分析得出单糖组成及糖链结构 Amaral 等 9 对灵芝多糖 DESSK5 进行甲 基 化 反 应 结 果 显 示 DESSK5 是吡喃葡萄糖 其支链结构中 24 7 为非还原端 26 8 为 3 O 取代基 28 5 为 4 O 取代基 20 0 为 3 6 di O 取代基 使用化学方法分析多糖时通常需要与仪器分析结合使 用 此外 化学分析法样品用量大 操作复杂 随着物理科学 的发展 化学分析法已逐渐被仪器分析法所取代 2 2仪器分析法仪器分析所需样品少 操作方便 灵敏 度高 多糖的一级结构分析常用红外光谱法 IR 质谱法 MS 气相色谱法 GC 高效液相色谱法 HPLC 等 多糖 的高级结构分析常用核磁共振法 NMR X 射线衍射光谱 原子力光谱 旋光谱 圆二色谱等 10 2 2 1紫外分析法 UV UV 广泛应用于多糖的结构研究 中 常采用苯酚 硫酸法于 490 nm 处测定多糖的含量 260 和280 nm 处常用于检测多糖中是否含核酸和蛋白质 Zhao 等 11 将两个灵芝多糖层析纯化组分溶解并稀释到 2 mg ml 于紫外分光光度计中扫描波长范围 200 400 nm 在 280 和 260 nm 处均无吸收峰 说明多糖中无蛋白质及核酸 何晋浙 等 12 用紫外光谱分析灵芝多糖 发现在1 044 1 079 cm 1附 近有吸收峰 为吡喃糖环内酯和羟基的共振吸收峰特征峰 此外 在 892 9 cm 1存在 糖苷键连接特征吸收峰 证明该 灵芝多糖为 葡聚糖 2 2 2色谱法 色谱法包括 GC 和 HPLC 用于多糖的分离 纯化 单糖组分分析 分子量的测定等 Yang 等 13 用 HPLC 分析灵芝多糖 GLP 结果显示它由木糖 果糖 葡萄糖 蔗糖 麦芽糖组成 物质的量比为 0 4 14 4 12 8 0 7 50 9 王冠英 等 14 通过 GC 分析得出一种灵芝子实体多糖的单糖组成以 半乳糖和葡萄糖为主 伴有甘露糖 岩藻糖 郑静等 15 应用 HPLC 分析得出灵芝多糖 GLP1 1 是杂多糖 含 40 26 D 葡 萄糖 22 03 鼠李糖 12 23 木糖 18 45 D 半乳糖 王赛 安徽农业科学 Journal of Anhui Agri Sci 2012 40 10 6177 6179 6188责任编辑郑丹丹责任校对卢瑶 贞等 16 将3 种灵芝子实体多糖的水解物 PMP 衍生化 采用 HPLC 于 245 nm 紫外检测 等度洗脱 实现了较好的分离 确 定了单糖组成及其物质的量比 2 2 3红外光谱法 IR IR 主要用于确定糖苷键构型及常 规官能团 在 500 4 000 cm 1对多糖进行红外光谱扫描 糖苷键常在 840 cm 1出现峰 糖苷键常在 890 cm 1出现 峰 在 1 010 1 100 cm 1若有 3 个强吸收峰则可判定为吡喃 糖苷 若有 2 个峰则为呋喃糖苷 810 870 cm 1是甘露糖的吸 收峰 1 260 与 1 730 cm 1是酯基或 O 乙酰基的特征吸收峰 3 440 cm 1处为 OH 的吸收峰 2 935 cm 1处为C H 伸缩振动 的吸收峰 7 Liu 等 17 利用 IR 分析两种灵芝多糖 GLP 和 H GLP 发 现 H GLP 在2 970 和 1 379 cm 1处出现了新的吸收峰 验证 了 H GLP 是在 GLP 上通过结构改造引入了 CH3基团 Xu 等 18 将灵芝子实体多糖 GLP 羧基衍生化得到 C GLP 两种 多糖在 500 4 000 cm 1中有相似的红外光谱 但在 1 601 和 1 421 cm 1处的 2 个强吸收峰证实了 C GLP 中羧基的存在 Guo 等 19 用傅立叶变换红外光谱法对灵芝孢子多糖 GSG 进 行分析 样品使用量仅 1 mg 光谱在 890 和 850 cm 1处有吸 收峰 分别是 和 构型的特征吸收峰 此外 1 078 和1 039 cm 1处的吸收峰证明了 GSG 为吡喃糖 2 2 4质谱法 MS MS 具有样品用量少 快速 灵敏 分析 结果直观的优点 在多糖的结构研究中应用广泛 一般常将 GC MS 联用 分析多糖的单糖组成及其物质的量比 此方法 要求待测样品制备成衍生物 一般衍生方法有三甲基硅烷 化 三醋酸酯衍生化和糖醇醋酸酯衍生化等 何晋浙等 12 通过 GC 分析得出一种灵芝多糖的单糖组 分中 89 为葡萄糖 再经 GC MS 分析 结果显示多糖产生的 主要离子碎片峰与葡萄糖标准图谱高度匹配 说明该灵芝多 糖是主要由葡聚糖组成的均一多糖 Liu 等 20 将灵芝多糖 GLPL1 和 GLPL2 甲基化处理后用 GC MS 分析 得出这两种 多糖均是葡聚糖 糖链骨架由 1 3 糖苷键 1 4 糖苷键 1 6 糖苷键构成 24 的侧链存在于 C 6 或 C 3 处 3 7 的侧链存在于 C 6 或 C 4 处 近年来 MS 在多糖分析中的应用又有了新的发展 如快 原子轰击质谱 FAB MS 电喷雾电离质谱 ESI MS 基质辅 助激光解吸电离质谱 MALDI MS 等相继应用到多糖结构的 检测中 此类软电离技术采用飞行时间 TOF 检测器进行检 测 可弥补多糖的难挥发性 热不稳定性 高度聚合性不足等 不利于结构分析的缺点 21 Li 等 22 对一种灵芝发酵胞外多 糖 GLP 2 采用改良的 Hakomori 法进行甲基化 其部分甲基 化糖醇乙酰化衍生物的碎片离子通过 EI MS 分析其糖基连 接方式 2 2 5电泳法 毛细管电泳法 CE 可用于多糖分子量的 测定 寡糖的组成分析 纯度鉴定及结构归属分析 此法快 速 高效 灵敏 梁加贝等 23 将灵芝多糖水解 经 PMP 衍生 化后采用 CE 分析 得出其单糖组成为葡萄糖 半乳糖 木糖 甘露糖 它们的物质的量比为 4 5 2 8 1 3 3 6 十二烷基磺酸钠 聚丙烯酰胺凝胶电泳 聚偏氟乙烯 薄膜电迁移技术 SDS PAGE PVDF 可将电泳凝胶上的糖蛋 白基本上定量转移到聚偏氟乙烯薄膜上 在此膜上可直接进 行溴化氢降解 也可进行各种蛋白酶 糖肽酶和糖苷酶的水 解 分析其氨基酸和糖基组成 还可把膜直接置于蛋白质序 列仪或质谱上进行序列分析 从而获得 Pmol 级糖蛋白的肽 链和糖链结构以及糖肽连接方式 7 荧光基团标记的糖的聚丙烯酰胺凝胶电泳 PAGEFS 通 过对糖类分子的还原端羰基进行荧光基团衍生化标记后进 行聚丙烯酰胺凝胶电泳 这样既增强了糖分子的检测灵敏 度 又使通常呈中性的糖类分子带上电荷在电泳系统中进行 分离 可以实现对多个样品进行平行的分离和定性分析 李 开本等 24 对2 株灵芝 GA 2 和 GA 9 进行聚丙烯酰胺凝胶电 泳 发现两者图谱基本一致 2 2 6核磁共振法 NMR NMR 法常用于分析多糖的高 级结构 确定糖残基数 单糖构型 单糖组分化学位移 异头 构型 单糖间连接位置的顺序以及取代基的位置等 NMR 法可获得多糖较完全的结构信息而不破坏样品 多糖的整体结构信息可由一维 1HNMR 和13CNMR 谱得 到 25 26 其中1HNMR 用于研究糖苷键构型 13CNMR 用于确 定碳的位置并测定多糖中不同残基的比例 21 多糖中相关 碳氢连接方式的信息可由二维 NMR 谱给出 如同核化学位 移相关谱 COSY 1H 检测的异核多量子相干 相 关 谱 HMQC 1H 检测的异核多键相干相关谱 HMBC 等 黄静涵等 27 对灵芝多糖 GLPS1a 进行 NMR 分析 其13C NMR 的化学位移数据显示 在 70 有 4 个碳信号 证明该 多糖有 4 个重复单位存在 在 100 和 104 分别有异头碳信 号 证实 和 构型存在 此外 GLPS1a 的 13C NMR 谱在异 头碳共振范围内 98 110 出现 7 个共振信号 说明该 GLPS1a 有 7 个残基 异头碳 组成 98 7 与 78 4 分别是异 头碳和连接碳位移 说明 GLPS1a 中存在 1 2 糖苷键 由于 O 取代发生在 C2 位上 因而连接碳的共振信号向低磁场位 移 70 75 76 85 同时说明分子中有以 1 2 糖苷键 连接的侧链存在 102 4 和83 7 两处的共振信号说明灵芝 多糖分子中存在 1 4 糖苷键相连接的侧链 104 3 和86 7 的共振信号进一步肯定了 GLPS1a 存在 1 3 糖苷键 105 4 和71 8 两处的共振信号说明多糖分子中存在 1 6 糖苷键相连的侧链 Huang 等 28 用 GC MC 结合1H 和13 C NMR 的检测结果得出 一种水溶性灵芝多糖 GLP F1 1 主要 由 1 4 吡喃糖和 1 4 6 吡喃糖组成 Ye 等 29 采用 CO SY TOCSY HMBC HSQC ROESY 并结合 GC MS 对灵芝多 糖 GLPCW 进行结构分析 得出其重复单元的结构 2 2 7原子力显微镜 AFM AFM 是在扫描隧道显微镜基 础上发展起来的一种新的结构分析方法 可对生物大分子的 形态和构象进行直观的观察和研究 30 AFM 可在三维立体 上观察大分子链形貌和尺寸 并能够获得原子探针与大分子 链相互作用的信息 31 Wang 等 32 用 AFM 对 3 种灵芝多糖 进行扫描 在多糖水溶液中观察到以紧凑的套环链形式存在 8716安徽农业科学2012 年 的单分散球体 平均半径分别为 36 41 和 60 nm 除直接观察外 还可运用某些间接手段分析多糖分子结 构 如通过酶作用前后其分子形貌学上的差异来研究这些酶 与多糖的结合位点及一系列其他数据 进而探索其支链结构 以及这些结构对结合酶能力的影响 另外 基于 AFM 的单分 子力谱可用于研究多糖的力扩展谱 通过力扩展谱进行空间 结构的分析 2 2 8X 射线衍射法 XRD XRD 能较好地分析生物大分 子的空间构象 已成功用于蛋白质和核酸的三维结构测定 在多糖结构分析中可用于分析其晶态结构 X 射线通过晶体 时 引起晶体中原子的电子振动而产生次级射线 从而得到 晶体的晶胞参数和晶格常数 计算机结合立体化学的信息模 拟出多糖的构型 33 Qian 等 34 对几种灵芝多糖进行 XRD 分析 得到的 X 射 线衍射曲线显示所有灵芝多糖均为非结晶态 何晋浙等 12 对灵芝多糖的 XRD 分析结果显示 灵芝多糖在 2 为 14 1 30 处有 2 个很小的衍射峰 几乎为无定性区 说明灵芝多糖 中含结晶性的多糖或多糖复合物极少 结晶度均非常低 均 处在无定形的状态 2 2 9圆二色谱 CD CD 是研究生物大分子空间结构的 重要手段 可用于分析多糖的三维结构 得到其绝对构型 构 象等信息 中性多糖由于缺少一般紫外区可提供信息的结 构 难以直接得到由CD 谱提供的结构信息 通常将多糖与刚 果红络合或进行衍生化后进行测定 但多糖的 CD 数据库 尚未完善 且要求被研究的手性分子具有发色团 因此限制 了此技术的应用范围 21 2 3生物学方法酶学方法可用于分析多糖链中糖苷键 类型和糖肽连接方式 酶解的高度专一性和放射性标记方 法的引入使得这种方法十分有效并被广为采用 Guan 等 35 向灵芝多糖溶液中加入阿拉伯聚糖酶 木聚糖酶 1 4 D 半 乳糖酶 纤维素酶 果胶酶 淀粉酶 异淀粉酶 在最佳酶解 条件下酶解过夜 然后于 85 加热 30 min 灭酶 15 700 g 离 心 30 min 取上清液进行 HPSEC 和衍生化分析 此外 免疫学方法也用于分析糖链的结构 多糖会抑制 抗体 抗原的相互结合 不同的糖有不同的抑制常数 通过 测定其抑制常数 再与已知结构的糖链相比较 有相近抑制 常数的多糖具有相似结构 3展望 近年来 在多糖结构研究方面的分析技术取得了很大进 展 对灵芝多糖的结构分析也获得大量成果 但是一些新兴 的分析方法在灵芝多糖结构分析中的应用仍然比较有限 对 灵芝多糖结构的研究 特别是高级结构和空间构象的研究仍 然有待进一步深入 灵芝多糖的结构研究应在经典分析方法的基础上 引入 免疫生物化学 PCR 等现代分子生物学技术 进行结构与活 性的系统研究 并借助最新的仪器与计算机模拟技术 研究 和模拟多糖在溶液中的构象变化 以研究糖类物质在参与生 命活动 产生生物效应时的精细结构 参考文献 1 RUSSELL R PATERSON M Ganoderma A therapeutic fungal biofactory J Phytochemistry 2006 67 1985 2001 2 RUSSELL R PATERSON M Cordyceps A traditional Chinese medicine and another fungal therapeutic biofactory J 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下转第 6188 页 971640 卷10 期宋 莉等灵芝多糖结构分析方法研究进展 菌种的面积比分别达 10 90 和 9 00 GN1 GD1 所产纤溶酶 产酶菌活性最低 表1不同产地豆豉的豆豉纤溶酶产酶菌的活性 豆豉 水解圈直 径 mm 菌直径 mm 水解圈面积 S1 mm2 菌面积 S2 mm2 S1 S2 NC111 253 7599 351 611 039 19 00 NC210 183 5081 271 59 616 38 45 HN19 992 2578 303 93 974 119 72 GN112 725 41127 111 623 004 75 53 GD110 084 1976 681 913 765 15 57 GD210 943 3193 918 78 613 510 90 2 2菌种保藏结果由图 3 可知 采用该保藏方法保存的 菌落状态良好 将其进行后续试验 菌种活性也能满足试验 要求 因此 该保藏方法简便 经济 有效 3结论与讨论 从豆豉中分离具有纤溶活性的菌株 一般都是采用直接 点纤维蛋白平板法进行菌株的筛选 而该研究用新鲜的猪血 制成猪血粉 将其作为主要基质掺入培养基中 进行平板初 筛和摇瓶复筛 因为猪血粉颗粒部分溶解后 释放出来的色 素可在平板中自由扩散 所以在透明的水解圈形成之前就可 先观察到浅黄色的色素圈 因此该方法较之纯纤维蛋白作底 物的方法更为灵敏 另外 将溶解圈菌面积比值较大的菌株 进行液体的发酵培养 用标准的纤维蛋白平板可准确测定纤 溶活性的高低 该试验以我国传统食品豆豉作为菌源 所筛选的菌株生 产的纤溶酶有望开发为口服溶栓剂 或开发为具有溶栓功能 图1初筛培养得到的豆豉纤溶酶产酶菌菌落 图2豆豉纤溶酶产酶菌水解圈大小对比 图3保藏后的豆豉纤溶酶产酶菌单菌落 的保健食品 8 参考文献 1 刘常金 豆豉纤溶酶研究进展及前景 J 食品研究与开发 2004 25 4 20 S22 2 须见洋行 纳豆激酶与纤溶系统 J 化学与生物 1991 2 119 123 3 龚福明 柳陈坚 李海燕 豆豉纤溶酶的研究现状 J 生物技术通报 2009 11 34 38 4 张少平 郭勇 豆豉纤溶酶的分子生物学 J 生命的化学 2009 29 3 444 446 5 陶琳 孟凡涛 吴思方 豆豉溶栓酶的研究进展 J 氨基酸和生物资 源 2004 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