PCR引物设iao计原则-----x结.doc

PCR引物设计原则之个人心得 -自我总结设计的目的是在两个目标间取得平衡：扩增特异性和扩增效率。引物分析软件将试图通过使用每一引物设计变化的预定值在这两个目标间取得平衡。设计引用有一些需要注意的基本原理：避免GC含量过高，3末端碱基最好为G或C，尽量避免3末端碱基为TProbe内部或Probe与两条引物之间避免3 base以上的互补序列 局部避免GC rich或AT rich（特别是3端），避免T/C连续，A/G连续 引物内部或两条引物之间避免3 base以上的互补序列，引物3末端避免2 base以上的互补序列 引物长度一般引物长度为1830碱基。总的说来，决定引物退火温度（Tm值）最重要的因素就是引物的长度。有以下公式可以用于粗略计算引物的退火温度。在引物长度小于20bp时：4(G+C)+2(A+T)-5在引物长度大于20bp时：62.3+0.41(%G-C)-500/length-5 另外有许多软件也可以对退火温度进行计算，其计算原理会各有不同，因此有时计算出的数值可能会有少量差距。为了优化PCR反应，使用确保退火温度不低于54的最短的引物可获得最好的效率和特异性。 总的说来，每增加一个核苷酸引物特异性提高4倍，这样，大多数应用的最短引物长度为18个核苷酸。引物长度的上限并不很重要，主要与反应效率有关。由于熵的原因，引物越长，它退火结合到靶DNA上形成供DNA聚合酶结合的稳定双链模板的速率越小。 GC含量一般引物序列中G+C含量一般为40%60%，一对引物的GC含量和Tm值应该协调。若是引物存在严重的GC倾向或AT倾向则可以在引物5端加适量的A、T或G、C尾巴。 退火温度退火温度需要比解链温度低5，如果引物碱基数较少，可以适当提高退火温度，这样可以使PCR的特异性增加；如果碱基数较多，那么可以适当减低退火温度，是DNA双链结合。一对引物的退火温度相差46不会影响PCR的产率，但是理想情况下一对引物的退火温度是一样的，可以在5575间变化。 避免扩增模板的二级结构区域选择扩增片段时最好避开模板的二级结构区域。用有关计算机软件可以预测估计目的片段的稳定二级结构，有助于选择模板。实验表明，待扩区域自由能（G）小于58.6lkJ/mol时，扩增往往不能成功。若不能避开这一区域时，用7-deaza-2-脱氧GTP取代dGTP对扩增的成功是有帮助的。 与靶DNA的错配当被扩增的靶DNA序列较大的时候，一个引物就有可能与靶DNA的多个地方结合，造成结果中有多个条带出现。这个时候有必要先使用BLAST软件进行检测，网址：/BLAST/。选择Align two sequences (bl2seq)，如下图。BLAST的使用方法也十分简单，如下图所示。将引物序列粘贴到1区，将靶DNA序列粘贴到2区，这两者可以互换的，并且BLAST会计算互补、反义链等多种可能，所以不需要用户注意两条链是否都是有义链。如果知道序列在数据库中的GI号也可以直接输入GI号，这样就不用粘贴一大段的序列了。最后在3处点击Align就可以查看引物在靶DNA中是否有多个同源位点了。 可是使用BLAST还是有其不方便的地方。因为它一次只能比较两条序列，那么一对引物就需要分开进行比对。如果存在错配，还需要自己计算由于错配形成的片段长度有多大。在下一篇中将介绍一个软件，可以直接将靶DNA和引物输入对产物片段进行预测。 引物末端引物3端是延伸开始的地方，因此要防止错配就从这里开始。3端不应超过3个连续的G或C，因这样会使引物在G+C富集序列区错误引发。3端也不能有形成任何二级结构可能，除在特殊的PCR（AS-PCR）反应中，引物3端不能发生错配。如扩增编码区域，引物3端不要终止于密码子的第3位，因密码子的第3位易发生简并，会影响扩增特异性与效率。 引物的二级结构引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹状结构，这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。若用人工判断，引物自身连续互补碱基不能大于3bp。两引物之间不应该存在互补性，尤应避免3端的互补重叠以防引物二聚体的形成。一般情况下，一对引物间不应多于4个连续碱基的同源性或互补性。 为了下一步操作而产生的不完全匹配5端对扩增特异性影响不大，因此，可以被修饰而不影响扩增的特异性。引物5端修饰包括：加酶切位点；标记生物素、荧光、地高辛、Eu3+等；引入蛋白质结合DNA序列；引入突变位点、插入与缺失突变序列和引入一启动子序列等。额外的碱基或多或少会影响扩增的效率，还加大引物二聚体形成的几率，但是为了下一步的操作就要作出适当的“牺牲”。 很多时候PCR只是初步克隆，之后我们还需要将目的片段亚克隆到各种载体上，那么就需要在PCR这个步骤为下一步的操作设计额外的碱基。以下总结一些为了亚克隆所要设计的序列。 a添加限制性内切酶酶切位点添加酶切位点是将PCR产物进行亚克隆使用得最多的手段。一般酶切位点是六个碱基，另外在酶切位点的5端还需要加23个保护碱基。但是不同的酶需要的保护碱基数目是不相同的，例如：Sal不需要保护碱基，EcoR需要1个，Not需要2个，Hind3个。其中，在原核表达设计引物时还有一些小技巧，大家可以参考：原核表达之实验前的分析。里面一些规则是所有表达都通用的。 有一种做法是在进行PCR反应的同时进行酶切，这样就需要注意一些内切酶在PCR反应中的酶切反应率，见附录。不过这种方法虽然方便但并不推荐。有时候，就是把PCR产物回收后酶切再与载体连接效果都不尽理想，同步进行会使出现问题的原因变得更加复杂。一旦出现问题，分析起来更麻烦。b LIC添加尾巴LIC的全称是Ligation-Independent cloning，它是Navogen公司专门为其部分的pET载体而发明的一种克隆方法。用LIC法制备的pET载体有不互补的1215碱基单链粘端，与目的插入片段上相应粘端互补。扩增目的插入片段的引物5序列要与LIC载体互补。T4 DNA聚合酶的35外切活性经短时间即可在插入片段上形成单链粘端。由于只能由制备好的插入片段和载体互相退火形成产物，这种方法非常快速高效，而且为定向克隆。 c定向TA克隆添加尾巴在T载体刚出的时候大家都拍手称赞，真是方便，哪个小子脑子这么聪明想出来的。但是后来人们发现TA克隆无法将片段定向克隆到载体中，所以后来Invitrogen推出了可以定向克隆的载体，它的一端含有四个突出的碱基GTGG。因此在PCR引物设计时也要相应的加上与之互补的序列，这样片段就可以“有方向”了。 d In-Fusion克隆方法这项技术是Clontech还属于BD的时候推出的，2004年在生物通可着实风光了一把，不但当选年度创新试剂还被大家投票为最受大家欢迎的试剂。此技术就其步骤来说是及其方便的，不需连接酶，不需长时间的反应。只要在设计引物的时候引入一段线性化载体两端的序列，然后将PCR产物和线性化的载体加入到含有BSA的In-Fusion酶溶液中，在室温下放置半个小时就可以进行转化了。这种方法特别适合大批量的转化。 这里顺便提一下如果有什么技术给大家留下深刻影响，欢迎大家发email推荐给生物通。说不定你的推荐可以让它成为年度之星呢。 如果要加入额外的碱基总是或多或少会影响到整个PCR反应，比如在加入Not的酶切位点后整个引物的退火温度就会直线上升（它识别的是8个碱基，且全为GC），这样使另外一个引物的设计变得十分困难，因为一对引物间退火温度相差不宜太远。因此上面提到许多设计原则在实际应用中往往难以做到都符合。在碰到这些情况的时候，我们只能秉着“实践是检验真理的唯一标准”这一原则，要试一试才能知道能否行得通了。（生物通谢菲）引物设计的原则概述 引物设计原则的几种概述 引物设计原则 1. 引物的长度一般为15-30 bp，常用的是18-27 bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74，不适于Taq DNA聚合酶进行反应。 2. 引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3端相似性较高的序列，否则容易导致错配。引物3端出现3个以上的连续碱基，如GGG或CCC，也会使错误引发机率增加。 3. 引物3端的末位碱基对Taq酶的DNA合成效率有较大的影响。不同的末位碱基在错配位置导致不同的扩增效率，末位碱基为A的错配效率明显高于其他3个碱基，因此应当避免在引物的3端使用碱基A。另外，引物二聚体或发夹结构也可能导致PCR反应失败。5端序列对PCR影响不太大，因此常用来引进修饰位点或标记物。 4. 引物序列的GC含量一般为40-60%，过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。 5. 引物所对应模板位置序列的Tm值在72左右可使复性条件最佳。Tm值的计算有多种方法，如按公式Tm4(G+C)2(A+T)，在Oligo软件中使用的是最邻近法(the nearest neighbor method)。 6. G值是指DNA双链形成所需的自由能，该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性。应当选用3端G值较低（绝对值不超过9），而5端和中间G值相对较高的引物。引物的3端的G值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA聚合反应。 7. 引物二聚体及发夹结构的能值过高（超过4.5kcal/mol）易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR反应不能正常进行。 8. 对引物的修饰一般是在5端增加酶切位点，应根据下一步实验中要插入PCR产物的载体的相应序列而确定。 引物序列应该都是写成5-3方向的， Tm之间的差异最好控制在1度之内， 另外我觉得扩增长度大一些比较好，500bp左右。 要设计引物首先要找到DNA序列的保守区。同时应预测将要扩增的片段单链是否形成二级结构。如这个区域单链能形成二级结构，就要避开它。如这一段不能形成二级结构，那就可以在这一区域设计引物。 引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。 产物不能形成二级结构。 引物长度一般在1530碱基之间。 G+C含量在40%60%之间。 碱基要随机分布。 引物自身不能有连续4个碱基的互补。 引物之间不能有连续4个碱基的互补。 引物5端可以修饰。 引物3端不可修饰。 引物3端要避开密码子的第3位。 1.引物的特异性 引物与非特异扩增序列的同源性不要超过70%或有连续8个互补碱基同源。 2.避开产物的二级结构区 某些引物无效的主要原因是引物重复区DNA二级结构的影响，选择扩增片段时最好避开二级结构区域。用有关计算机软件可以预测估计mRNA的稳定二级结构，有助于选择模板。实验表明，待扩区域自由能（G）小于58.6lkJ/mol时，扩增往往不能成功。若不能避开这一区域时，用7-deaza-2-脱氧GTP取代dGTP对扩增的成功是有帮助的。 3.长度 寡核苷酸引物长度为1530bp，一般为2027mer。引物的有效长度：Ln=2（G+C）+（A+T），Ln值不能大于38，因为38时，最适延伸温度会超过Taq DNA聚合酶的最适温度（74),不能保证产物的特异性。 4.G+C含量 G+C含量一般为40%60%。其Tm值是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度，有效启动温度，一般高于Tm值510。若按公式Tm=4（G+C）+2（A+T）估计引物的Tm值，则有效引物的Tm为5580，其Tm值最好接近72以使复性条件最佳。 5.碱基础随机分布 引物中四种碱基的分布最好是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3端不应超过3个连续的G或C，因这样会使引物在G+C富集序列区错误引发。6.引物自身 引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹状结构牙引物本身复性。这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。若用人工判断，引物自身连续互补碱基不能大于3bp。 7.引物之间 两引物之间不应不互补性，尤应避免3端的互补重叠以防引物二聚体的形成。一对引物间不应多于4个连续碱基的同源性或互补性。 8.引物的3端 引物的延伸是从3端开始的，不能进行任何修饰。3端也不能有形成任何二级结构可能，除在特殊的PCR（AS-PCR）反应中，引物3端不能发生错配。 在标准PCR反应体系中，用2U Taq DNA聚合酶和800mol/L dNTP（四种dNTP各200mol/L）以质粒（103拷贝）为模板，按95，25s；55，25s；72，1min的循环参数扩增HIV-1 gag基因区的条件下，引物3端错配对扩增产物的影响是有一定规律的。AA错配使产量下降至1/20，AG和CC错七下降至1/100。引物A：模板G与引物G：模板A错配对PCR影响是等同的。 9.引物的5端 引物的5端限定着PCR产物的长度，它对扩增特异性影响不大。因此，可以被修饰而不影响扩增的特异性。引物5端修饰包括：加酶切位点；标记生物素、荧光、地高辛、Eu3+等；引入蛋白质结合DNA序列；引入突变位点、插入与缺失突变序列和引入一启动子序列等。 10.密码子的简并 如扩增编码区域，引物3端不要终止于密码子的第3位，因密码子的第3位易发生简并，会影响扩增特异性与效率。 Hairpin 发卡结构 如果自由能值大于0 则该结构不稳定从而不会干扰反应如果自由能值小于0 则该结构可以干扰反应 二聚体可以在序列相同的两条引物或正反向。引物之间形成如果配对区域在3 末端问题会更为严重3 末端配对很容易引起引物二聚 体扩增使 Pair Rating 匹配度评分匹配度低的引物对常常不太有效是因为在同样退火温度下Tm低的引物决定扩增的特异性而Tm高的引物更易于形成非特异性结合而造成错误的起始 【1】 引物的长度以1530bp为宜，否则会影响扩增的特异性。 【2】 【2】 】碱基尽可能随机分布