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文档简介

染色质免疫共沉淀 ChIP 目录 一 简介 DNA与蛋白质相互作用研究 一 简介 ChIP是目前唯一研究体内DNA与蛋白质相互作用的方法 不仅可以检测体内反式因子与DNA的动态作用 还可以用来研究组蛋白的各种共价修饰与基因表达关系 二 原理 在活细胞状态下固定蛋白质 DNA复合物 并将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段 然后通过免疫学方法沉淀此复合物 特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段 通过对目的片段的纯化与检测 从而获得蛋白质与DNA相互作用的信息 三 技术流程 具体操作流程 1 甲醛交联细胞 具体步骤 2 染色质超声断裂 1 加SDS裂解溶液重悬浮沉淀 冰上10min 每1min颠倒摇动一次离心管 2 把DNA粉碎为长度200 1000bp 置于冰上 不同样本都进行超声条件优化实验 3 14000rpm离心10min 4 转移上清于1 5ml离心管 3 免疫沉淀蛋白和DNA复合物 4 收获免疫复合物 抗体 蛋白质 DNA 40 lProteinA GAgaroseBeads 1000rpm 离心5min 4 a低盐洗脱溶液1ml洗一次b高盐洗脱溶液1ml洗一次c氯化锂洗脱溶液1ml洗一次dTE溶液 pH8 0 1ml洗两次 每次洗时 在摇床上摇10min 4 4000rpm离心5min 弃上清 5 洗脱免疫复合物 6 去除甲醛交联 加5mlNaCl使用NaCl终浓度为0 2mol l 阴性对照 350 lChIP洗脱溶液 16 l5mol lNaCl 65 过夜 去交联 7 DNA纯化 酚 氯仿抽提 12000rmp离心5min 8 染色质免疫共沉淀DNA的分析和蛋白质在DNA上结合位点的鉴定 1 如果目的蛋白靶序列已知 或怀疑某一序列是目的蛋白靶序列 则可选用定量或者半定量PCR方法 2 如果目的蛋白的靶序列未知或者研究目的蛋白基因组分布情况 找出转录因子结合位点 则可采用ChIP克隆测序 ChIP chip 和ChIP seq方法 四 应用 组蛋白修饰研究转录调控分析药物开发研究有丝分裂研究DNA损伤与凋亡分析 五 优缺点 优点 充分反映生理条件下DNA与蛋白质相互作用的真实情况 可以找出生理条件下某个DNA结合蛋白与DNA序列的结合位点 从而反映体内基因表达调控的真实情况 缺点 需要一个特异性蛋白质抗体 有时难以获得 为了获得高等丰度的结
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