南蛇藤素可抑制肿瘤坏死因子α诱导RAW264.7细胞的炎症及增殖.doc

www.CRTER.org陈光福，等. 南蛇藤素可抑制肿瘤坏死因子诱导RAW264.7细胞的炎症及增殖南蛇藤素可抑制肿瘤坏死因子诱导RAW264.7细胞的炎症及增殖陈光福1，郭远清2，伍玉甜3(1广东医学院附属佛山禅城区中心医院脊柱外科，广东省佛山市 528031；2中山大学附属第五医院骨科，广东省珠海市 519000；3中山大学附属第一医院药学部，广东省广州市 510080)引用本文：陈光福，郭远清，伍玉甜. 南蛇藤素可抑制肿瘤坏死因子诱导RAW264.7细胞的炎症及增殖J.中国组织工程研究，2016，20(37):5552-5559.DOI: 10.3969/j.issn.2095-4344.2016.37.012 ORCID: 0000-0002-2560-8122(陈光福)文章快速阅读：南蛇藤素能够抑制肿瘤坏死因子诱导RAW264. 7细胞的炎症反应和增殖能力陈光福，男，1975年生，广东省翁源县人，汉族，2009年中山大学毕业，硕士，副主任医师，主要从事骨科基础与临床研究。中图分类号:R318文献标识码:B文章编号:2095-4344(2016)37-05552-08稿件接受：2016-06-23CCK8细胞增殖白细胞介素1，6，8和前列腺素E2ELISA肿瘤坏死因子南蛇藤素RAW264.7细胞炎性递质一氧化氮一氧化氮合酶，cyclin D1和cyclin E1 mRNA表达文题释义：南蛇藤素：南蛇藤是中国民间常用的一种植物药，有驱风除湿，活血解毒消肿功效，主治筋骨疼痛，四肢麻木，风湿性关节炎，腰腿痛，闭经，小儿惊风，痧症，痢疾，肿毒，跌打损伤。南蛇藤素天然存在于卫矛科植物南蛇藤的根，雷公藤的根等植物中，是具有多种生物活性的中药单体成分。肿瘤坏死因子：主要由巨噬细胞和单核细胞产生的促炎细胞因子，参与正常炎症反应和免疫反应。炎症是多种疾病的一个标志性特征，临床上许多疾病的转归都与肿瘤坏死因子介导的炎症反应有着密切关系。摘要背景：中药南蛇藤具有祛风活血、消肿止痛作用，而其有效单体成分南蛇藤素可能是其主要作用成分之一。目的：进一步验证南蛇藤素对肿瘤坏死因子诱导RAW264.7细胞炎症和增殖的作用。方法：用0，1，10和100 g/L肿瘤坏死因子刺激RAW264.7细胞建立体外炎症模型，用0.1，0.5，1.0，2.0 mol/L的南蛇藤素作用于该模型，ELISA法检测RAW264.7细胞白细胞介素1，6，8和前列腺素E2分泌能力，CCK-8比色法检测RAW264.7细胞存活率，硝酸还原酶法检测炎性递质一氧化氮生成，Real-time PCR检测诱导型一氧化氮合酶，cyclin D1和cyclin E1基因mRNA表达水平。结果与结论：以0.1、10和100 g/L肿瘤坏死因子孵育RAW264.7细胞后，与对照组(0 g/L)比较，能不同程度促进RAW264.7细胞白细胞介素1，6，8和前列腺素E2的分泌，增强一氧化氮的释放，促进细胞增殖并增加诱导型一氧化氮合酶，细胞周期蛋白 D1和细胞周期蛋白E1 的mRNA表达水平(P 0.05)，其中10 g/L肿瘤坏死因子对细胞的作用最强；0.4 mol/L南蛇藤素能明显抑制肿瘤坏死因子诱导的RAW264.7细胞白细胞介素1，6，8和前列腺素E2的分泌，降低一氧化氮的释放，抑制细胞增殖并下调诱导型一氧化氮合酶，细胞周期蛋白 D1和细胞周期蛋白E1的mRNA表达水平(P 0.05)；结果提示，南蛇藤素能够抑制肿瘤坏死因子诱导的RAW264. 7细胞的炎症反应和增殖能力。关键词：组织构建；组织工程；南蛇藤素；RAW264.7细胞；肿瘤坏死因子；炎症；炎症因子;增殖；细胞周期蛋白D1；细胞周期蛋白E1主题词：南蛇藤素；肿瘤坏死因子；炎症因子；细胞周期蛋白类基金资助：珠海市科技计划(2014D0401990016)5553 P.O.Box 1200,Shenyang 110004 Celastrol inhibits tumor necrosis factor-alpha induced proliferation and inflammatory responses in RAW264.7 cellsChen Guang-fu1, Guo Yuan-qing2, Wu Yu-tian3 (1Department of Spine Surgery, the Affiliated Foshan Chancheng District Center Hospital, Guangdong Medical University, Foshan 528031, Guangdong Province, China; 2Department of Orthopedics, Sun Yat-sen University No.5 Hospital, Zhuhai 519000, Guangdong Province, China; 3Department of Pharmacy, the First Affiliated Hospital, Sun Yat-sen University, Guangzhou 510080, Guangdong Province, China)AbstractBACKGROUND: Celastrol is one of the active components extracted from the traditional Chinese medicine Celastrus orbiculatus characterized by expelling the wind and promoting blood circulation and relieving swelling and pain.OBJECTIVE: To investigate the effects of celastrol on tumor necrosis factor- (TNF-) induced proliferation and inflammatory responses in RAW264.7 cells.METHODS: In vitro inflammatory cell models induced by TNF- (0, 1, 10, 100 g/L) were treated with celastrol (0.1, 0.5, 1.0, 2.0 mol/L). Interleukin-1, -6, -8 and prostaglandin E2 in the models were measured by enzyme-linked immunosorbent assay. Cell survival was determined by cell counting kit-8. The inflammatory mediator nitric oxide secretion was detected by nitrate reductase assay. mRNA expressions of inducible nitric oxide synthase, cyclin D1 and cyclin E1 were detected by real-time polymerase chain reaction technique. RESULTS AND CONCLUSION: Significantly increased secretion of interleukin-1, -6, -8, prostaglandin E2 and nitric oxide, cell proliferation, and mRNA expressions of inducible nitric oxide synthase, cyclin D1 and cyclin E1 were observed after the induction of TNF- (0.1, 10, 100 g/L) compared with the control group (without the induction of TNF-) (P 0.05); especially, 10 g/L of TNF- exhibited the strongest effects. 0.4 mol/L celastrol significantly suppressed TNF-induced release of interleukin-1, -6, -8, prostaglandin E2 and nitric oxide, cell proliferation, and mRNA expressions of inducible nitric oxide synthase, cyclin D1 and cyclin E1 in RAW264.7 cells (P 0. 05). Our results demonstrate that celastrol can inhibit TNF-induced inflammatory response and proliferation in RAW264.7 cells. Subject headings: Celastrus; Tumor Necrosis Factor-alpha; Inflammation; CyclinsFunding: the Science and Technology Planning Project of Zhuhai, China, No. 2014D0401990016Cite this article: Chen GF, Guo YQ, Wu YT. Celastrol inhibits tumor necrosis factor-alpha induced proliferation and inflammatory responses in RAW264.7 cells. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 2016;20(37):5552-5559.Chen Guang-fu, Master, Associate chief physician, Department of Spine Surgery, the Affiliated Foshan Chancheng District Center Hospital, Guangdong Medical University, Foshan 528031, Guangdong Province, China5557ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH0 引言 Introduction炎症是多种疾病的一个标志性特征，与炎症发生发展密切相关的炎症递质主要有白细胞介素1，6，8和肿瘤坏死因子等；当免疫系统受到刺激时，巨噬细胞释放各种炎症因子和趋化因子，如白细胞介素1，6，8，前列腺素E2等1，在炎症过程中起着重要的作用。众多的研究表明临床上许多疾病的转归都与肿瘤坏死因子介导的炎症反应有着密切关系2-4。肿瘤坏死因子是一种具有多种生物学功能的强效细胞因子，主要由单核细胞、T细胞、自然杀伤细胞等免疫细胞产生。肿瘤坏死因子在免疫和炎症反应中是重要的递质，可以调节血管内皮功能，诱生其他细胞因子，诱导细胞的抗病毒活性，刺激骨吸收、血管形成以及成纤维细胞有丝分裂发生等在正常情况下，它具有抗肿瘤、感染和促进组织修复等重要作用，对机体有利5；一旦持续释放，则会扩大炎症级联反应，造成机体发热、休克、恶病质和组织损伤6。因此，抑制肿瘤坏死因子介导的炎症反应，是许多疾病治疗的一个重要环节。正常水平的肿瘤坏死因子可以调节免疫应答、抗感染等，但大量产生和释放则会破坏机体的免疫平衡，与其他炎症因子一起产生多种病理损伤7。一氧化氮既是炎症反应与免疫调节的效应因子，也是关键的调节因子，在炎症级联反应中起着关键的调节作用8。南蛇藤素是从中药南蛇藤中提取的有效单体成，目前研究显示南蛇藤素不仅能够直接杀伤肿瘤细胞9，还具有抗血管生成和氧化抑制的生物活性10-12。 RAW264.7细胞是小鼠巨噬细胞系，一般被应用于炎症反应的研究13-14。目前关于南蛇藤素对炎症因子的调控作用及其机制的研究较少。实验拟探讨肿瘤坏死因子对RAW264.7细胞炎症反应与增殖的影响，在此基础上，观察南蛇藤素是否可以抑制肿瘤坏死因子诱导的小鼠RAW264.7细胞的炎症反应和增殖。1 材料和方法 Materials and methods 1.1 设计 南蛇藤素抗炎作用机制研究。1.2 时间及地点 实验于2014年5月至2015年5月在中山大学附属第一医院外科实验室完成。1.3 材料细胞：RAW264.7细胞购自武汉大学细胞保藏中心。南蛇藤素抑制炎症实验用主要试剂：试剂来源cck-8同仁公司胎牛血清Gibco公司DMEM培养液、TRIzol Reagent RNA提取试剂美国Invitrogen公司DNA Marker、反转录试剂盒日本TaKaRa公司PCR 试剂盒加拿大Fermentas公司ELISA 试剂盒美国RD 公司1.4 方法1.4.1 细胞培养 RAW264.7细胞用含体积分数10%胎牛血清的高糖DMEM培养基培养传代，于37 、体积分数5%CO2条件培养，取对数生长期细胞进行实验。拟用0.1，0.5，1.0，2.0 mol/L南蛇藤素作用RAW264.7细胞，筛选出对细胞活性无明显影响的理想作用浓度后，用0，1，10和100 g/L肿瘤坏死因子和或理想浓度的南蛇藤素作用于RAW264.7细胞，并进行下一步检测。1.4.2 ELISA检测RAW264.7细胞上清液白细胞介素1，6，8和前列腺素E2分泌 方法参照文献报道15，用含有用0，1，10和100 g/L肿瘤坏死因子和或 0.4 mol/L南蛇藤素作用RAW264.7细胞12 h后，胰酶消化细胞，以1104/孔接种于96孔板，体积分数1%血清的DMEM培养液培养48 h后，收集上清液，4 离心，ELISA检测RAW264.7细胞上清液白细胞介素1，6，8和前列腺素E2分泌情况。1.4.3 细胞存活率的检测 方法参照文献报道16，取对数生长期细胞，以5 000个/孔接种于96孔板，37 、体积分数5%CO2条件下培养过夜待细胞贴壁，用含有不同处理因素的培养基培养细胞12 h，胰酶消化细胞，以1104/孔接种于96孔板，每组设5个复孔，36 h后检测细胞存活率。处理结束后加入CCK-8(每孔100 L加 10 L CCK-8)，轻摇，37 孵育4 h，然后用酶联免疫检测仪测定每孔在450 nm波长处的吸光度。取5孔吸光度值的平均值，按公式计算各组细胞存活率，实验重复3次。以0 g/L肿瘤坏死因子组为对照组，存活率为100%。存活率(%)=(实验组吸光度-空白对照组吸光度)/ (正常对照组吸光度-空白对照组吸光度)100%。1.4.4 硝酸还原酶法检测上清液中炎性递质一氧化氮水平 方法参照文献报道17，取对数生长期细胞，以 5 000个/孔接种于96孔板，37 、体积分数5%CO2条件下培养过夜待细胞贴壁，用含有不同处理因素的培养基培养细胞12 h，胰酶消化细胞，以1104/孔接种于96孔板，每组设5个复孔，36 h后用一氧化氮试剂盒检测上清液中一氧化氮释放量，按试剂盒说明书进行操作。1.4.5 实时PCR检测细胞中诱导型一氧化氮合酶、Cyclin D1和Cyclin E1 mRNA的表达水平 方法参照文献报道18，取对数生长期细胞，37 、体积分数5%CO2条件下培养过夜待细胞贴壁，用含有不同处理因素的培养基培养细胞12 h后，提取总RNA。以cDNA为模板，用PCR检测目标基因mRNA的表达水平。引物序列：诱导型一氧化氮合酶上游5-GCC CTG CTT TGT GCG AAG-3，下游5-GCC CTT TGT GCT GGG AGT C-3；Cyclin D1上游引物5-ATT TCC AAC CCA CCC TCC AT-3，下游引物5-GGC TTC AAT CTG TTC CTG GC-3；Cyclin E1上游引物5-AGC CTC GGA AAA TCA GAC CA-3，下游引物5-CTT CGC ACA CCT CCA TTA GC-3。1.5 主要观察指标 ELISA法检测肿瘤坏死因子刺激RAW264.7细胞建立体外炎症模型白细胞介素1，6，8和前列腺素E2分泌能力，CCK-8比色法法检测RAW264.7细胞存活率，硝酸还原酶法检测炎性递质一氧化氮生成， Real-time PCR检测诱导型一氧化氮合酶，cyclin D1和cyclin E1基因mRNA表达水平。1.6 统计学分析 实验数据采用s表示，用SPSS 13.0统计软件进行统计学处理，采用单因素方差分析或t 检验，以P 0.05认为差异有显著性意义。2 结果 Results 2.1 南蛇藤素对RAW264.7细胞生长增殖的影响 CCK8法结果表明，当浓度为0.1，0.5 mol/L时，南蛇藤素对RAW 264.7细胞增殖无明显抑制作用；当南蛇藤素浓度为1.0，2.0 mol/L时，南蛇藤素对RAW 264.7细胞表现出明显的抑制作用。因此，为避免炎症因子水平的降低是由于南蛇藤素直接的细胞毒作用引起的，实验选取0.5 mol/L作为实验浓度(图1)。肿瘤坏死因子 0 g/L肿瘤坏死因子 10 g/L肿瘤坏死因子 1 g/L肿瘤坏死因子 0 g/LBA肿瘤坏死因子 10 g/L+0.5 mol/L南蛇藤素肿瘤坏死因子 100 g/L肿瘤坏死因子 10 g/L1 2001 00080060040020001 2001 0008006004002000白细胞介素1 白细胞介素6 白细胞介素8 前列腺素E2以0 g/L 肿瘤坏死因子组为对照组(100%)aaaabbbb以0 g/L 肿瘤坏死因子组为对照组(100%)aaaaaaaaaaaa白细胞介素1 白细胞介素6 白细胞介素8 前列腺素E2图2 南蛇藤素降低肿瘤坏死因子诱导RAW264.7细胞白细胞介素1、白细胞介素、白细胞介素8和前列腺素E2分泌结果Figure 2 Celastrol suppressed the secretion of interleukin-1, -6, -8, prostaglandin E2 induced by tumor necrosis factor- in RAW264.7 cells图注：以0 g/L 肿瘤坏死因子组为对照组(100%)。图A为不同质量浓度肿瘤坏死因子诱导RAW264.7细胞白细胞介素1、白细胞介素6、白细胞介素8和前列腺素E2分泌结果，与对照组相比，aP 0.05；B为南蛇藤素降低10.0 g/L肿瘤坏死因子诱导RAW264.7细胞白细胞介素1、白细胞介素6、白细胞介素8和前列腺素E2分泌。与0 g/L 肿瘤坏死因子组相比，aP 0.05；与10 g/L 肿瘤坏死因子组相比，bP 0.05。BA以0 g/L 肿瘤坏死因子组为对照组(100%)aaa肿瘤坏死因子10 g/L+0.5 mol/L南蛇藤素肿瘤坏死因子 0 g/L肿瘤坏死因子 100 g/L肿瘤坏死因子 10 g/L肿瘤坏死因子 0 g/L肿瘤坏死因子 1 g/L250200150100500以0 g/L 肿瘤坏死因子组为对照组(100%)图3 南蛇藤素抑制肿瘤坏死因子诱导RAW264.7细胞增殖Figure 3 Celastrol suppressed tumor necrosis factor-induced proliferation of RAW264.7 cells图注：以0 g/L 肿瘤坏死因子组为对照组(100%)。图A为不同质量浓度肿瘤坏死因子诱导RAW264.7细胞增殖结果，与对照组相比，aP 0.05；B为南蛇藤素降低10.0 g/L肿瘤坏死因子诱导RAW264.7细胞增殖。与0 g/L 肿瘤坏死因子组相比， aP 0.05；与10 g/L 肿瘤坏死因子组相比，bP 0.05。200180160140120100806040200肿瘤坏死因子 10 g/Lab120100806040200aa0 mol/L南蛇藤素组为对照组100%0 0.1 0.5 1 2 南蛇藤素浓度(mol/L)图1 南蛇藤素作用24 h对RAW264.7细胞增殖的影响Figure 1 The proliferation of RAW264.7 cells following 24-hour treatment of celastrol图注：以0 mol/L南蛇藤素组为对照组(100%)。与对照组相比，aP 0.05。 2.2 南蛇藤素降低肿瘤坏死因子诱导RAW264.7细胞白细胞介素1，6，8和前列腺素E2分泌 为了观察RAW264.7细胞白细胞介素1，6，8分泌，用ELISA检测RAW264.7细胞白细胞介素1，6，8和前列腺素E2分泌。用0，1，10和100 g/L肿瘤坏死因子作用RAW264.7细胞24 h后，与对照组比较，能不同程度促进RAW264.7细胞白细胞介素1，6，8和前列腺素E2分泌，10 g/L组细胞白细胞介素1，6，8和前列腺素E2分泌能力最强，结果均有显著性意义(P 0.05；图2A)。用0，10 g/L肿瘤坏死因子和10 g/L 肿瘤坏死因子+南蛇藤素孵育RAW264.7细胞24 h后，与10 g/L肿瘤坏死因子组相比，能明显抑制RAW264.7细胞白细胞介素1，6，8和前列腺素E2的分泌，差异有显著性意义(P 0.05；图2B)。aaaBAb肿瘤坏死因子 0 g/L50403020100a一氧化氮(mol/L)50454035302520151050一氧化氮(mol/L)肿瘤坏死因子 0 g/L图4 南蛇藤素抑制肿瘤坏死因子诱导的小鼠RAW264.7细胞释放一氧化氮结果Figure 4 Celastrol suppressed tumor necrosis factor-induced release of nitric oxide in RAW264.7 cells图注：图A为不同质量浓度肿瘤坏死因子诱导的小鼠RAW264.7细胞释放一氧化氮结果。与对照组相比，aP 0.05；图B为南蛇藤素抑制10 g/L肿瘤坏死因子诱导的小鼠RAW264.7细胞释放一氧化氮。与0 g/L 肿瘤坏死因子组相比，aP 0.05；与10 g/L 肿瘤坏死因子组相比，bP 0.05。 肿瘤坏死因子 10 g/L肿瘤坏死因子 100 g/L肿瘤坏死因子 1 g/L肿瘤坏死因子10 g/L+0.5 mol/L南蛇藤素肿瘤坏死因子 10 g/LB肿瘤坏死因子 1 g/L肿瘤坏死因子 0 g/LA肿瘤坏死因子 10 g/L+0.5 mol/L南蛇藤素肿瘤坏死因子 0 g/L肿瘤坏死因子 10 g/L肿瘤坏死因子 100 g/L肿瘤坏死因子 10 g/L相对mRNA表达1614121086420bbb细胞周期蛋白D1一氧化氮合酶细胞周期蛋白E1aaaaaaaaaa细胞周期蛋白D1细胞周期蛋白E1一氧化氮合酶aa图5 南蛇藤素抑制肿瘤坏死因子诱导RAW264.7细胞诱导cyclin D1和cyclin E1的mRNA表达Figure 5 Celastrol suppressed the mRNA expressions of inducible nitric oxide synthase, cyclin D1 and cyclin E1 induced by tumor necrosis factor- in RAW264.7 cells图注：图A为不同质量浓度肿瘤坏死因子诱导RAW264.7细胞诱导cyclin D1和cyclin E1的mRNA表达，与对照组相比，aP 0.05；B为南蛇藤素抑制10 g/L肿瘤坏死因子诱导RAW264.7细胞诱导cyclin D1和cyclin E1的mRNA表达。与0 g/L 肿瘤坏死因子组相比，aP 0.05；与10 g/L肿瘤坏死因子组相比，bP 0.05。 1614121086420相对mRNA表达2.3 南蛇藤素抑制肿瘤坏死因子诱导RAW264.7细胞增殖 为了观察细胞增殖的变化，用CCK8检测RAW264.7细胞增殖情况。用肿瘤坏死因子孵育RAW264.7细胞36 h，0，1，10和100 g/L肿瘤坏死因子作用RAW264.7细胞36 h，与对照组比较，能不同程度促进RAW264.7细胞的生长，10 g/L组细胞增殖能力增强，差异有显著性意义(P 0.05；图3A)。用0，10 g/L 肿瘤坏死因子和10 g/L 肿瘤坏死因子+南蛇藤素孵育RAW264.7细胞36 h，与10 g/L 肿瘤坏死因子组相比，能明显抑制RAW264.7细胞的增殖(图3B)。2.4 南蛇藤素抑制肿瘤坏死因子诱导的小鼠RAW264.7细胞释放一氧化氮 硝酸还原酶法检测炎性递质一氧化氮生成结果显示，用0，1，10和100 g/L 肿瘤坏死因子作用RAW264.7细胞24 h后，与对照组比较，能不同程度促进RAW264.7细胞释放一氧化氮， 10 g/L组细胞释放一氧化氮能力最强，差异有显著性意义(P 0.05；图4A)。用0，10 g/L肿瘤坏死因子和10 g/L肿瘤坏死因子+0.4 mol/L南蛇藤素孵育RAW264.7细胞24 h后，与10 g/L肿瘤坏死因子组相比，能明显抑制RAW 264.7细胞释放一氧化氮，差异有显著性意义(P 0.05；图4B)。2.5 南蛇藤素抑制肿瘤坏死因子诱导RAW264.7细胞诱导型一氧化氮合酶，cyclin D1和cyclin E1的mRNA表达 为了观察细胞增殖相关基因表达，用Real time PCR检测RAW264.7细胞诱导型一氧化氮合酶，cyclin D1和cyclin E1的mRNA表达。用0，1，10和100 g/L 肿瘤坏死因子作用RAW264.7细胞24 h后，与对照组比较，能不同程度促进RAW264.7细胞诱导型一氧化氮合酶，cyclin D1和cyclin E1的mRNA表达，10 g/L组细胞诱导型一氧化氮合酶，cyclin D1和cyclin E1的mRNA表达最高，差异有显著性意义(P 0.05；图5A)。用0，10 g/L肿瘤坏死因子和10 g/L肿瘤坏死因子+0.4 mol/L南蛇藤素孵育RAW264.7细胞24 h后，与10 g/L肿瘤坏死因子组相比，能明显抑制RAW264.7细胞诱导型一氧化氮合酶，cyclin D1和cyclin E1的mRNA表达，差异有显著性意义(P 0.05；图5B)。3 讨论 Discussion炎症反应作为众多疾病的一个早期反应，在疾病的发生发展中占有着重要的位置，而巨噬细胞则是调节炎性疾病的一个靶细胞，当机体受到外来刺激的时候，巨噬细胞会发生活化，继而分泌大量的炎症递质，促进炎症的发生发展19。白细胞介素1，6，8和前列腺素E2等炎症因子常作为炎症因子的检测指标20-26，在多种疾病中表达上调，如骨性关节炎27-29，类风湿关节炎30-35，强直性脊柱炎36-38。作者此次实验发现，肿瘤坏死因子刺激细胞后，白细胞介素1，6，8和前列腺素E2等炎症因子的表达明显上调，在应用南蛇藤素后，可以抑制肿瘤坏死因子诱导的RAW264.7细胞白细胞介素1，6，8和前列腺素E2等炎症因子的表达，说明南蛇藤素通过抑制炎性细胞因子参与了抑制炎症反应的过程。一氧化氮是一种简单却不稳定的自由基，参与多种生理和病理过程。在体内一氧化氮是由一氧化氮合酶催化L-精氨酸产生。诱导型一氧化氮合酶主要是在炎症和免疫刺激下表达，进而催化一氧化氮持续生成，过量的一氧化氮则会促进炎症性疾病的发生和发展，并可作为一种炎症的观察指标39-42。此次实验发现，在不同处理情况下，南蛇藤素对肿瘤坏死因子活化的RAW264.7细胞分泌一氧化氮和细胞诱导型一氧化氮合酶mRNA表达有一定的抑制作用，这提示南蛇藤素可以通过抑制肿瘤坏死因子激活的巨噬细胞分泌一氧化氮来发挥抗炎作用。此次实验结果显示，南蛇藤素可以抑制肿瘤坏死因子诱导的RAW264.7细胞增殖，通过抑制RAW264.7细胞 Cyclin D1，Cyclin E1表达可能是其发挥作用的主要途径。Cyclin D1和Cyclin E1 都属于G1期周期蛋白，如果Cyclin D1表达在G1期受到抑制，细胞将不能进入S期；Cyclin E1也在细胞由G1期进入S期过程中发挥作用43-46。因此，Cyclin D1，Cyclin E1表达受到抑制后，会阻碍细胞的分裂增殖，从而减少RAW264.7细胞的活化，减少炎症反应。南蛇藤素下调Cyclin D1，Cyclin E1的表达，使得RAW264.7细胞的增殖受到抑制，可能是其发挥抗炎作用的途径。中国许多的传统中药都具有抗炎、抗免疫作用，这些中药单体大都能通过影响细胞分泌炎症因子来减轻炎症反应，从而起到改善疾病的作用。许多具有抗炎作用的中药单体其抗炎作用机制也不是很清楚，所以需要进一步的研究探索，进而更明确地阐述中药发挥其抗炎作用的机制，为临床应用提供科学的依据。综上所述，南蛇藤素对肿瘤坏死因子刺激的RAW264. 7细胞炎症和增殖具有一定的抑制作用，其作用机制可能与南蛇藤素能够调控炎性因子表达，抑制一氧化氮的释放、降低诱导型一氧化氮合酶、Cyclin D1和Cyclin E1的表达有关。作者贡献：陈光福设计本实验，郭远清评估者实验结果，伍玉甜完成本实验研究。利益冲突：所有作者共同认可文章内容不涉及相关利益冲突。伦理问题：本论文没有与相关伦理道德冲突的内容。文章查重：文章出版前已经过CNKI反剽窃文献检测系统进行3次查重。文章外审：文章经国内小同行外审专家双盲外审，符合本刊发稿宗旨。作者声明：文章第一作者对研究和撰写的论文中出现的不端行为承担责任。论文中涉及的原始图片、数据(包括计算机数据库)记录及样本已按照有关规定保存、分享和销毁，可接受核查。文章版权：文章出版前杂志已与全体作者授权人签署了版权相关协议。4 参考文献 References1 Ma Y, Pope RM. 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