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09级工技一班吕满枝吴伟岸张日兴 创新与实践 华南师范大学生命科学学院第七届生物化学实验技能大赛参赛作品 紫苏油的提取及其对大蒜SOD活性探讨 一 实验题目紫苏油的提取及其对大蒜SOD活性探讨二 摘要本次试验主要通过对紫苏油的提取 通过不同浓度的紫苏油对大蒜SOD活性的影响 得出最适合浓度 对现实生活中大蒜和紫苏混合吃法提供依据 在化妆品添加SOD的方面提供新思路 三 实验目的对紫苏油进行提取 并研究其对大蒜SOD活性影响 四 实验材料及试剂大蒜细胞SOD酶液 紫苏籽 正己烷 蒸馏瓶 试管 碳酸缓冲液0 05mol L EDTA溶液0 1mol L 蒸馏水 肾上腺素液0 5mol L 离心机 分光光度计 五 实验操作步骤5 1紫苏油的提取用搅拌机将50g苏籽研成末状 放入蒸馏瓶中 加入正己烷100mL 于55 恒温 回流1h 过滤 蒸馏可以得到深黄色油状液 5 2大蒜细胞SOD的提取5 2 1SOD的提取取30g左右的大蒜蒜瓣 用搅拌机打碎并加入2倍 3倍的0 05mol lpH7 8的磷酸缓冲液 搅拌10min 使SOD充分溶解到缓冲液中 然后3000r min离心15min 弃沉淀 得提取液 5 2 2除杂蛋白提取液加入0 25倍体积的氯仿 乙醇混合溶剂搅拌15min 3000r min离心15min 去杂蛋白沉淀 得粗酶液 5 2 3SOD的沉淀分离将上述酶液加入等体积的冷丙酮 搅拌15min 3000r min离心15min 得SOD沉淀 将SOD沉淀溶于0 05mol LpH7 8的磷酸缓冲液中 得到SOD酶液 5 3紫苏油对大蒜SOD活性研究取5根小试管 分别加入0 1 0 2 0 3 0 4 0 5mL的紫苏油 再同时加入0 6mL大蒜细胞SOD酶液 充分振荡5min 再静止5min 重复操作30min 待其分层 按下表加入 在加入肾上腺素前 充分摇匀并在30 C水浴中预热5min 加入肾上腺素 然后立刻测定各管480nm的光密度 每30s读一次数 读10min 结果与计算 SOD抑制肾上腺素自氧化的50 所需的酶量定义为一个酶活力 单位 即 酶活力 单位 2 A对照 A样品 N A对照式中 N 样品稀释倍数 2 抑制肾上腺素自氧化50 的换算系数 100 50 A 自氧化速率 实验数据 结果分析 曲线并没有在1min后出现线性相关 而是在30s的时候就达到了最大的吸光值 而且平均持续了3min左右 在平均3min后 光密度开始急速下降 在6 10min开始平缓下降 从实验原理来看 肾上腺素在碱性条件下先自氧化释放出O2 随后生成红色的肾上腺素红 R 这时溶液颜色变成淡红色 肾上腺素红在空气中并不稳定 会进一步氧化成其它化合物 此时溶液的颜色由淡红转为黄色 因此 要求我们测定时间严格控制在初始阶段 在这段时间内 肾上腺素红的积累在滞后一分钟左右后与时间基本成线性关系 问题分析 我们在查阅资料后发现 影响肾上腺素自氧化因素很多 其中pH 肾上腺素的浓度 温度尤为重要 我们认为肾上腺素的浓度过大是导致实验失败的主要原因 新的改进方法 将pH10 2 50mmol L的Na2CO3 NaHCO3缓冲液在30 0 5 水浴中保温20min 取2 9mL加入到1cm比色杯中 然后注入100uL1