IBDV VP2 蛋白研究进展.doc

IBDV VP2蛋白的研究进展鸡传染性法氏囊病(infectious bursal disease,IBD)是由鸡传染性法氏囊病病毒(infectious bursal disease virus,IBDV)引起鸡的一种急性高度接触性传染病。215周龄的雏鸡均可感染IBDV,但36周龄的雏鸡最易感。IBDV感染雏鸡后,除引起一定数量感染雏鸡死亡外,更为严重的是导致雏鸡免疫抑制,不但使雏难对其他禽病如ND,MD等的易感性升高,而且对各种疫苗的免疫应答降低,甚至失败。近年来,IBDV在经典血清I型基础上出现了毒力减弱的变异株和毒力大大增强的超强毒株,致使IBD更加难以防制,给养禽业带来了巨大的经济损失。传染性法氏囊病于1962年首次发现于美国特拉华州贡博罗城（Gumboro）的肉鸡群中，也称之为贡博罗病。1970年,Hitchner建议将该病命名为传染性法氏囊病。1985年,在美国Delmarva家禽生产地区发现了IBDV1型变异株,它能突破标准株的母源抗体的保护;1989年Chettle等在荷兰分离到高致病力的IBDV毒株,此后世界许多地区报道由该毒株引起IBD的严重爆发并伴有高死亡率1。由于IBDV可引起免疫抑制以及其变异株、超强毒株的出现，引起了人们的广泛关注。较多的研究结果显示，IBDV的变异主要来自VP2基因。1 IBDV基因组结构IBDV的基因组为双股RNA,分A、B两个节段。A节段的核苷酸序列长约32003300bp,由5端非编码区(NCR)、二个开放阅读框架(ORF)和3端NCR组成。ORFA1编码分子量约为110kDa的前体融合蛋白(NH2-VPX-VP4-VP3-COOH),加工后形成三个成熟的多肽,即VP2(约40kDa)、VP3(约52kDa)、VP4(约28kDa)。ORFA2编码分子量约21kDa的非结构蛋白VP5。B节段的核苷酸长约2800-2900bp,只含一个ORF,编码结构蛋白VP1(约90kDa)2,32 IBDV蛋白结构和功能IBDV蛋白及其功能目前已确定的IBDV成熟病毒蛋白有VP1、VP2、VP3、VP4和VP5,其中VP2、VP3为病毒结构蛋白,共同组成病毒的衣壳。VP1全长878个氨基酸,占IBDV病毒蛋白总量的4%,分子质量约90ku。VP1为病毒依赖于RNA的RNA聚合酶,参与病毒的RNA复制,VP1还有加帽酶的活性,也能催化一个鸟苷酰基化反应,该反应起着引发病毒RNA合成的作用4,5。VP1能以连接蛋白VPg的形式,通过G残基与Serine结合,并紧密结合到IBDV基因组两个节段的5端而使它们环化。VP2是IBDV最主要的结构蛋白,占病毒蛋白总量的51%,VP2肽链长454氨基酸,分子质量为3740ku。除与VP3一起形成病毒的衣壳外,VP2还是病毒的主要保护性抗原蛋白。其上至少有3个构象依赖性中和抗原位点,其中两个重叠的构象依赖性抗原位点位于VP2的中心区(氨基酸残基206350)6。VP2是IBDV的主要结构蛋白,构成病毒衣壳的主要成分,是主要的宿主保护性抗原,含有能诱导中和抗体的抗原决定簇。VP3占病毒蛋白总量的40%,分子质量3235ku,约由390氨基酸组成,含有IBDV的群特异性抗原决定簇,同时也有少量的中和位点,具有一定的免疫保护作用。VP3在病毒吸附细胞时对其吸附过程有较大的影响,并参与病毒的包装和稳定基因组的作用7。VP4全长约226个氨基酸,约占病毒总度蛋白的6%,分子质量约2428ku。是一种具有蛋白酶活性的蛋白质,参与大片段A编码的融合蛋白前体的加工,在病毒蛋白成熟过程中起重要作用,不是病毒粒子的组成部分。VP5Mundt等运用点突的方法去除VP5的起始密码子,这种不能表达VP5蛋白的IB-DV仍可在细胞中复制,虽然复制时间有滞后性,但最后病毒产量与表达VP5的IBDV类似。说明VP5不是病毒所必需的。3 VP2的变异疫苗的免疫效果不尽如人意。近几年,我们对其病原生态学进行了较深入的研究19,20,21,发现我国不同地区流行的传染性法氏囊病病毒(IBDV)的抗原性和毒力有差异,病毒中和试验和交叉中和试验证实我国存在着IBDV 型变异株和不同的血清亚型。IBDV结构蛋白VP2是该病毒的主要保护性抗原,能诱导机体产生中和抗体,是机体产生抗病毒免疫的重要因素22,23。因此,在分子水平上进一步认识VP2基因序列的变异,不仅有助于深入认识免疫失败或免疫逃避的机理,而且对研制IBD高效疫苗具有重要的指导意义。VP2是主要的宿主保护性抗原,它含有能诱导中和抗体的抗原决定簇。序列分析表明,IB-DV宿主保护性抗原VP2基因的序列是相当保守的,血清 型病毒的不同毒株之间的基因变异大多数发生在AccI-SpeI2个内切酶位点之间,这一区域称为高可变区12。VP2高可变区有3个重要结构:2个亲水区和1个保守的七肽区。前者与毒株的抗原变异有关,而后者则与毒力有关8。但最近的研究结果对这一观点提出了质疑。Dormitorio等13分析了几株变异株的VP2高可变区的基因序列,虽然大多数变异株在2个亲水区都发生了氨基酸的变化,但有1株分离自美国的变异株MISS是一个例外。在2个亲水区,MISS与传统IBDV毒株STC、52-70和PBG98等具有完全相同的氨基酸序列。因此,2个亲水区氨基酸的差异可能不是毒株抗原型的决定因素。同时提出,254位的S是变异株的特征氨基酸。曹永长等14在分析了多株变异株序列之后指出,249位的K和254位的S是变异株的特征氨基酸。尽管F9502、G9201和G9303在2个亲水区发生了氨基酸的变化,但249位和254位的氨基酸分别为Q和G,与标准 型毒株STC和52-70等相同。曹永长等15将F9502、G9201和G9303 3株超强IBDV毒株与英国的超强毒株CS89和UK661以及荷兰的超强毒株DV86比较,发现有4个氨基酸是6个超强毒株所特有的。在222位上,超强毒株均为A,而其他毒株则为P、Q或T;256位,超强毒株为I,其他毒株为V;294位和299位,超强毒株分别为I和S,而其他毒株则分别为L和N。从图3看出,这4个氨基酸中,222A和299S处在亲水部位,而256I和294I则位于疏水部位。除256位的I以外,其他3个氨基酸的变化均引起所在部位亲水性的明显变化。位于亲水部位的222A和299S使该部位的亲水性降低,而处于疏水部位的294I则使得该区域的疏水性升高。因此,3个特异性氨基酸222A、294I和299S可能与超强毒株毒力增强有关。一个可能的解释是,由于这些特异的氨基酸的变化,使得所处部位的疏水性升高或亲水性降低,虽然这些变化不足以引起抗原型的变化,却可以使抗体对病毒的捕捉能力下降,或者使超强毒株作用于其他受体位点,从而在足够高的母源抗体存在的情况下,超强IBDV毒株仍能感染鸡只,并造成鸡只的大量死亡。第2个亲水区之后的SWSASGS七肽区多年来被认为是IBDV毒力强弱的标志16。但Ya-maguchi等17发现,从超强毒株适应细胞培养之后衍生的弱毒株,虽然失去了致病力,但仍然保持了SWSASGS七肽区不发生变化。于是,七肽区与毒力的关系受到怀疑,而另外2个氨基酸即279和284位的氨基酸则被认为是区别强毒株与弱毒株的关键。强毒株在279和284位分别为D和A,而弱毒株则分别为N和T。尽管如此,至今仍未发现强毒株的七肽区发生变化。因此,可以认为SWSASGS七肽区的保守性以及279D和284A2个特征性氨基酸是强毒株的2个重要标志。从图2中可以看出,6个超强毒株及2个典型强毒株52-70和STC的七肽区仍保留了SWSASGS,且279和284位分别为D和A。这与上述假设是吻合的。根据以上分析,可以看出超强IBDV毒株的主要宿主保护性抗原VP2在其高可变区内具有以下几个重要特征。首先,在249和254位上的氨基酸分别为Q和G,而非K和S,从而保证其抗原型不发生变异;其次,七肽区保持SWSGSAS不变,且279和284位分别为D和A,而非N和T,这是IBDV毒株具有致病力的必要条件;第三,在222、294和299位上具有3个特征性氨基酸,分别为A、I和S,这3个氨基酸使得超强毒株的亲水性发生变化,从而使毒力大大增强。因此,从分子生物学的角度来看,超强IBDV毒株就是一些在诱导中和抗体的抗原决定簇中发生了少数氨基酸的突变,导致抗原决定簇空间结构的细微变化,从而使得毒力增强的特殊毒株。曾祥伟等18通过对-9（-在鸡胚成纤维细胞上传代致弱的第9代毒）的研究,发现细胞毒CEF-8有个别核苷酸发生了改变,但没有影响氨基酸序列;而CEF-10 2基因已变得与欧洲标准弱毒-1相似。其毒力（对4周龄SPF鸡致死率为32）介于原代-和-20毒之间。因此细胞毒第9代可能是具有过渡特征的中间株。七肽区在高毒力毒株间是保守的,而在弱毒株间是保守的19。本研究中-9伴随着七肽区的变化,毒力有了明显的降低但仍保持了较强的致病力,说明七肽区是影响致病力的一个重要因素。4 VP2的抗原性研究IBDV结构与功能最早是由Azad等用大肠杆菌表达IBDVA片段cDNA,其后Macreadie等用酵母表达IBDVVP2,以此作为亚单位疫苗免疫鸡可产生高滴度抗体和免疫保护力。用于蛋白功能研究的载体有鸡痘病毒、杆状病毒、马立克氏病毒、腺病毒等。表达IBDVVP2的重组鸡痘病毒进行免疫攻毒试验,虽然法氏囊仍有损伤,但可使鸡免于死亡,而表达VP2-VP4-VP3的重组鸡痘病毒免疫接种效果不理想。以杆状病毒表达VP2-VP4-VP3接种鸡可产生中和抗体并产生79%的免疫保护率。Darteil等以HVT为载体表达IBDVVP2,重组HVT虽然对MD的免疫保护率远低于野生型HVT,但对IBD有100%保护。以MDV疫苗株CV1988/Rispens作为载体表达VP2构建的重组基因工程疫苗,其MDV和IBD的保护率均与野生型弱毒苗一样。且两种抗体至少持续10周以上。为了改善对变异株的保护率,用标准IBDVVP2的一个中和表位替代了变异株的cDNA表位,以杆状病毒表达修饰的变异株的cDNA,结果发现重组亚单位疫苗对IBDV标准强毒株和变异株均有交叉保护性10。Fodor等11用HCMV的启动子表达IBDVVP2和VP2-VP4-VP3构建基因疫苗,肌肉注射或腹腔注射免疫两次。结果表明,IBDVVP2-VP4-VP3基因疫苗能诱导鸡体产生抗体和免疫保护作用,而IBDVVP2基因疫苗则不能。1 CalnekBW主编,高福、苏敬良主译,禽病学(第10版)M.北京:中国农业出版社,1999.914937.2MurphyFA,FauquetCM,BishopDHL.Birnavitidae.SixthreportoftheinternationalcommitteeonTaxonomyofvirusesJ.ArchVi-rolSupple,1995,10:240-244.3MargretM,MacreadieIG,HarleyVR,etal.Sequenceofthesmalldouble-strandedRNAgenomicsegmentofinfectiousbursaldiseasevirusanditsdeduced90kuproductJ.Virol,1988,163:240-242.4DobosP.Protein-primedRNAsynthesisinvitrobythevirion-associatedRNApolymeraseofinfectiouspancreaticnecrosisJ.ArchVi-rol,1995,208:19-25.5 Von Einem UI, Gorbalenya AE, Schirrmeier H, Behrens SE, Letzel T, Mundt E. 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