《经典液相色谱法》PPT课件.pptVIP

1 第十六章色谱法基本概念及经典液相色谱法 第2节第3节第4节 2 第一节概述 第一节色谱分析法概述色谱法 chromatography 是一种根据物质的物理或物理化学性质不同而进行分离分析的方法 3 第一节概述 一 色谱法的发展概况色谱法的创始人是俄国植物学家茨维特Tsweet 20世纪30与40年代相继出现了薄层色谱和纸色谱 与柱色谱一起统称为经典的液相色谱法 使色谱法成为一门分离技术 20世纪50年代气相色谱的兴起 使色谱法在理论 仪器以及分离与 在线 分析等方面得到长足发展 奠定了现代色谱法的基础 4 第一节概述 20世纪70年代高效液相色谱的崛起 弥补了气相色谱不能直接用于分析难挥发 对热不稳定及高分子试样等方面的不足 拓宽了色谱法的应用范围 成为色谱发展史上又一个里程碑 20世纪80年代是色谱迅猛发展的重要时期 相继出现了液相色谱的各种联用技术 经过一个多世纪的发展 色谱法已成为重要的分离分析方法 5 第一节概述 二 色谱法的分类 一 按两相的分子聚集状态分类液相色谱法 LC 流动相为液体的色谱法 气相色谱法 GC 流动相为气体的色谱法 超临界流体色谱法 SFC 是以超临界流体作为流动相的一种色谱法 6 第一节概述 7 第一节概述 8 第一节概述 三 色谱过程色谱法具有相对运动的两相 其一是固定不动的 称为固定相 stationaryphase 而另一相则是携带试样向前移动的 称为流动相 mobilephase 色谱过程是物质在相对运动的固定相和流动相之间达到分配平衡的过程 例 顺式与反式偶氮苯的色谱过程 顺式与反式偶氮苯的色谱过程示意图a 加样b 洗脱c 继续洗脱1 顺式偶氮苯2 反式偶氮苯 9 第二节色谱法的基本概念一 色谱图色谱流出曲线 一 基线 是在操作条件下 仅有流动相通过检测系统时所产生的信号曲线 二 色谱峰 色谱流出曲线上的突起部分 分为对称峰与不对称峰 后者又分为前延峰和拖尾峰 第二节色谱法的基本概念 10 第二节色谱法的基本概念 色谱流出曲线和色谱峰区域宽度 11 第二节色谱法的基本概念 fs处于0 95 1 05之间为对称峰 小于0 95者为前延峰 大于1 05者为拖尾峰 色谱流出曲线上 一个组分的色谱峰可用峰位 峰高或峰面积及色谱峰的区域宽度等三项参数描述 分别作为定性 定量及衡量柱效的依据 峰高 h 色谱峰顶至基线的垂直距离 峰面积 A 色谱峰与基线所包围的面积 12 第三节基本色谱法的分离机制 吸附色谱过程就是组分不断被吸附 解吸附 再吸附 再解吸附 如此反复多次的过程 吸附平衡常数 组分的吸附平衡常数越大 组分越容易被吸附 保留时间越长 迁移速度就越慢 即后流出色谱柱 三 分配系数和容量因子 13 第二节色谱法的基本概念 分配系数与容量因子的关系 分配系数比 容量因子 capacityfactor k 14 第二节色谱法的基本概念 分配系数 容量因子与保留值的关系 分配系数 或容量因子 越小 组分的迁移速度越快 保留时间越短 即先流出色谱柱 反之亦然 分配系数 或容量因子 不等是组分分离的前提 15 第三节基本色谱法的分离机制 基本色谱法的分离机制一 吸附色谱法分离机制吸附色谱法是以吸附剂为固定相 液体 或气体 为流动相 利用吸附剂对不同组分的吸附能力差异进行分离的色谱法 吸附是指溶质在液 固 或气 固 两相的交界面上集中浓缩的现象 16 第三节基本色谱法的分离机制 二 分配色谱法分离机制分配色谱法是利用混合物中的不同组分在固定相和流动相中的溶解度不同 即在两相中的分配系数不同而实现分离的 分离机制 流动相携带样品流经固定相时 各组分在两相间不断地进行溶解 萃取 再溶解 再萃取 如此多次后 使分配系数稍有差异的组分得以分离 17 第三节基本色谱法的分离机制 三 离子交换色谱法分离机制离子交换色谱法是利用被分离组分离子交换能力的差别而实现分离的 分离机制 被分离的离子随流动相流经离子交换树脂时 与离子交换树脂上可被交换的离子连续进行竞争交换 因不同离子与交换树脂的竞争交换能力不同 其迁移的速度亦不同 交换能力弱的离子 迁移速度快 保留时间短 先流出色谱柱 18 第三节基本色谱法的分离机制 离子交换反应 R B A R A B 离子交换反应的选择性系数 KA B 用于衡量离子对树脂的亲和能力 KA B越大 说明A 的交换能力大 保留时间长 则A 比B 后流出色谱柱 若KA B较小 KA B 1 说明B 离子的交换能力大 保留时间长 则A 比B 先流出色谱柱 19 第三节基本色谱法的分离机制 四 空间排阻色谱法分离机制 空间排阻色谱法是利用被分离组分分子的大小或渗透系数的大小而进行分离分析的色谱法 分离机制 类似于反分子筛的作用 见右图 凝胶色谱分离机制示意图O 凝胶颗粒o 大分子组分 小分子组分 20 第三节基本色谱法的分离机制 各组分在流经凝胶表面时 由于小分子能完全渗透进入凝胶内部孔穴而被滞留 中等分子可以部分进入较大的一些孔穴 大分子则完全不能进入孔穴而只能沿凝胶颗粒之间的空隙随流动相流动 于是样品中各组分按大分子 中等大小的分子 小分子的先后顺序流出色谱柱 从而得以分离 21 第四节经典液相色谱法 第四节经典液相色谱法一 柱色谱法 一 吸附柱色谱法固定相 吸附剂 硅胶硅胶的吸附活性与含水量有关 含水量越大 活性级数越大 吸附活性越低 吸附能力越弱 22 第四节经典液相色谱法 硅胶呈微酸性 主要用于分离酸性和中性物质 如有机酸 氨基酸 甾体 萜类等 氧化铝吸附活性与其含水量密切相关 水分的增加能降低其吸附能力 中性氧化铝用于分离酸性 中性和碱性化合物 如生物碱 挥发油 甾体 萜类及在酸碱中不稳定的酯类 苷类等 23 第四节经典液相色谱法 聚酰胺主要通过分子中的酰氨基与化合物质子给予体形成氢键而对该物质产生吸附 因形成氢键的能力不同 吸附能力也不同 从而使各化合物得以分离 主要用于酚类 含黄酮类 蒽醌类 鞣质类等 酸类 硝基类等物质的分离 24 第四节经典液相色谱法 大孔吸附树脂 主要通过范德华引力或产生氢键而吸附被分离物质 选择性则由其多孔性网状结构所决定 主要用于水溶性化合物的分离及纯化 如皂苷 其它苷类物质等 25 第四节经典液相色谱法 流动相 吸附色谱中 流动相的洗脱作用实质上是流动相分子与被分离组分分子竞争占据吸附剂表面活性中心的过程 极性强的流动相分子占据吸附活性中心的能力强 具有强的洗脱作用 而极性弱的流动相分子竞争占据吸附活性中心的能力弱 洗脱作用就弱 26 第四节经典液相色谱法 流动相的选择必须同时兼顾被测物的性质 吸附剂的活性和流动相的极性等三方面 一般原则是 若被分离组分极性较小 宜选用吸附活性较大的吸附剂和极性较小的洗脱液 反之 则应选择吸附活性小的吸附剂和极性较强的洗脱液 27 第四节经典液相色谱法 被测物质的极性 吸附剂活性和流动相极性之间的关系示意图 28 第四节经典液相色谱法 二 分配柱色谱法固定相由载体及涂渍或键合在载体表面的固定液组成 载体是一种惰性物质 主要起负载或支撑固定液的作用 固定液正相色谱 强极性溶剂 如水 甲醇等 反相色谱 非极性或弱极性溶剂 如液体石蜡等 29 第四节经典液相色谱法 流动相正相色谱 极性小于固定相的醇类 酮类 酯类 卤代烷 苯或其混合物 反相色谱 水 稀醇等极性溶剂 应用各类化合物的分离 特别是亲水性物质 如极性较大的酚类 糖类 氨基酸衍生物等 30 第四节经典液相色谱法 三 离子交换柱色谱法固定相离子交换树脂 选择系数 用于衡量离子交换树脂的交换能力 交换容量大 树脂的交换能力强 性能参数 1 交联度 离子交换树脂中所含交联剂的量 用于衡量离子交换树脂的选择性 交联度大 树脂的网状结构紧密 网眼小 选择性好 2 交换容量 实验条件下 每克干树脂真正参加交换的活性基团数 31 第四节经典液相色谱法 流动相水为溶剂的缓冲溶液 应用去离子水的制备 天然药物化学成分的分离 各种有机酸 氨基酸的分离制备 抗生素的纯制 去除干扰离子 测定某些盐类的含量等 32 第四节经典液相色谱法 四 空间排阻柱色谱法 分子阻排色谱法 固定相 多孔性凝胶 常用葡聚糖凝胶 选择凝胶时应使试样的相对分子量落入凝胶的相对分子质量范围内 流动相一般水溶性试样选择水溶液为流动相 而非水溶性试样则选择四氢呋喃 氯仿 甲苯等有机溶剂为流动相 33 第四节经典液相色谱法 应用天然药物化学和生物化学的研究 水溶性高分子化合物如蛋白制剂等的分析 34 第四节经典液相色谱法 二 平面色谱法 一 薄层色谱法薄层色谱法是将固定相 如 吸附剂 均匀地涂铺在光洁的玻璃板 塑料板或金属板上形成薄层 在薄层板上进行分离分析的方法 分离机制与吸附柱色谱的分离机制相似 35 第四节经典液相色谱法 比移值与相对比移值 比移值 retardationfactor Rf 36 第四节经典液相色谱法 Rf可用范围是0 2 0 8 最佳范围是0 3 0 5 相对比移值 relativeretardationfactor Rr Rr可以大于1 也可以小于1 37 第四节经典液相色谱法 操作方法操作程序可分为制板 点样 展开 斑点定位等 定性和定量分析 定性分析 利用Rf或Rr进行定性 定量分析 处于半定量或限量检查阶段常用的定量方法有目视比色法 洗脱法和薄层扫描法 38 第四节经典液相色谱法 应用适用于有机化合物的分离与鉴定 也可用于小量物质的提纯与精制 在药学领域中 可用于测定药品纯度和检查降解产物 判断药品合成反应进行的程度 监控反应历程 分离和测定天然药物的有效成分 39 第四节经典液相色谱法 三 纸色谱法纸色谱法是以纸为载体的平面色谱法 分离机制属于分配色谱的范畴 根据溶质在两相间分配系数差异而分离 一般为正相色谱 化合物的极性越大或亲水性越大 则分配系数越大 Rf越小 化合物的极性越小或亲脂性越强 则分配系数越小 Rf越大 40 第四节经典液相色谱法 化合物一定时 展开剂的极性越大 化合物的分配系数越小 Rf越大 展开剂的极性越小 化合物的分配系数越大 Rf越小 固定相与展开剂 固定相一般为纸纤维及其吸着的水 展开剂 流动相 常为一些含水的有机溶剂 41 第四节经典液相色谱法 实验方法 1 色谱滤纸的选择应满足 纯净 无明显荧光斑点 均匀无痕 有一定的机械