KRAS、BRAF及PIK3CA基因突变与转移性结直肠癌的关系(1).pdf

B r a f 及P 1 3 K C A 基因的突变 P T E N 表达的变化都可以影响西妥昔单抗的疗效 2 0 0 9 年A S C O 会议上有多篇文献报道了预测西妥昔单抗疗效的生物学标志物 D iN i c o l a n t o n i o 等的研究 结果表明 B r a f 突变型的结直肠癌患者不能从西妥昔单抗的治疗中获益 B r a f 的基因状态 可以作为预测西妥昔单抗疗效的分子标志物 C A I R 0 2 研究结果再次证实了B r a f 的基因状态 可以显著影响西妥昔单抗的疗效 正是由于上述研究结果 2 0 1 0 年N C C N 指南中推荐 在使 用西妥昔单抗前同时检测K r a s 及B r a f 的基因状态 在结直肠癌患者中K r a s 基因的突变率 为3 0 4 0 B r a f 基因的突变率 1 5 并且在同一例结直肠癌组织标本中不会同时 存在K r a s 和B r a f 的突变 因此检测K r a s 及B r a f 的基因状态并不能完全预测西妥昔单抗的 疗效 J h a w e r 等发现在结直肠癌细胞系中 如存在P 1 3 K C A 的突变或P T E N 表达缺失 该细 胞系对西妥昔单抗缺乏敏感性 由此笔者推断 在结直肠癌患者中如存在P 1 3 K C A 的突变及 P T E N 的表达缺失 可能是造成西妥昔单抗治疗无效的另外一个原因 目前有关下游一些 分子能否作为西妥昔单抗治疗的筛选标准仍存在一定的争议 且当前的一些研究仅为体外 实验或小样本的临床试验 因此迫切需要一定的临床数据去验证上述的研究结果 为西妥昔 单抗的临床应用提供指导 6 小结 肿瘤的发生及发展是一个复杂的生物学过程 这与多种基因有关 目前 恶性肿瘤的治 疗已进入了靶向治疗的新时代 西妥昔单抗的临床应用在很大程度上改善了晚期结直肠癌患 者的治疗效果 但如何选择合适的患者是临床应用中面临的巨大挑战 因此需要进一步研究 特异敏感的预测西妥昔单抗疗效的生物学标志物 使单抗的治疗更加有的放矢 真正实现个 体化治疗 K R A S B R A F 及P I K 3 C A 基因突变与转移性结直肠癌的关系 兰州军区兰州总医院普通外科李洪涛刘宏斌赵青川韩晓鹏朱万坤苏琳 摘要 为了联合检测并分析K R A S B R A F 和P I K 3 C A 突变与临床病理指标之间的关系 探讨 基因突变在结直肠癌 C R C 发生 发展中的生物学意义 收集第四军医大学西京消化病医 院及兰州军区兰州总医院2 0 0 8 2 0 0 9 年入院治疗的1 5 0 例结直肠癌患者的癌组织标本 提取D N A 行P C R 扩增后 采用焦磷酸测序法联合检测K R A S B R A F 及P I K 3 C A 基因的突变率 统计分析基因突变与患者临床病理 包括患者的年龄 性别 肿瘤位置 D u k e s 分期 T N M 分期 组织病理学分型及转移 之间的关系 结果表明 在1 5 0 例患者中 K R A S 突变率为 3 2 4 8 1 5 0 B R A F 突变率为8 1 2 1 5 0 P I K 3 C A 突变突变率为1 2 1 8 1 5 0 其中9 号外显子突变率为6 9 1 5 0 2 0 号外显子突变率为6 9 1 5 0 K R A S 和P I K 3 C A 的突 变与患者的D u k e s 分期关系密切 K R A S B R A F 和P I K 3 C A 的突变与C R C 患者的年龄 性别 肿瘤位置 组织病理学分型之间无明显的关系 关键词转移性结直肠癌 基因突变 生物 学意义 0 引言 结直肠癌 C R C 是消化系统最常见的恶性肿瘤之一 每年全球新增病例约1 0 0 万 至 少有5 0 万患者因其死亡 死亡原因主要由于转移陋1 随着肿瘤分子生物学的发展 人们 2 0 0 发现C R C 的发生 发展与许多分子信号传导通路的调控有密切关系 其中包括表皮生长因子 受体 E G F R 所介导的信号传导通路 在许多实体瘤中E G F R 均有不同程度的表达 表达率 最高为头颈部肿瘤 达9 5 1 0 0 C R C 次之 为7 2 一8 9 胃癌表达率为4 1 一6 4 旧1 并且E G F R 表达率高的肿瘤恶性度高 侵袭力强 预后差H 1 E G F R 是一种跨膜酪氨酸激酶 受体 与配体结合后可引起下游信号传导通路的活化 如R A S R A F M E K E r k M A P K P 1 3 K A K T P K C I K K 和J A K S T A T E G F R 所介导的分子信号通路在C R C 的发生 血管生成 侵袭和转移中起着非常重要的作用阽刊 以往的研究说明基因突变及分子信号通路的激活导 致了C R C 的形成及发展 但这些分子事件与患者的年龄 性别 T N M 分期 转移等临床病理 特点之间的关系尚不明确 并且中国人群C R C 患者中这些基因突变情况的相关研究资料尚 不充分 本文通过检测C R C 患者中K R A S B R A F 及P I K 3 C A 3 个基因常见位点的突变情况 了 解基因突变和临床病理学特征之间的关系 尤其是基因突变和M C R C 转移性结直肠癌的关 系 探讨它们在C R C 中的生物学行为 1 资料与方法 1 1 一般资料收集2 0 0 8 年1 2 月一2 0 0 9 年1 2 月入住兰州军区兰州总医院及第四军医大学 西京消化病医院手术切除后的癌组织石蜡标本1 5 0 例 并收集每例患者临床资料 所有病例 都有明确的病理学诊断 均为C R C 癌组织标本量充足 可以进行分子生物学的检测 患者 的临床及病理资料见表1 1 2 实验方法 1 2 1D N A 样本提取和K R A S B R A F 及P I K 3 C A 基因的P C R 扩增反应使用E Z N A T M F F P E 组织D N A 提取试剂盒 从石蜡组织中提取D N A 样本 将提取D N A 加样于2 的琼脂糖凝胶 鉴定所提取D N A 纯度 本文的目的基因分别为K R A S B R A F 和P I K 3 C A K R A S 的突变主要发 生在1 号外显子的第1 2 1 3 号密码子 B R A F 的突变发生在1 5 号外显子的第6 0 0 号密码子 P I K 3 C A 的突变主要发生在9 和2 0 号外显子的第5 4 2 5 4 5 1 0 4 7 和1 0 4 9 号密码子 根 据目的基因的碱基序列 本文采用的各个基因的P C R 双向引物及测序引物序列见表2 每 个P C R 反应体系包括 1 0 P C Rb u f f e r5uL d N T P 2 5 m m o l L 4uL p r i m e rF 1 0 m m o l L 0 5l aL p r i m e rR 1 0 m m o l L 0 5I aL H o t s t a r t T a q0 4uL D A NS a m p l e4 uL H 2 03 5 6uL 总反应体系为5 0uL P C R 反应条件为 9 5 C 变性3 m i n 9 5 C 1 0 s 5 6 C2 0 s 7 2 C3 0 s 3 0 个热循环 最后在7 2 C 下延伸5 m i n 完成整个循环 将P C R 扩增产物行琼脂糖凝胶电泳以鉴定P C R 产物纯度 表11 5 0 例结直肠癌患者的临床病理资料 T a b l e1C 1 i n i c o p a t h o l o g i c a lp a r a m e t e r so f1 5 0c o o r e c t a lc a n c e rp a t i e n t s 一2 0 1 例觳 诧 比巩广 性别零 9 2 6 1 3 女 5 8 3 8 7 5 9 7 34 8 J 年龄 6 06 94 4 2 1 3 7 0 3 31 4 D 肿籀部位左半结肠 3 42 2 2 直肠 7 8 5 2 0 D t l k e s 分期 A B C 3 3 6 8 2 8 2 2 0 4 5 j 1 8 7 D2 11 4 0 糕液腺癌 2 41 6 0 病理鳃织学分型 印戒细胞癌4 27 鳞状细胞癌 10 7 来分化癌 31 2 0 表2目的基因的P C R 引物序列 T a b l e2S e q u e n c i n gp r i m e r sf o rP C R 1 1 R 双葡司穗 测序粥耪疼列 K R A S F lT A A G 蕊C T G 胍从A A T G A c T K R A s Rl 5 一B i o t i n T T G e A T C A T A 下r C G r C C A C A A KR A SlT T f 7 I G 汀A C T l B GA G C T B R A F F l B R A F R l B R A F S l C A T A A T G C T T G C T C T G A T A G G A 5 一B i o t i n C A A T T C l T r A C C A T C C A C A A A A T G G G T GA T r I l 丌 f 汀C T A G C P l K 3 e A 一9 一F lA A C A G C T C A A A G e A 几T r C T A e A C P l K 3 C A 一9 一Rl57 一B i v a i n G G T A T G G T A A A A A C A T G C T G A G A T P l K 3 A 一9 一S lA A G C 姒T r r C r A C A C G A G P I K 3 C A 一2 0 F lG A C A 7 n C A T A C A f r I G A A A G A C P I K 3 C A 一2 0 Rl5 B i o t i n G 1 1 T A A T T G T G T I G G A A G A T C C A A P I K 3 A 一2 D SlA G G C T l T G G A G T A T l T C A T i 2 2K R A S B R A F 和P I K 3 C A 基因突变的测序焦磷酸测序是由4 种酶一D N A 聚合酶 D N A p o l y m e r a s e 硫酸化酶 A T Ps u l f u r y l a s e 荧光素酶 1 u c i f e r a s e 和双磷酸酶 a p y r a s e 催化的酶级联反应 从而进行定量序列分析的一种测序技术 每个反应体系包 括反应底物 测序引物 待测序D N A 单链模板 具体步骤如下 采用瑞典B i o t a g e 公司生 2 0 2 产的P y r o M a r kI D 焦磷酸测序仪中配套的单链纯化装置从P C R 反应液中分离出l 条单链 D N A 并以此为模板 在测序仪中加入测序反应板进行基因测序 首先利用焦磷酸测序仪 器本身具有的分析软件进行S N P 位点的分析 如果存在杂合子的位点 再进行基因频率 A Q 的分析 本文利用焦磷酸测序技术得到K R A S B R A F 和P I K 3 C A 基因的测序结果 1 3 统 计学处理应用S P S S1 1 5 软件行x2 检验 Q O 0 5 为检验水准 其中包括四格表资料的 P e a r s o nX2 检验 四格表资料的x2 检验校正公式或F i s h e r 确切概率法 配对四格表 资料的x2 检验 2 结果与分析 2 1 琼脂糖凝胶电泳结果每例癌组织标本提取的D N A 样本及P C R 扩增反应后产物均进行 琼脂糖凝胶电泳以确定D A N 及P C R 扩增产物纯度 图1 为D N A 样本凝胶电泳图 图2 为K R A S B R A F P I K 3 C A e x o n 9 P I K 3 C A e x o n 2 0 P C R 扩增产物凝胶电泳图 圈1D N A 样本凝胶电泳图 F i g 1 E l e c t r o p h o r e t o g r a mi na na g a r o s eg e lo fD N A a K R A S b B R A F c lP I K 3 C A e x o n9 I d P I K 3 C A e x o n2 0 图2K R A S B R A F P I K 3 C A e x o n9 P I K 3 C A e x o n 2 0 的P C R 扩增产物凝胶电泳图 F i g2E l e c t r o p h o r e t o g r a m1 t 3 a na g a r o s eg e lo fK R A S B R A Fa n dP I K 3 C A e x o n9 e x o n2 0 2 2 K R A S B R A F 和P I K 3 C A 基因突变的测序结果在收集的1 5 0 例C R C 组织的石蜡标本中 共 检测到K R A S 突变患者4 8 例 突变率为3 2 4 8 1 5 0 B R A F 突变患者1 2 例 突变率为8 1 2 1 5 0 P I K 3 C A 突变患者1 8 例 突变率为1 2 1 8 1 5 0 结果见表3 K R A S 突变主 要发生在1 号外显子的1 2 号密码子 G G T G A T G G T G C T G G T G T T G G T T G T 和1 3 号 密码子 G G C G A C B R A F 的突变主要发生在1 5 号外显子的6 0 0 号密码子 G T G G A G P I K 3 C A 的突变主要发生在9 号外显子的5 4 2 G A A A A A 5 4 5 G A G C A G 号密码子和2 0 号外显子的1 0 4 7 C A T C G T C A T C A G 1 0 4 9 G G T G G C 号密码子 表3K R A S B R A F 和P I K 3 C A 基因突变率 T a b l e3F r e q u e n c i e so fK R A S B R A Fa n dP I K 3 C Am u t a t i o n s 2 0 3 K i 己茂s8 R AF p K 3 C A W豺WMW粥 百分率 嚷6 8 3 2 9 2 88 812 注 W 野生型 M 突变型 N g e s W w i h l t y 靶 M m u i a L h H l 2 3K R A S B R A F 和P I K 3 C A 突变与C R C 的D u k e s 分期之间的关系根据D u k e s 期分期标准 及临床资料 将患者分为4 期 A T t 2 N O M O 3 3 1 5 0 2 2 B T 3 4 N O M O 6 8 1 5 0 4 5 3 C T 1 4 N 1 3 M O 2 8 1 5 0 1 8 7 D T 1 4 N O 一3 M 1 2 1 1 5 0 1 4 结果表明 K R A S 基因在A B C 及D 期患者中的突变率分别为2 4 8 3 3 2 9 2 0 6 8 2 1 6 2 8 和6 7 1 4 2 1 B R A F 基因的突变率分别为0 7 5 6 8 1 4 4 2 8 和1 4 3 2 1 P I K 3 C A 基因在A B C 及D 期患者中的突变率分别为4 2 3 3 7 5 6 8 1 1 4 2 8 和4 8 1 0 2 1 表4K R A S B R A F 和P I K 3 C A 突变与结直肠癌D u k e s 分期之间的关系 T a b l e4R e l a t i o n s h i pb e t w e e nK R A S B R A Fa n dP I K 3 C Am u t a t i o n sa n dD u k e ss t a g i n g l艉Phi P n P 从表4 可以看出 K R A S 和B R A F 的突变不可同时存在于同一患者中 而K R A S 和 P I K 3 C A 的突变可以同时发生 K R A S 和P I K 3 C A 的突变和C R C 的D u k e s 分期有显著的关 系 采用卡方检验进行统计学分析 结果具有统计学意义 P 值分别为0 0 0 2 2 2 4 和 0 0 2 8 2 5 相反B R A F 的突变和C R C 的D u k e s 分期无明显关系 P O 1 1 1 6 随着C R C 的 D u k e s 分期的升高 K R A S 及P I K 3 C A 的突变率也升高 值得注意的是 D u k e sD 期的C R C 患者中K R A S 及P I K 3 C A 的突变明显增多 4 8 1 2 2 1 P 0 0 5 表5K R A S B R A F 及P I K 3 C A 与临床病理学特征之间的关系 T a b l e5R e l a t i o n s h i pb e t w e e nK R A S B R A Fa n dP I K 3 C Am u t a t i o na n d c l i n i c o D a t h o l o g i c a l p a r a m e t e r s 2 0 4 n崩P吖嗬Pn臆P 忭铀 5 9 2 2 5 2 7 I O I l 1 2 1 3 1 女 5 8 2 1 3 7 I 2 7 1 2 5 97 3 2 8 f 3 8 7 9 1l le1 5 1 锋醇 6 0 6 94 4 1 3 3 0 0 0 52 5 0 0 5 f 8 0 0 5 7 0 3 37 2 I J 2 1 7 j5 1 4 肿矗位量右半结脯 3 4I1 3 3 0 0 5l 0 0 57e 2 1 0 0 5 暮腑 7 8 23f30 4 5l 7 1 9 t 黏灌脾癌 2 410 44 04 f 1 5 1 鳃织亨分型 印戒绸胞癌43 1 6 7 0 0 5 1 7 0 0 5 1 3 3 1 0 0 5 螭斌绷胞岳 1 0 00 来分化癌 3000 3 讨论 C R C 的发病率位于全球恶性肿瘤的第3 位 约有2 5 的患者初诊时发现存在肝脏 肺脏 等远处器官的转移 并且M C R C 患者的5 年存活率低于1 0 n 1 在过去的1 0 年中 随着分 子生物学和细胞生物学的发展 对C R C 的形成及发展机制有了更加深入的了解和认识 广 大学者现一致认为表皮生长因子受体 E G F R 所介导的下游信号传导通路 如R A s R A F M A P K P t 3 K A K T 通路的持续激活与C R C 的发生 发展密切相关阳1 而K R A S B R A F 和P I K 3 C A 癌 基因的突变是导致上述分子信号通路持续活化的原因之一 近年来针对E G F R 等靶点的治 疗 使C R C 的治疗已由原来的手术加放 化疗进展到靶向治疗的新时代 抗E G F R 的单克 隆抗体 西妥昔单抗和帕尼单抗 的临床应用明显改善了C R C 尤其是M C R C 患者的治疗效 果 C 2 2 5 联合F O L F I R I 或F O L F O X 的治疗在M C R C 的一线治疗中显示了巨大的优势阳1 C 2 2 5 可以阻止E G F R 与其配体的结合 阻断受体的二聚体化 抑制下游分子信号传导通路 的激活 从而影响与肿瘤生长和转移相关的细胞功能 包括细胞的增殖 新生血管的生成和 细胞的凋亡等 1 大量临床研究证实 C 2 2 5 仅适用于K R A S 野生型的C R C 患者 K R A S 基 因已经成为预测C 2 2 5 疗效的生物学标志物n 2 1 然而在随后的临床应用中发现 即使是 K R A S 野生型患者仍有部分人群对C 2 2 5 抗体的治疗缺乏敏感性n 引 最近的研究表明 B R A F 和P K 3 C A 基因的突变和C 2 2 5 治疗的低反应率有明显的关系n5 但是B R A F 和P I K 3 C A 等 分子能否成为预测C 2 2 5 疗效的生物学标志物 并广泛应用于临床 仍需进一步的研究和证 实 许多研究报道了在西方人群中 C R C 患者的K R A S B R A F 和P I K 3 C A 的突变率随 1 6 1 但 有关中国C R C 患者的K R A S B R A F 和P I K 3 C A 的突变发生率尚不清楚 已有的也仅为小样本 的结果 另外有文献报道称C R C 患者中 K R A S 的突变与息肉样腺癌的关系密切n 引 但目 前有关基因突变和患者临床病理特征之间关系尚不明确 并且存在一定的争议 因此本文旨 在研究中西方人群中C R C 患者的K R A S B R A F 和P I K 3 C A 的突变率是否存在差别 探讨K R A S B R A F 和P I K 3 C A 基因的突变与C R C 临床病理学特征之间有无关系 期望能发现一些M C R C 危 险因素的预测因子 本文收集了1 5 0 例C R C 患者手术切除的癌组织石蜡标本 采用焦磷酸 测序技术检测K R A S B R A F 和P I K 3 C A 的突变率 焦磷酸测序技术是一种切实可靠的测序技 术 它的灵敏程度远高于其他测序方法n 8 结果表明 在1 5 0 例患者中 K R A S B R A F 和 P I K 3 C A 的突变率和文献报道的大体一致n 2 2 1 因此中西方人群中C R C 患者的K R A S B R A F 2 0 5 和P I K 3 C A 的突变率无明显差别 据报道 在C R C 的发展过程中 K R A S 和P I K 3 C A 的突变对 P 1 3 K A K T 通路的活化有协同作用乜 并且K R A S 和P I K 3 C A 的突变与C R C 的分期 分级有 一定的关系乜3 本文利用1 5 0 例C R C 患者的癌组织标本发现 K R A S 和B R A F 的突变在同一 患者中不可同时存在 而K R A S 和P I K 3 C A 的突变却可以同时发生 K R A S B R A F 和P I K 3 C A 的突变与C R C 患者的年龄 性别 肿瘤位置 组织病理学分型之间无明显的关系 然而K R A S 和P I K 3 C A 的突变与患者的D u k e s 分期之间的关系密切 相比之下 B R A F 的突变和D u k e s 分 期无明显的关联 研究发现 C R C 患者的D u k e s 分期越高 K R A S 与P I K 3 C A 的突变率越高 并且P I K 3 C A 的突变与K R A S 的突变关系密切 K R A S 突变型的C R C 患者中P I K 3