流式细胞仪原理及应用

致 流式细胞术概述 流式细胞术的基本概念 流式细胞术 FlowCytometry 简称FCM 是一种可以快速 准确 客观 并且能够同时检测快速直线流动状态中的单个微粒 通常是细胞 的多项特性 并加以定量的技术 同时可以对特定群体加以分选研究对象为生物颗粒 如各种细胞 微生物及人工合成微球等研究的微粒特性包括多种物理及生物学特征 并加以定量 流式细胞仪的检测范围 细胞结构细胞大小细胞颗粒度细胞表面积核浆比例DNA含量与细胞周期RNA含量蛋白质含量 细胞功能细胞表面 胞浆 核的特异性抗原细胞活性细胞内 外的细胞因子激素结合位点 细胞受体蛋白磷酸化pH值钙离子浓度细胞膜电位 线粒体膜电位 流式细胞仪的原理 液流系统 鞘液包绕着单行排列的细胞依次高速通过流动池 而激光聚焦于流动池中心的样本流上 随后经检测的样本和鞘液流向废液桶 光学系统 经荧光染色的细胞在激光的照射下产生散射光和荧光信号 同时被前向光电二极管和一组光电倍增管 PMT 接收 荧光信号经一系列双色性反射镜和带通或长通滤光片的分离 形成多个不同波长的荧光信号 电子系统 荧光信号和散射光信号经二极管和PMT接收后可转换为电信号 再通过模 数转换器转换为可被计算机识别的数字信号 以图形的形式呈现给操作者 散射光信号 散射光信号 RightAngleLightDetector CellComplexitySSC ForwardLightDetector CellSurfaceAreaFSC IncidentLightSource 前向角散射光 FSC ForwardScatter 细胞相对大小及其表面积侧向角散射光 SSC SideScatter 细胞颗粒度及细胞内细胞器的相对复杂性 外周全血细胞散射光双参数点图 红细胞溶解后 流式细胞仪的检测信号 荧光信号使用荧光标记的单克隆抗体染色 做多色分析荧光信号的强弱 反映了细胞抗原的表达含量 荧光信号 双色直接染色 数据存储 FCS2 0格式常以列表模式 LISTMODE 将每个细胞的每个检测参量依次排列顺序存储 FITC PE双染样本 数据显示 直方图 Histogram 二维点图 DotPlot 等高线图 ContourPlot 密度图 Density 三维图 3DPlot 等 单参数直方图分析 数据分析 直方图分析 多参数散点图分析 数据分析 等高图和密度图分析 数据分析 三维图分析 流式细胞仪的应用 流式细胞仪的临床应用 HIV免疫分型 CD4绝对计数淋巴细胞亚群分析白血病和淋巴瘤的免疫分型肿瘤的细胞周期和倍体分析网织红细胞计数细胞移植的免疫状态监测干细胞计数阵发性血红蛋白尿HLA B27检查血小板功能及相关疾病 流式细胞仪的科研应用 免疫功能研究血小板分析 心脑血管疾病 细胞周期和倍体分析细胞凋亡干细胞研究树突细胞研究肿瘤相关基因表达的研究抗肿瘤药物作用机制以及多药耐药性的研究放疗 化疗疗效的研究 淋巴细胞亚群分析 使用经荧光素标记的特异单克隆抗体 进行多色染色 同时分析淋巴细胞膜上多种白细胞分化抗原 CD分子 的表达 可以将淋巴细胞亚群区分开 进行定性分析各淋巴细胞亚群的百分含量淋巴细胞亚群的绝对计数 进行定量分析 淋巴细胞亚群分析 根据功能 淋巴细胞主要分为B淋巴细胞 CD19 与体液免疫有关T淋巴细胞 CD3 与细胞免疫有关总T和总B可以用来判断某些免疫缺陷和自身免疫性疾病NK细胞 CD3 CD16 56 行使免疫监控功能 能够介导对某些肿瘤细胞和病毒感染细胞的细胞毒性作用 淋巴细胞亚群分析 根据CD4 CD8表达 T淋巴细胞又分为T辅助 诱导细胞 CD3 CD4 T抑制 细胞毒性细胞 CD3 CD8 Th Ts评价那些自身免疫失调 被怀疑是免疫失调或已知患有免疫缺陷的病人的免疫状态 诊断原发性免疫缺陷病 如先天性无r球蛋白血症 或继发性免疫缺陷病 如AIDS 造血干细胞移植后免疫重建 6个月NK 9个月T B Th Ts 机体免疫功能亢进 自身免疫性疾病 如SLE 类风湿性关节炎等 治疗有效恢复正常 Th Ts 机体免疫功能低下 AIDS 病毒感染 慢性活动性肝炎和活动性肝硬化 再障 结核 肿瘤等移植后动态免疫监测 急排临床症状出现前1 5天 活化T和Th Ts持续 1 2预示急排 Th Ts持续 表明可能感染 比值 1 08 可能性大 0 2应停用免疫抑制剂 实体肿瘤疗效和病人免疫状态观察治疗前常伴T Th Ts 放 化疗有效可恢复 淋巴细胞免疫表型正常或治疗后能恢复正常者预后常较好 探索疾病发病机理 进程和预后 炎症 肿瘤 临床意义 判断病人的机体免疫状态 常见疾病的T淋巴细胞的变化 CD4 CD8 CD4 CD8 类风湿性关节炎 活动期 系统性红斑狼疮 或 活动期 多发性硬化症 重症肌无力 膜型肾小球肾炎 胰岛素依赖性糖尿病 乙型肝炎 自身溶血性贫血 上呼吸道感染 常见疾病的T淋巴细胞的变化 CD3 CD4 CD8 CD4 CD8 肿瘤 再障及粒细胞减少症 巨细胞病毒感染 血小板减少 活动性特应性皮炎 过敏性皮炎 淋巴细胞亚群双色分析 12 76 49 26 11 AIDS病人T亚群分析 27 51 15 44 50 84 先天性无r球蛋白血症 5 18 乳腺癌患者T淋巴细胞亚群变化 TriTEST MultiTest与T淋巴细胞绝对计数 使用三色试剂或四色免洗试剂样本使用EDTA抗凝全血 用血量50uL免洗操作 减少细胞丢失绝对计数TruCOUNT管预先加有已知数量微球 在流式细胞仪上直接得到T淋巴细胞亚群的绝对含量 提高工作效率和计数的精确度 单平台计数报告T淋巴细胞及TH TS百分含量 绝对含量和H S比值 TriTESTCD4 CD8 CD3分析与T淋巴细胞绝对计数 TLymphCD3 AbsCntCD3 CD4 TLymphCD3 CD4 AbsCntCD3 CD8 TLymphCD3 CD8 AbsCntTH SRatio MultiTESTCD3 CD8 CD45 CD4 MultiTESTCD3 CD15 56 CD45 CD19 淋巴细胞活化功能研究 T淋巴细胞活化 细胞数目增殖细胞表面表达活化标记分泌细胞因子 CFSE示踪原理 羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂 CFSE 是一种可穿透细胞膜的荧光染料 CFSE进入细胞后可以不可逆地与细胞内的氨基结合偶联到细胞蛋白质上 当细胞分裂时 CFsE标记荧光可平均分配至两个子代细胞中 因此其荧光强度是亲代细胞的一半 这样 在一个增殖的细胞群中 各连续代细胞的荧光强度呈对递减 利用流式细胞仪在488nm激发光和荧光检测通道可对其进行分析 体内 体外实验均可以应用 DilutionofCFSEwithcelldivision LyonsandParish 1994JIM 171 131 Divisions 3210 CFSEFL 1 Log Divisions 3210 葡萄球菌肠毒素刺激牛时间变化示意图 T淋巴细胞活化 细胞数目增殖细胞表面表达活化标记分泌细胞因子 T细胞激活抗原表达的动力学曲线 FastImmuneAssaySystem快速全面检测淋巴细胞功能 BDFastImmuneActivationSystem快速免疫活化检测系统 BDFastImmuneActivationSystem快速免疫活化检测系统 HIV病程进展 应用实例 HIV病例T细胞活化检测 淋巴细胞活化功能检测的广泛应用 结合淋巴细胞亚群分析 免疫调节 病因学研究 AIDS 感染 肿瘤 自身免疫性疾病药物筛选 疫苗疗效评价各种状态下免疫状态评价 移植 寄生虫 营养失调 创伤 手术 烧伤 放 化疗等 T细胞的细胞因子分型 型介导细胞免疫反应引起迟发过敏反应 巨噬细胞活化 2型反应下调刺激来源 病毒 某些细菌 型介导体液免疫反应引起B细胞增殖 分泌多克隆免疫球蛋白 1型反应下调刺激来源 多细胞寄生虫 过敏源 细胞因子相关的主要研究领域 肿瘤肾炎感染自身免疫病超敏反应移植排斥反应免疫缺陷病血液疾病 活化的淋巴细胞分泌细胞因子 BDFastImmuneCytokineSystem快速免疫细胞因子检测系统 Activation37 Incubation IntracellularStain Lyse Fix Acqusition Permeabilize lymphocyte erythrocyte stimulus SurfaceStain Wash cytokine Wash Wash proteinblocking 基于细胞水平的研究胞内因子胞外因子 BDFastImmuneCytokineSystem快速免疫细胞因子检测系统 应用实例 分析1型与2型免疫反应 分析结核菌感染12周后用PBS a PPD B b BCG 卡介苗 c orM bovis d 分别刺激的结果 B结果 CytometricBeadsArray CBA 系统胞外细胞因子检测系统 简介 CBA是一系列荧光强度不同 包被有捕获抗体的微球 类似于ELISA的捕获孔板 可以捕获相应的抗原 再结合第二种荧光检测抗体 形成一种双抗体夹心结构 能结合上 就能发出荧光来 从而检测到相应的抗原 简而言之 将包被有不同抗体的微球混合在一个样本中即可进行多参数检测 应用领域 主要用于血清 血浆 培养细胞上清 眼泪或房水等各种液相中可溶性细胞因子的浓度检测细胞凋亡等信号传导研究 磷酸化蛋白定量分析 HowtoanalyzesolubleproteinsinFCM 待分析的可溶性抗原 荧光标记的检测抗体 捕获微球 捕获抗体 Bead 微球体标记技术 FCM 技术基本原理 CBA 捕获微球 可溶性抗原 检测抗体 三明治复合物 CytometricBeadArray multiplexedbeads 1 2 3 不同强度红色荧光的捕获微球 在FCMFL3检测 不同的目标蛋白 PE标记的检测抗体 在FCMFL2检测 荧光强度即为靶蛋白量 4 7 5 6 HumanTh1 Th2CytokineCBAKit NosampleaddedinDetectorantibodiesonly Chemokine ICBAAssayStandard 0pg ml CBAAssayStandard 10pg ml CBAAssayStandardcont Chemokine ICBAAssayStandard 20pg ml CBAAssayStandardcont Chemokine ICBAAssayStandard 80pg ml CBAAssayStandardcont Chemokine ICBAAssayStandard 156pg ml CBAAssayStandardcont Chemokine ICBAAssayStandard 312pg ml CBAAssayStandardcont Chemokine ICBAAssayStandard 625pg ml CBAAssayStandardcont Chemokine ICBAAssayStandard 1250pg ml CBAAssayStandardcont Chemokine ICBAAssayStandard 2500pg ml CBAAssayStandardcont Chemokine ICBAAssayStandard HumanTh1 Th2LymphokineCBA 标准曲线 5000pg ml 2500pg ml 1250pg ml 625pg ml 312pg ml 80pg ml 20pg ml IL 2IL 4IL 5IL 10TNF IFN IL 2IL 4IL 5IL 10TNF IFN 操作步骤 检测物与捕获微球共孵育 洗涤 标记荧光探测试剂 FITC或PE标记 洗涤 流式细胞仪上机检测 CBA分析软件批量数据分析 与传统的ELISAs检测相比 能够同时对单一样本进行多种目的蛋白检测较传统检测节省样本量 50 l 与ELISAs相比灵敏度高 2 8pg ml 重复性好检测的线性范围宽 0 5000pg ml 所有分析只需一组标准曲线避免酶联反应所致人工假象强大的CBA分析软件节省操作时间 检测时间和分析时间 BDCBA新产品系列BDCBAFlexSet New 基本原理与CBAKit相似检测原理不同 FlexSet微球种荧光 分别在流式细胞仪的FL3 近红外荧光 和FL4 红色荧光 通道检测 通带有近红外和红色两过这个二维矩阵 对应于微球上的特定序号 识别捕获微球 从而定性目的蛋白 PE标记的检测抗体在FL2通道来对目的蛋白定量 CBAKit与CBAFlexSet CBAKit同时检测5或者6个全部试剂CBAAnalysisSoftware检测指标组合固定 CBAFlexSet最多达75个需另购BufferkitFCAPArraySoftware检测指标可自由组合 CBA CBAFlexset的应用领域 血清 血浆或培养液上清等各种液相中细胞因子的浓度检测细胞凋亡等信号传导研究 磷酸化蛋白定量分析免疫细胞功能性研究免疫疾病的监控疫苗研发 药效评价 总体免疫功能分析传染性疾病肿瘤研究 HLA B27分析 HLA B27 HLA B27是MHCI类抗原 在有核细胞上广泛表达 HLA B27的表达与强直性脊柱炎高度相关 在其它血清阴性骨关节病 银屑病性关节炎 葡萄膜炎等也有明显表达 使用流式细胞仪 可以快速 灵敏 准确地分析HLA B27 BDHLA B27Kit检测HLA B27 报告检测的平均荧光强度 根据界值判定 得到阴性 阳性结果 实验的灵敏度为100 特异性为97 5 HLA B27 HLA B27阴性样本 HLA B27阳性样本 流式细胞仪的应用 血液 白血病和淋巴瘤免疫分型残留白血病造血干细胞计数网织红细胞的分析阵发性血红蛋白尿 PNH 诊断血小板分析血小板膜糖蛋白分子的表达血小板活化网织血小板分析血小板自身抗体检测网织血小板计数 白血病免疫分型 FAB分型 AL分为AML M0 M7 ALL白血病的MICM分型MorphologyImmunologyCytogeneticsMoleculorGenetics白血病分型是选择化疗方案和判断预后的重要依据 白血病免疫分型是MIC分型的重要组成部分 也是对FAB分型的补充 对白血病的诊断 治疗策略制定 预后判断及对白血病发病机制的研究都具有重要作用 白血病细胞特性 白血病细胞的异常表现在抗原系列异常和时间异常异常抗原表达 AberrationAntigenExpression 丧失系列规律性 lineageinfidelity 过高 过低 不表达 交叉丧失分化发育的阶段性 differentiationasynchrony 早期与晚期抗原同表达 白血病免疫分型抗原 常用白血病细胞系列与分化阶段抗原 白血病细胞系列非特异性抗原 干 祖细胞 CD34 HLA DR CD38 原始细胞 CD34 HLA DR CD38 幼稚细胞 CD34 HLA DR CD38 白细胞共同抗原 CD45 CD45的临床应用 CD45是白细胞的共同抗原成分 其分子量介于180 220Kda之间 属于T200家族 所有人类白细胞均表达CD45 包括淋巴细胞 单核细胞 多形核细胞 嗜酸 嗜碱性细胞 胸腺细胞 脾细胞 扁桃腺细胞以及骨髓前体细胞 造血系统细胞CD45表达量与细胞分化程度的高低紧密相关 即分化程度高的细胞CD45表达量高 分化程度低的细胞CD45表达量低 淋巴细胞 单核细胞 成熟粒细胞 原幼细胞 在红细胞中不表达 SSC是侧向角参数 反应细胞的颗粒度 成熟粒细胞 单核细胞 原幼细胞 淋巴细胞 目前 国际上采用CD45 SSC设门 Gating 可非常轻松地将白血病细胞与正常细胞分开 增加白血病免疫分型的准确性 CD45的临床应用 用CD45 SSC设门寻找异常细胞 将细胞分为5个群体 当幼稚细胞达70 80 时 即可大致估计AL的类型 骨髓成分复杂 各种大小和分化程度的细胞均有 若不用CD45 SSC设门 我们检测到的阳性细胞的百分率是以总细胞为分母来计算 当时以阳性细胞大于20 为界线 现在以CD45 SSC设门 排除了正常细胞的干扰 阳性细胞的百分率是以幼稚细胞为分母 因此再以阳性细胞 20 作界线则不太合适了 所以 用CD45 SSC设门寻找异常细胞时 以定性比定量更重要 正常人血液白细胞免疫表型散点图 正常人血液细胞免疫表型 T淋巴细胞 CD45 CD3 CD4 CD3 CD8 CD5 CD7 部分细胞CD 16 56 无CD4 CD8 双阳性细胞B淋巴细胞 CD45 CD10 CD19 CD20 CD22 HLA DR CD13 NK细胞 CD45 CD 16 56 CD3 单核细胞 CD45 HLA DR CD13 CD14 CD33 中性粒细胞 CD45 HLA DR CD13 CD14 CD33 CD13比CD33表达更高嗜酸性粒细胞 CD45 HLA DR CD13 CD14 CD33 CD13比CD33表达更高 正常人骨髓有核细胞免疫表型散点图 正常人骨髓细胞免疫表型 淋巴细胞 CD45 CD34 CD38 CD5 CD7 T淋巴细胞 CD10 CD19 B淋巴细胞 单核细胞 CD45 CD34 CD38 HLA DR CD13 CD14 CD33 CD36 GlyA 粒系细胞 原粒细胞CD45 CD34 CD38 CD14 CD33 HLA DR CD13 早幼粒细胞及其以下各阶段中性粒细胞 CD45 CD34 CD38 CD14 CD33 HLA DR CD13 与原粒细胞或更幼稚细胞的表型有明显差异巨核细胞 CD45 CD41 CD61 幼红细胞 CD45 CD36 GlyA T ALL免疫表型 B ALL免疫表型 HL A DR CD19 CD10 CD20 CD22 CD79 a 其它 早期前 B ALL C M 34 38 普通型ALL C M 34 38 前 B ALL B ALL Kappa Lambda CD10 的 ALL 疗效好 有 CD34 病人往往合并 t 9 22 需强化治疗 成熟 AML免疫表型 急性T淋巴细胞白血病 T ALL 骨髓细胞免疫分型散点图 急性早幼粒细胞白血病 AML M3 骨髓细胞免疫分型散点图 FCM在临床血液学中的应用 能正确区别AML和ALL 并能进一步区别ALL中的T系和B系及亚型 能正确鉴别AML中难于鉴别的M0 M6 M7 诊断双系或双表型白血病 发现仅表达个别次要非本系列相关抗原的白血病 诊断少见疑难白血病 如HCL 免疫分型对下列情况具有重要意义 用形态学 细胞化学染色不能肯定细胞来源的白血病 形态学为急性淋巴细胞白血病 ALL 或急性未分化白血病 AUL 但缺乏特异性淋巴细胞系列抗原标记 混合性白血病 部分髓系白血病 目前 免疫分型对粒 单核细胞和单核细胞白血病的鉴别尚有一定困难 慢性淋巴细胞白血病 微小残留白血病 阵发性血红蛋白尿PNH 阵发性血红蛋白尿是由于红细胞膜的获得性缺陷 对激活补体异常敏感的一种慢性血管内溶血患者体内红细胞呈不均一性利用流式细胞术和CD55和CD59单克隆抗体 对PNH患者红细胞 粒细胞和血小板进行分析 证实存在膜蛋白表达缺陷的血细胞 并计算缺陷细胞在全血中所占比例 阵发性血红蛋白尿PNH 正常人红细胞 粒细胞和血小板CD59表达完全阳性PNH患者血细胞分为三型 型 CD59表达完全阳性 荧光强度与正常人阳性峰荧光强度接近 型 CD59表达部分阳性 荧光强度介于 型与 型之间 型 CD59表达完全阴性分析PNH患者各型细胞所占百分比 评估疾病的严重程度 红细胞 PNH分析 A正常人B D病人 网织红细胞计数 Retic COUNT 操作快速 简便计数精确低水平网织红细胞检测网织红细胞成熟指数IRF 临床应用 预测骨髓移植效果判断贫血发病原因评价生物制剂的疗效 网织血小板的检测 人们最先于1969年指出网织血小板是一类能被新亚甲蓝深染的血小板 如网织红细胞一样它们是代表了新生的血小板 以后的二十年中 人们发现网织血小板为骨髓新释放的未成熟成分 含有大量的RNA 因此 外周血中网织血小板的多少 可以间接反映骨髓巨核系造血的活跃程度 并能用常规的检测网织红细胞的噻唑橙 TO 等核酸染料染色 在流式细胞仪上方便 准确地检测 临床应用 正常人网织红细胞1 07 缺铁性贫血 IDA 4 78 临床应用 再障 AA 0 03 溶血性贫血 HA 29 33 造血干细胞计数 造血干细胞是一群有一定增生能力 可以多向分化的造血细胞 造血干细胞的特征是 大小 FSC 和颗粒度 SSC 介于成熟淋巴细胞 大淋巴细胞相似 细胞内含有较多核酸物质 CD34表达弱阳性或强阳性 CD45表达弱阳性 在干细胞移植时需要做造血干细胞绝对计数 造血干细胞计数 干细胞移植应用 血液系统病症 L L 再生障碍想贫血恶性肿瘤 乳腺癌 儿童神经母细胞瘤 卵巢癌遗传性异常病变免疫缺陷 血红蛋白病 血小板检测 血小板膜糖蛋白复合物诊断血小板缺陷性疾病CD41 CD61复合物 血小板无力症CD42a CD42b复合物 巨大血小板症血小板活化的相关检查血小板颗粒膜糖蛋白 如CD62 CD63血小板膜糖蛋白活化表位 如PAC 1血小板减少性疾病血小板自身抗体检测网织血小板的检测血小板脱落微粒的检测 血小板活化 IIb IIIa复合物 CD41 CD61 在所有静止和活化的血小板上都有表达血小板活化时发生的改变IIb IIIa复合物发生变构 表达PAC 1血小板内颗粒释放 分泌促进凝血反应的物质 这时表达CD62P CD61圈血小板门PAC 1 1 阴性对照 静止的血小板PAC 1 CD62P 试验管 ADP刺激下活化的血小板 报告血小板活化百分含量 血小板活化 血小板活化 直接测量循环血小板活化状态与反应性可直接测定凝血酶等诱导剂活化的血小板血小板活化与临床的关系 监测血小板活化相关疾病过程 抗血小板药物疗效或治疗药物的影响 预测血栓形成心肌缺血 心绞痛 心肌梗塞 与血小板活化有关预测冠状动脉成形术后发生急性缺血事件的危险性缺血性脑血管病与血小板活化有关子痫前期 外周血管疾病等均有血小板活力增加抗血小板治疗疗效监测 脑栓塞病人血小板活化检测 ACD61 SSC设分析门B阴性对照C治疗前PAC I27 74 CD62P15 86 D溶栓后PAC I9 13 CD62P4 12 血小板无力症 CD41缺陷 PAC I下调 巨血小板症 蓝 阴性对照绿 正常人红 病人CD41表达上调CD42a CD42b缺失 血小板自身抗体 ITP病人 DNA细胞周期分析 细胞周期 G2 M G0 G1 s 0 200 400 600 800 1000 s DNA分析 DNA含量 细胞数量 DNA细胞周期分析参数 DNA倍体性Ploidy细胞内染色体DNA含量二倍体Diploid正常体细胞内染色体DNA含量DNA指数 DI 测定标本的G0 G1期细胞DNA含量与同种系正常细胞的G0 G1期细胞DNA含量的比值 表示细胞倍体性S期含量SPFS期细胞占总周期细胞的比例增殖指数PI增殖细胞占总周期细胞的比例CVG0 G1期细胞DNA含量变异系数 DNA分析的临床意义 DNA分析诊断肿瘤DNA非整倍体细胞峰或突出的四倍体细胞峰S期细胞含量 10 15 DNA倍体分析 结合临床病理的形态学诊断 对一些恶性肿瘤进行早期诊断 跟踪随访和早期治疗 提高治愈率和生存率 尤其对一些细胞抽吸物 体液 组织液 灌洗液脱落细胞的分析 意义尤为重要 研究各期细胞比率与肿瘤组织分级的关系 提示肿瘤患者预后 增殖状态分析 反映了肿瘤的生长速度和侵袭性 判断临床治疗方法的疗效或用于探讨新药新方法的作用机理和疗效 FCM在肿瘤早期诊断和鉴别诊断中的作用 DNA非整倍体的出现可能是癌前病变发生早期癌变的一个重要标志在淋巴瘤 L L 病理形态学不能做出诊断前可提供确切诊断信息DNA非整倍体的交界瘤应按恶性对待形态学表现良性的肿瘤出现非整倍体提示恶变可能DNA指数可作为判断间叶组织肿瘤良恶性的辅助指标 FCM参数的预后意义 DNA及倍体分析在某些肿瘤有预后价值 膀胱癌 前列腺癌 卵巢癌 子宫内膜癌 皮肤黑色素瘤S期比率与肿瘤组织学分级密切相关 肺癌 乳腺癌 Hodgkin 卵巢癌 直肠癌 甲状腺癌 睾丸癌 脑型星形细胞瘤 细胞凋亡 PI分析 PI Fluorescence Events 凋亡细胞 正常G0 G1期细胞 128 正常DNA倍体分析 129 Aneuploidpeak DNA异倍体 秋水仙素处理 罗田甜柿 获得12倍体再生植株 正常人骨髓细胞DNA周期分析 ModFIT 132 肿瘤细胞SPF S期含量 肿瘤细胞 单克隆 14 18 正常骨髓细胞 2 93 肿瘤细胞 多克隆 28 52 乳腺癌及乳腺良性病变的流式检测对比分析 细胞凋亡 细胞凋亡的分析 细胞凋亡与细胞坏死是两个不同的过程细胞凋亡的主要检查手段形态学检查DNALadders实验流式细胞仪检查与凋亡相关的病理过程 HIV 自身免疫性疾病 肿瘤 研究凋亡调控因素如癌基因 细胞因子及药物等对凋亡的影响 凋亡检测 每一步都有检测试剂盒 细胞凋亡检测 凋亡相关细胞膜变化的检测凋亡相关线粒体变化的检测凋亡相关酶活性的检测凋亡相关DNA片段的检测凋亡相关基因蛋白的检测 细胞膜变化的检测 早期凋亡 磷脂酰丝氨酸 PS 外翻 DNA不断裂线粒体膜电位变化的检测细胞内氧化还原状态改变的检测 细胞膜变化的检测 磷脂酰丝氨酸 PS 的检测 早期凋亡 早期凋亡PS检测及结果判断 早期凋亡特征磷脂膜 PS 外翻 但是细胞膜保持完整性 因此PI染色为阴性DNA没有发生断裂结果判定早期凋亡 AnnexinV PI 死亡或者晚期凋亡 AnnexinV PI 正常的活细胞 AnnexinV PI ANNEXIN V PI检测 142 ANNEXIN V PI检测 control 处理16h后 处理24h后 线粒体水平检测相关产品 线粒体膜电位的检测BDMitoscreen JC 1 Cat 55130225tests原理 荧光染料JC 1在活细胞中以聚体形式存在于线粒体基质上产生红色荧光 在凋亡细胞中 以单体形式存在不与线粒体结合而产生绿色荧光 操作简单 试剂直接加入细胞中 20分钟后检测 JC 1检测结果流式图 凋亡相关酶活性的检测 背景知识细胞凋亡过程中 胞内主要蛋白通常被降解 调节这一过程的蛋白叫Caspase 半胱氨酸 天冬氨酸蛋白酶 Caspase3是参与DNA维护和调控细胞的组分裂解Caspase3激活 细胞凋亡检测原理 是通过特异性抗体检测全长或者剪切后的caspase活性 CBA分析凋亡信号通路 DETECTORANTIBODY LYSATEORSUPERNATANT BEADS Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Wash ReadonFlowCytometer ActiveCaspase 3 Bcl 2 CleavedPARP 一系列荧光强度不同的微球包被有特异性捕获抗体 与待测样本和检测抗体孵育后 形成 三明治 复合物 ActiveCaspase 3 Bcl 2 CleavedPARP Bcl 2 Caspase 3 PARP构成的凋亡调控通道主要蛋白 对于凋亡研究具有特殊的意义 CBAHumanapoptosiskit557816 流式检测活性Caspase 3 相关产品 ActiveCaspase 3Apoptosiskit 550914 包含了固定破膜液 洗涤液和PE标记抗体 特点 细胞需要固定破膜 然后才能染色 149 化疗前后胃癌活检标本中Caspase 3 细胞 化疗前 3 49 化疗后 94 86 DNA水平的凋亡检测 晚期检测 凋亡晚期DNA内切酶活性被激活升高 双链DNA在核小体之间切断形成 185bp为基数的有序片段检测方法Tunel流式法 通过在核酸片段末端标记 跟传统相比优点在于可以计算凋亡百分比DNALadder分析 但凋亡细胞太少时作不到 TUNEL简介 通过DNA末端转移酶将带标记的dNTP 多为dUTP 接到DNA片段的3 OH端 再通过荧光检测定量分析结果 TUNEL Terminaldeoxynucleotidyltransferase mediateddUTPnick end labeling 152 DNA断裂点检测 TUNEL法流式分析凋亡结果 154 BrdU FITC PI检测 S期 凋亡检测总结 检测水平细胞核酸细胞膜胞内通路线粒体 微生物 微生物 细菌的计数检测与鉴定 CBA 血清血诊断 CBA 抗生素敏感性实验 细胞活力检测 细菌活力 图流式细胞术分析GFP转染效率和表达量 调节性T细胞研究进展 免疫耐受机制 以往研究认为 被动 方式 胸腺细胞及前B pre B 细胞在中枢免疫器官中的克隆清除进入外周的成熟淋巴细胞表达针对自身抗原的识别受体被诱导进入免疫无能状态而不表现任何自身反应性部分淋巴细胞对自身抗原的免疫忽视 免疫耐受机制 近年研究表明 主动 方式 调节性T Tr 细胞以 主动 的方式维持自身免疫耐受 这一发现将改变我们对自身免疫耐受及免疫调节机制的认识 并将对免疫学基本理论的发展产生重大影响 调节性T细胞的特异性标志 FOXP3 ForkheadboxproteinP3 是一个50kD的转录因子 也称为Scurfin JM2 IPEX 它是一个主要调节基因 CD4 CD25 细胞上FOXP3的转录表达可以诱导GITR CD103和CTLA4的表达 并且促使调节性T细胞表型形成 FOXP3在X连锁自身免疫 过敏失调综合征 XLAAD或IPEX 患者中发生突变 FOXP3过度表达会引起机体的免疫应答下降 表明它是一个调节T细胞活性的主要转录因子 FOXP3表达于细胞内 调节性T细胞分类 根据来源 特异性及效应机制可分为天然调节性T细胞和获得性调节性T细胞天然性调节性T细胞 在正常人和小鼠的外周血及脾脏组织的CD4 T细胞中约有5 10 的细胞持续高表达CD25分子 该群细胞从胸腺中发育 组成性表达foxp3 在体内外发挥免疫调节功能获得性调节性T细胞 是由外周T细胞在特定的条件下分化出来 通过分泌高水平的IL 10和TGF 而发挥其抑制功能 RegulatoryTCellsBackground itsDevelopment Thymus Periphery Tcellprecursor Tr1 Th3 FoxP3 iDCand orinthePresenceofIL 10And orTGFb ConventionalTcell Na veTcell NaturallyoccurringTregcell AdaptiveTregcell CD25 GITR FoxP3 CD4 CD127 CD25 G