PCR和原位PCR原理和方法.pdf

PCR及原位及原位PCR 的原理和方法的原理和方法 PCR的基本原理的基本原理 聚合酶链反应聚合酶链反应 Polymerase Chain Reaction PCRPolymerase Chain Reaction PCR 又称又称体外基因扩增方法体外基因扩增方法 这种技术与体内这种技术与体内DNADNA复制复制 replicationreplication 过程相似过程相似 DNADNA是储存遗传信息的生物大分子是储存遗传信息的生物大分子 由四种脱氧核苷酸由四种脱氧核苷酸 dNTPdNTP 组成组成 腺嘌呤脱氧核苷酸腺嘌呤脱氧核苷酸 A A 鸟嘌呤脱氧核苷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸 G G 胞嘧啶脱氧核苷酸胞嘧啶脱氧核苷酸 C C 胸腺嘧啶脱氧核苷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸 T T DNADNA的分子结构是由两条互的分子结构是由两条互相平行而方向相反的链借助碱基相平行而方向相反的链借助碱基 互补配对的原则互补配对的原则 即即A A T GT G C C 而形成的双螺旋构型而形成的双螺旋构型 不同碱基的顺序不同碱基的顺序 组成不同的遗传密码和信息组成不同的遗传密码和信息 亲代细胞通过亲代细胞通过DNADNA复制成二分复制成二分 子顺序完全相同的子顺序完全相同的DNADNA 而传给子代细胞而传给子代细胞 PCRPCR在体外进行的三个基本步骤在体外进行的三个基本步骤 组成组成PCRPCR的循环反应的循环反应 第一步第一步 变性变性Denaturation 94Denaturation 94 0 0C 30s C 30s将所要扩增的基因片段加热将所要扩增的基因片段加热 使双链使双链DNADNA解离成单链解离成单链DNADNA 第二步第二步 复性复性Annealing Annealing 退火退火 5555 0 0C 30s C 30s当温度下降时当温度下降时 化学方法化学方法 合成的寡核苷酸引物即与所要扩增基因两侧的合成的寡核苷酸引物即与所要扩增基因两侧的DNADNA相结合相结合 第三步第三步 延伸延伸Extension 72Extension 72 0 0C 60s C 60s在合适缓冲液在合适缓冲液 MgMg 2 2 及四种 及四种dNTPdNTP存存 在条件下在条件下 DNADNA聚合酶能忠实根据模板碱基顺序合成互补链聚合酶能忠实根据模板碱基顺序合成互补链 即从引即从引 物的物的3 3 端端 OHOH进行延伸进行延伸 合成的方向为合成的方向为5 5 3 3 从而合成二分子与原从而合成二分子与原 来结构相同的基因片段来结构相同的基因片段 PCR操作方法操作方法 试剂试剂 引物引物 根据待扩增根据待扩增DNADNA不同不同 引物也不同引物也不同 耐热耐热DNADNA聚合酶聚合酶 此酶是从耐热细菌中分离出来的此酶是从耐热细菌中分离出来的 能耐受高能耐受高 温温 9393 100100 0 0C C 10 xPCR10 xPCR缓冲液缓冲液 500mmol L KCl 500mmol L KCl 100mmol L Tris100mmol L Tris HCl pH8 4 20HCl pH8 4 20 0 0C C 150mmol L MgCl150mmol L MgCl2 2 1mg ml1mg ml明胶明胶 试剂试剂 5mmol L dNTP5mmol L dNTP储备液储备液 标本处理试剂标本处理试剂 不同标本所需试剂不同不同标本所需试剂不同 由于有些试剂及由于有些试剂及DNA DNA 聚合酶价格昂贵聚合酶价格昂贵 因此因此 反应体积很小反应体积很小 常用终体积为常用终体积为5050 100ul100ul 有时为有时为25ul25ul 操作程序操作程序 将将PCRPCR的必需反应成分加入一微量离心管中的必需反应成分加入一微量离心管中 然后置于一定的循环参然后置于一定的循环参 数条件下进行循环扩增数条件下进行循环扩增 1 1 向一微量离心管中依次加入向一微量离心管中依次加入 ddHddH2 2O O 补至终体积补至终体积 5050 100ul100ul 10 xPCR10 xPCR缓冲液缓冲液 1 101 10体积体积 dNTP dNTP 各各200umol L200umol L 引物引物 各各1umol L1umol L DNADNA模板模板 1010 2 2 10 10 5 5拷贝 拷贝 混匀后混匀后 离心离心15s15s使反应成分集于管底使反应成分集于管底 2 2 加石蜡油加石蜡油5050 100ul100ul于反应液表面以防蒸发于反应液表面以防蒸发 置反应管于置反应管于9797 0 0C C变性 变性7min7min 染染 色体色体DNADNA 或或5min5min 质粒质粒DNADNA 3 3 冷至延伸温度时冷至延伸温度时 加入加入1 1 5UTaqDNA5UTaqDNA聚合酶聚合酶 在此在此温度下作用温度下作用1min1min 4 4 于变性温度下使模板于变性温度下使模板DNADNA变性适当时间变性适当时间 5 5 在复性温度下使引物与模板杂交一定时间在复性温度下使引物与模板杂交一定时间 6 6 在延伸温度下使复性的引物延伸合适的时间在延伸温度下使复性的引物延伸合适的时间 7 7 重复重复 4 4 6 6 步步2525 3030次次 每次即为一个每次即为一个PCRPCR循环循环 8 8 微量琼脂糖凝胶电泳检查扩增产物微量琼脂糖凝胶电泳检查扩增产物 设置对照设置对照 阳性对照阳性对照 含靶序列含靶序列DNA样品样品 阴性对照阴性对照 用三蒸水代替模板用三蒸水代替模板DNA 影响影响PCR的因素的因素 模板核酸模板核酸 进行核酸体外扩增的模板可为进行核酸体外扩增的模板可为DNADNA或或RNARNA RNARNA的扩增需首先逆转录成的扩增需首先逆转录成cDNAcDNA后才能进行后才能进行正常正常PCRPCR循环循环 核酸标本来源广泛核酸标本来源广泛 纯培养的细胞或微生物纯培养的细胞或微生物 临床标本临床标本 血血 尿尿 粪便粪便 体腔积液体腔积液 漱口水等漱口水等 犯罪现场标本犯罪现场标本 血斑血斑 毛发毛发 精斑等精斑等 病理解剖标本病理解剖标本 新鲜的或经甲醛固定石蜡包埋组织新鲜的或经甲醛固定石蜡包埋组织 考古标本考古标本 模板核酸模板核酸 PCRPCR反应中模板加入量一般为反应中模板加入量一般为1010 2 2 10 10 5 5拷贝的靶序列 拷贝的靶序列 扩增靶序列的长度根据不同目的而不同扩增靶序列的长度根据不同目的而不同 一般为一般为500bp500bp以内以内 以以100100 300bp300bp为最好为最好 引物引物 引物是指两段与待扩增靶引物是指两段与待扩增靶DNADNA序列侧翼片段互补的寡核苷酸序列侧翼片段互补的寡核苷酸 PCRPCR扩增产物的大小是由特异引物限定扩增产物的大小是由特异引物限定 引物的设计与合成对引物的设计与合成对PCRPCR的成功与否有着决定性的意义的成功与否有着决定性的意义 引物的长度大多数为引物的长度大多数为2020 3030个碱基个碱基 只要引物不少于只要引物不少于1616个核苷酸个核苷酸 即能保证即能保证PCRPCR扩增的序列的特异性扩增的序列的特异性 一般引物的终浓度为一般引物的终浓度为0 20 2 1umol L1umol L 在此范围内在此范围内 PCRPCR产物量基本产物量基本 相同相同 缓冲液缓冲液 最为常用的缓冲体系为最为常用的缓冲体系为1010 50mmol L 50mmol L TrisTris HCl pH8 3HCl pH8 3 8 8 208 8 20 0 0C C 如果如果PCRPCR的产量低的产量低 可将可将TrisTris浓度增加至浓度增加至50m mol L50m mol L 此时此时pHpH 为为8 9 8 9 会增加产量会增加产量 MgMg 2 2 MgMg 2 2 是 是TaqDNATaqDNA聚合酶活性所必需的聚合酶活性所必需的 MgMg 2 2 浓度可影响 浓度可影响 酶的活性与忠实性酶的活性与忠实性 引物的复性引物的复性 模板与模板与PCRPCR产物的解链温度产物的解链温度 产物的特异性产物的特异性 引物二聚体的形成引物二聚体的形成 MgMg 2 2 浓度过低时 浓度过低时 酶活力显著降低酶活力显著降低 MgMg 2 2 浓度过高时 浓度过高时 则酶催化非特异性的扩增则酶催化非特异性的扩增 MgMg 2 2 TaqDNATaqDNA聚合酶需要的是游离聚合酶需要的是游离MgMg 2 2 PCRPCR混合物中的混合物中的DNADNA模板模板 引物和引物和dNTPdNTP的磷酸基团均可与的磷酸基团均可与MgMg 2 2 结合 结合 降低降低MgMg 2 2 实际浓度 实际浓度 解决方法解决方法 PCRPCR中中MgMg 2 2 的加入量要比 的加入量要比dNTPdNTP浓度高浓度高0 20 2 2 5mmol L2 5mmol L 三磷酸脱氧核苷酸三磷酸脱氧核苷酸 dNTP 在在PCRPCR的重复热循环过程中其热稳定性应为的重复热循环过程中其热稳定性应为50 50 循环后约循环后约50 50 仍为仍为 dNTPdNTP 为维持为维持PCRPCR产物量产物量 特异性与合成忠实性间的最佳平衡特异性与合成忠实性间的最佳平衡 反应中每种反应中每种dNTP dATP dGTP dTTPdNTP dATP dGTP dTTP和和dCTP dCTP 的终浓度为的终浓度为2020 200umol L200umol L 四种四种dNTPdNTP浓度相等浓度相等 耐热耐热DNADNA聚合酶聚合酶 催化一典型的催化一典型的PCRPCR所需酶量约为所需酶量约为2 2单位单位 加酶量过多则有可能加酶量过多则有可能 导致非靶序列的扩增导致非靶序列的扩增 温度循环参数温度循环参数 变性温度与时间变性温度与时间 此步若不能使靶基因模板和此步若不能使靶基因模板和 或或PCRPCR产物完全产物完全 变性变性 就会导致就会导致PCRPCR失败失败 典型的变性条件是典型的变性条件是9595 0 0C 30s C 30s 或或9797 0 0C 15s C 15s DNADNA在其链分离温度时的在其链分离温度时的 变性只需几秒钟变性只需几秒钟 变性温度太高会影响酶活性变性温度太高会影响酶活性 解决方法解决方法 在加在加TaqTaq聚合酶前先使模板在聚合酶前先使模板在9797 0 0C C变性 变性7 7 10min10min 在以后的循环在以后的循环 中中 将模板将模板DNADNA在在9494 0 0C C或 或9595 0 0C C变性 变性1min1min 复性温度与时间复性温度与时间 复性温度决定着复性温度决定着PCRPCR的特异性的特异性 引物复性所需的引物复性所需的 温度与时间取决于引物的碱基组成温度与时间取决于引物的碱基组成 长度和浓度长度和浓度 T 4T 4 G CG C 2 2 A TA T 温度高特异性强温度高特异性强 5555 6565 时扩增带是特异的时扩增带是特异的 温度过高温度过高 扩增效率扩增效率 温度低产量高温度低产量高 温度过低非特异扩增带温度过低非特异扩增带 时时间不主要间不主要 一般不少于一般不少于30s30s 延伸温度与时间延伸温度与时间 延伸温度取决于延伸温度取决于TaqDNATaqDNA聚合酶的最适温度聚合酶的最适温度 一般为一般为7272 0 0C C 较复性温较复性温 度高度高1010 0 0C C左右 左右 不合适的延伸温度不仅会影响扩增产物的特异性不合适的延伸温度不仅会影响扩增产物的特异性 也会影响其产量也会影响其产量 延伸时间决定于靶序列的长度与浓度延伸时间决定于靶序列的长度与浓度 2kb2kb的扩增片段需的扩增片段需1min1min 3 3 4kb4kb需需3 3 4min4min延伸延伸 循环数循环数 最适循环数取决于靶序列的初始浓度最适循环数取决于靶序列的初始浓度 初始靶序列初始靶序列 拷贝分子拷贝分子 循环数循环数 3 3 3 3x x x x1 1 1 10 0 0 0 5 5 5 5 2 2 2 25 5 5 5 3 3 3 30 0 0 0 1 1 1 1 5 5 5 5x x x x1 1 1 10 0 0 0 4 4 4 4 3 3 3 30 0 0 0 3 3 3 35 5 5 5 1 1 1 1x x x x1 1 1 10 0 0 0 3 3 3 3 3 3 3 35 5 5 5 4 4 4 40 0 0 0 5 5 5 50 0 0 0 4 4 4 40 0 0 0 4 4 4 45 5 5 5 扩增效率扩增效率 以染色体以染色体DNADNA为模板时为模板时 第第2525 3030个循环过程中个循环过程中 扩增扩增 DNADNA量明显增加量明显增加 2525 个循环后个循环后 扩增产物会扩增产物会减少减少 污染污染 PCRPCR方法最大特点是极为灵敏方法最大特点是极为灵敏 因每分子的目的基因因每分子的目的基因 可扩增可扩增 成上百万上千万的分子成上百万上千万的分子 只要稍微有点遗留只要稍微有点遗留 PCRPCR产物就可造产物就可造 成污染成污染 因此实验操作要特别仔细因此实验操作要特别仔细 PCRPCR反应前操作的地方和器材与反应后的应分开反应前操作的地方和器材与反应后的应分开 所用的试剂所用的试剂 应分成若干份保存应分成若干份保存 避免长期重复使用造成试剂污染避免长期重复使用造成试剂污染 加样加样 时时 DNADNA样品应最后加样品应最后加 并立即将管口盖妥并立即将管口盖妥 避免空气污染避免空气污染 原位原位PCR的原理的原理 原位原位PCRPCR 又称原位基因扩增又称原位基因扩增In situ gene amplificationIn situ gene amplification 是在组织结构是在组织结构 或细胞或细胞 保持不变的情况下保持不变的情况下 扩增已知的引扩增已知的引 物片段物片段 检测组检测组织织 或细胞或细胞 内相对应的未知的内相对应的未知的 或低拷贝或低拷贝 基因序列基因序列 经显色反应后经显色反应后 或经原位杂交及显色反应后或经原位杂交及显色反应后 在在 光镜下观察其扩增的阳性信号光镜下观察其扩增的阳性信号 作定性或定位检测的作定性或定位检测的 以分以分 子生物学技术结合形态学为特征的一门技术子生物学技术结合形态学为特征的一门技术 原位原位PCR的技术特点的技术特点 既有既有PCR的特异性与高灵敏性的特异性与高灵敏性 又具有原位杂交的定位准确又具有原位杂交的定位准确 性性 测到低于测到低于2个拷贝量的细胞内特定个拷贝量的细胞内特定DNA序列序列 甚至测出单一细胞中甚至测出单一细胞中 仅一个拷贝的原病毒仅一个拷贝的原病毒DNA 有助于细胞内特定核酸序列定位与其形态变化的结合分析有助于细胞内特定核酸序列定位与其形态变化的结合分析 可用于正常或恶性细胞可用于正常或恶性细胞 感染或非感染细胞的鉴定与区别感染或非感染细胞的鉴定与区别 原位原位PCRPCR技术操作比较复杂技术操作比较复杂 要有各种技术的参与要有各种技术的参与 组织学技术组织学技术 PCRPCR扩增技术扩增技术 原位杂交技术原位杂交技术 免疫组化免疫组化 分子生物学分子生物学 原位原位PCRPCR的四个基本步骤的四个基本步骤 样本固定样本固定 Sample Fixation 渗透渗透 Permeabilization 原位基因扩增原位基因扩增 In Situ Gene Amplification 原原位基因扩增产物的可视化位基因扩增产物的可视化 Visualization of gene amplification products In situ 为了保证原位扩增的成功为了保证原位扩增的成功 每一步骤必须优化每一步骤必须优化 样本固定样本固定 固定目的固定目的 为了在整个循环过程中保持形态的完整为了在整个循环过程中保持形态的完整 注意注意 样本所能承受的循环过程中温度极限样本所能承受的循环过程中温度极限 适合原位扩增的固定剂适合原位扩增的固定剂 1 1 4 4 多聚甲醛多聚甲醛 10 10 缓冲福尔马林缓冲福尔马林 乙醇乙醇 丙酮酸为丙酮酸为3 13 1 渗透渗透 目的目的 由于在固定过程中许多在细胞膜内的自然小孔会被关由于在固定过程中许多在细胞膜内的自然小孔会被关 闭闭 渗透是为了让扩增试剂进入到细胞内接近靶核酸渗透是为了让扩增试剂进入到细胞内接近靶核酸 注意注意 对每一不同的细胞或组织样本对每一不同的细胞或组织样本 这一步骤都要优化这一步骤都要优化 细胞细胞 将细胞孵育在含将细胞孵育在含60ug ml60ug ml蛋白酶蛋白酶K K的的PBSPBS中中5555 0 0C 2 C 2小时小时 然后加热到然后加热到9696 0 0C 2 C 2分钟以使蛋白酶分钟以使蛋白酶K K失活失活 组织切片组织切片 孵育在含有孵育在含有1 ng 1ml pre1 ng 1ml pre digested promase digested promase 50mM Tris HCl pH7 5 EDTA 3750mM Tris HCl pH7 5 EDTA 37 0 0C 20 C 20 60 min60 min 原位基因扩增原位基因扩增 原位基因扩增可通过特异的引物和热稳定原位基因扩增可通过特异的引物和热稳定DNADNA聚合酶增加靶聚合酶增加靶 核酸的拷贝数达检出水平核酸的拷贝数达检出水平 扩增产物的检测扩增产物的检测 扩增产物的可视化可通过以下两条途扩增产物的可视化可通过以下两条途径进行径进行 直接和间接直接和间接 直接法原位直接法原位PCR PCR Direct in situ PCRDirect in situ PCR 应用的引物和三磷酸核苷酸分别标以放射性同位素应用的引物和三磷酸核苷酸分别标以放射性同位素 如如 3535S S等 等 非放射非放射 性同位素性同位素 如生物素和地高辛如生物素和地高辛 进行进行PCRPCR原位扩增原位扩增 扩增的产物经放扩增的产物经放 射自显影射自显影 免疫组化和亲和组织化学方法进行检测免疫组化和亲和组织化学方法进行检测 不需原位杂交检不需原位杂交检 测特异性扩增产物的一种检测技术测特异性扩增产物的一种检测技术 直接法原位直接法原位PCRPCR 优点优点 操作简单操作简单 流程短流程短 省时省时 缺点缺点 特异性较差特异性较差 容易出现假阳性容易出现假阳性 且扩增率低且扩增率低 不适宜研究内源性基因重排和染色体易位不适宜研究内源性基因重排和染色体易位 也不甚适用于切也不甚适用于切 片标记片标记 间接法原位间接法原位PCR PCR Indirect in situ PCRIndirect in situ PCR 应用的引物和三磷酸核苷酸不带任何标记物应用的引物和三磷酸核苷酸不带任何标记物 当原位扩增结束后当原位扩增结束后 扩扩 增的产物经原位杂交技术检测增的产物经原位杂交技术检测 原位杂交所用的探针可特异性地检出原位杂交所用的探针可特异性地检出 扩增产物中的靶序列扩增产物中的靶序列 避免了扩增产物中非靶序列成分的检出避免了扩增产物中非靶序列成分的检出 具有具有 较高的特异性较高的特异性 间接法原位间接法原位PCRPCR 实际上是实际上是PCRPCR与原位杂交技术的结合与原位杂交技术的结合 故又称故又称PCRPCR原原 位杂交位杂交 PCR in situ hybridization PCR in situ hybridization 简称简称PISHPISH 间接法原位间接法原位PCRPCR 优点优点 目前应用最多目前应用最多 特异性强特异性强 引物中不带有标记分子引物中不带有标记分子 扩增率较高扩增率较高 寡聚核苷酸探针寡聚核苷酸探针以地高辛和生物素为标记物以地高辛和生物素为标记物 多不采用放射性同位多不采用放射性同位 素标记探针素标记探针 缺点缺点 步骤繁琐步骤繁琐 原位反转录原位反转录PCR In situ RT PCR 原位反转录原位反转录PCRPCR是以是以mRNAmRNA为起始物为起始物 通过反转录合成靶序列的通过反转录合成靶序列的 cDNA cDNA 然后以然后以cDNAcDNA为模板施行聚合酶链反应扩增为模板施行聚合酶链反应扩增 以检测细胞以检测细胞 和组织内和组织内mRNAmRNA靶序列的原位反转录靶序列的原位反转录PCRPCR 有别于原位有别于原位PCRPCR 以以mRNAmRNA为起始物为起始物 而原位而原位PCRPCR以以DNA DNA 为起为起 始物始物 有别于液相反转录有别于液相反转录PCRPCR 原位反转录原位反转录PCRPCR反应过程在组织切反应过程在组织切 片上进行片上进行 标记用标记用DNADNA酶处理酶处理 以破坏组织细胞中的以破坏组织细胞中的DNADNA 确确 保保PCRPCR扩增的模板是从扩增的模板是从mRNAmRNA反转录合成的反转录合成的cDNAcDNA 残留在细胞中残留在细胞中 DNADNA就不会被扩增就不会被扩增 原位反转录原位反转录PCRPCR更适宜检测细胞内低拷贝基因检出更适宜检测细胞内低拷贝基因检出 原位原位PCRPCR的操作方法的操作方法 组织取出后组织取出后 在室温或在室温或4 4 0 0C C用 用10 10 中性福尔马林固定中性福尔马林固定 固定时间不宜过固定时间不宜过 长长 一般一般4 4 6h6h 4 4 胰蛋白酶胰蛋白酶 2mg ml2mg ml 室温处理室温处理1515分钟分钟 乙醇脱水乙醇脱水 风干后开始风干后开始PCRPCR 所用的玻片需经镀膜所用的玻片需经镀膜 因在因在PCRPCR时要加热至时要加热至9090 0 0C C 须注意不要使切片干掉须注意不要使切片干掉 PCRPCR反应液的成分反应液的成分 20ul20ul 67mmol Tris67mmol Tris HCl pH8 3 HCl pH8 3 16mmol NH16mmol NH4 4 2 2SOSO4 4 1mmol 21mmol 2 mercaptomercapto ethanol ethanol 巯基乙醇巯基乙醇 10umol EDTA10umol EDTA 0 15 Triton0 15 Triton X 100X 100 200ug ml Gelatin200ug ml Gelatin 2mmol MgCl2mmol MgCl2 2 2mmol dNTPs2mmol dNTPs 0 5U ul Taq DNA polymerase0 5U ul Taq DNA polymerase 1umol each prime1umol each primersrs PCR PCR 循环循环 可自行设定可自行设定 反应结束后反应结束后 将玻片放入氯仿中除去植物油将玻片放入氯仿中除去植物油 用尖的针头揭用尖的针头揭 去盖玻片去盖玻片 二甲苯洗尽植物油二甲苯洗尽植物油 再用乙醇去掉二甲苯再用乙醇去掉二甲苯 最后最后 用杂交法检出增殖的用杂交法检出增殖的DNADNA 所用的探针为所用的探针为DIGDIG 1111 dUTPdUTP标记探标记探 针针 原位原位PCRPCR的注意事项的注意事项 所用组织主要有三种所用组织主要有三种 1 1 Eppendorf Eppendorf 管中的细胞悬液管中的细胞悬液 管内用管内用4 4 多聚甲醛固定多聚甲醛固定 室温室温20 20 在管内进行在管内进行PCRPCR反应反应 用用CytospinCytospin到玻片上检测产物到玻片上检测产物 2 2 cytospinscytospins 培养细胞培养细胞CytospinCytospin到硅化玻片上到硅化玻片上 固定固定 扩增扩增 3 3 组织切片组织切片 热循环中防切片干可用热循环中防切片干可用 指甲油指甲油 石蜡油橡胶石蜡油橡胶 敏感性敏感性 1 1 增加关键反应物的浓度增加关键反应物的浓度 例例 引物浓度引物浓度 MgMg 或 或DNADNA聚合酶聚合酶 2 2 增加扩增循环数增加扩增循环数 原位基因扩增结果的特异性原位基因扩增结果的特异性 1 1 对细胞悬液对细胞悬液 可用部分细胞作凝胶电泳和可用部分细胞作凝胶电泳和Southen blotting Southen blotting 方法方法 2 2 对玻片上的细胞和组织对玻片上的细胞和组织 应用一连接了对希望检测的扩增产应用一连接了对希望检测的扩增产 物有特异性的合适的探针作间接原位基因扩增物有特异性的合适的探针作间接原位基因扩增 同时同时 这一探针没这一探针没 有任何非特异性扩增序列有任何非特异性扩增序列 原位基因扩增产物的弥散原位基因扩增产物的弥散 采用采用既限制产物扩散又防止假阳既限制产物扩散又防止假阳 性结果产生的方法性结果产生的方法 1 1 扩增后处理扩增后处理 例例 扩增后洗扩增后洗 磷酸缓冲盐水磷酸缓冲盐水 后固定后固定 2 2 用一薄层琼脂糖覆盖在组织切片上以机械性地阻止扩增产物用一薄层琼脂糖覆盖在组织切片上以机械性地阻止扩增产物 弥散出细胞外弥散出细胞外 3 3 限制扩增循环数限制扩增循环数 4 4 增加切片厚度增加切片厚度 eg 12eg 12 原位基因扩增结果的定量原位基因扩增结果的定量 定量