基因工程育种技术.doc

. 基因工程育种技术基因工程又称重组DNA技术，是指将一种或多种生物的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物(受体)，使受体按人们的愿望表现出新的性状。基因工程诞生于1972年，在其后几年中由于担心重组生物对环境安全的影响，基因工程技术的发展曾一度受挫。但随着人们对DNA重组所涉及的载体和受体系统进行有效的安全性改造，以及相应的DNA重组实验室设计和操作规范的建立，再加上重组DNA技术的巨大应用潜力的诱惑，重组DNA技术迅速发展，现在，基因工程已成为生物学实验室的一项常规技术，并广泛应用于医药、农业、食品、环保等许多领域。 第一节 基因工程的基本过程和原理基因工程最典型的操作如图6-1所示一般包括以下三个步骤：1外源DNA的获得与酶切；2外源DNA与经同样酶切的载体的连接；3连接产物转化受体细胞及阳性转化子的筛选； 图6-1 基因工程的基本过程由图6-1可见，基因工程操作过程需要以下基本材料：外源DNA(基因)、载体、DNA体外重组用的酶以及宿主细胞。一、 载体 外源基因导入受体细胞一般都要借助于载体，基因工程中最常用的载体是质粒载体。图6-2所示pUC19就是最常用的载体之一。 图6-2 载体pUC19及其多克隆位点载体一般含有以下几个基本元件：(一) 复制原点载体在宿主细胞中要独立存在则应具有独立复制的能力，复制原点又称为复制起始位点(Origin，简称ori)，控制载体复制。不同生物的载体复制原点不同，同一种生物的不同载体拷贝数和稳定性有很大差别，这主要决定于载体的复制原点的性质。图6-2所示的pUC系列载体的复制原点是pAM1的一个突变体，在合适的大肠杆菌宿主细胞中(如大肠杆菌JM109)其拷贝数可达500。整合型载体的复制原点被整合位点的同源序列替代。(二) 筛选标记一般是载体上的一段编码酶的基因，能赋予转化子新的性状，便于转化子的筛选。载体pUC19的筛选标记是-内酰氨酶基因（常简写为bla或Ampr），能分解氨苄青霉素中的-内酰氨环使其失活，因此在含氨苄青霉素的平板上，只有含质粒的转化子能生长而不含质粒的宿主细胞不能生长。抗药性是细菌载体中最常用的筛选标记，除氨苄青霉素抗性外，卡那霉素、氯霉素、四环素等抗性也常用作载体的标记。另一类常用的标记是营养缺陷型互补标记，在真核生物载体中更常用。(三) 多克隆位点（multi cloning site, 简写为MCS）载体中用于插入外源基因的区域，往往是一段人工合成的序列，这一序列中含多种限制性核酸内切酶的识别位点。图6-2下方即为载体pUC19的多克隆位点，这一段序列可被十多种限制性内切酶识别，酶切后能产生多种黏性末端，有利于外源DNA片断的插入。除质粒载体，cosmid、细菌人工染色体(Bacterial Artificial Chromosome，BAC)、酵母人工染色体(Yeast Artificial Chromosome，YAC)等也是基因工程中常用的载体，这些载体适合于插入长片段的外源DNA，主要在构建基因库时使用。二、DNA重组用酶 DNA重组过程最常用的酶是限制性核酸内切酶和连接酶，这两种酶几乎应用于DNA重组的所有实验中。(一) 限制性核酸内切酶（Restriction Endonuclease）目前已发现的限制性核酸内切酶有600多种，根据性质不同分为3类，基因工程中常用的是II类酶，这类酶有比较专一的识别和切割位点，通常专一性的识别DNA序列中46个碱基的回文序列。表6-1列出了几种最常用内切酶的识别序列。 表6-1 常用的限制性核酸内切酶限制性内切酶识别位点产生的黏性末端BamH I5-GGATCC-33-CCTAGG-55-G-33-CTTAA-5EcoR I5-GAATTC-33-CTTAAG-55-G-33-CTTAA-5 Hind III5-AAGCTT-33-TTCGAA-55-A-33-TTCGA-5 Pst I 5-CTGCAG-33-GACGTC-55-CTGCA-33-G-5 Sal I5-GTCGAC-33-CAGCTG-55-G-33-CAGCT-5 Sma I 5-CCCGGG-33-GGGCCC-55-CCC-33-GGG-5Kpn I5-GGTACC-33-CCATGG-55-GGTAC-33-C-5限制性内切酶和后面介绍的连接酶都有商品出售，一般在需要时向有关厂商索取产品目录，再根据实验需要决定使用哪些酶。(二) 连接酶DNA连接酶催化的基本反应是将DNA双链上3-羟基和5-磷酸基共价结合形成35磷酸二酯键。基因工程中最常用的DNA连接酶是T4-DNA连接酶，反应机理如图6-3所示。 图6-3 T4-DNA连接酶的作用DNA重组实验中，最常见的反应是将外源DNA片段和载体用相同的核酸内切酶切开，使外源DNA片断和载体带有相同的黏性末端，两者混合后迅速降温至1420，由于带有相同的黏性末端一部分外源片段和载体互相退火，形成带切口（Nick）的双链环装重组质粒，在连接酶的作用下切口被修复，形成完整的闭合环状重组质粒。(三) 宿主细胞 野生型细菌对外源DNA的转化效率较低，需要进行遗传改造。野生型细菌具有针对外源DNA的限制和修饰系统，能降解外源DNA，因此转化效率很低。大肠杆菌的限制修饰系统主要由hsdR基因编码，许多经改造的大肠杆菌宿主菌为hsdR，转化效率大大高于野生型大肠杆菌。以外源基因克隆和重组为目的的基因工程实验需要重组载体在宿主菌中自主复制，在野生型细菌中存在的rec基因家族的编码产物使外源基因能与染色体发生同源重组。在野生型大肠杆菌中，存在着两条体内同源重组的途径，RecBCD途径和RecEF途径，两条途径均需要RecA重组蛋白的参与，RecA是同源重组所必须的。recA型大肠杆菌体内的遗传重组频率降低106倍。常用的大肠杆菌宿主菌常常是recA、recB、或recC，有些宿主则三个基因均被灭活。为提高受体的转化率有时还通过遗传改造提高细胞壁的通透性。目前基因工程实验中常用的大肠杆菌宿主有JM109、DH5、TG1等，这些菌株经过复杂的遗传改造除具有很高的转化效率和很低的重组频率外还具有一些其他的特性便于重组质粒的筛选。另一些大肠杆菌宿主菌如C600、JM101等保持了较完整的限制修饰系统或遗传重组系统，这些菌株的转化率要低一点，常用作一些穿梭载体的宿主，有时从这些宿主菌中提取的质粒用于转化野生型宿主时能获得较高的转化率，因此在工业微生物的改造中很有价值。(四) 外源DNA外源DNA一般即为DNA重组的目的基因，获得目的基因是基因工程的核心问题，根据对目的基因的了解程度可采用鸟枪克隆法、cDNA克隆法、PCR法以及化学合成法等。1. 鸟枪克隆法的原理鸟枪克隆法的基本过程如下：首先是构建供体菌的基因文库。提取供体菌的染色体DNA，不完全酶切。酶切染色体最常用的是一种叫Sau3 A的核酸内切酶，这种酶的识别位点是GATC，由于只有四个碱基，因此在染色体上出现频率很高，通过控制酶浓度和反应时间使只有一部分位点被切开，如控制得好几乎可以达到随机切割的目的，另外Sau3A酶切产生的黏性末端和BamH I是相同的，因此酶切产物可以和用BamH I酶切的载体连接。根据目的基因的性质，可以采用不同的反应条件以分离不同长度的DNA片段，部分酶切后再通过电泳将DNA片段分开，从电泳凝胶上分离大小合适的片段。克隆细菌或酵母的单个基因一般分离5Kb左右的片段就足够。当然分离更长的片段有利于减小筛选的工作量，但要获得大的酶切片段首先要求提取的染色体足够长，另外在质粒载体中接入长片段的DNA特别是大于10kb的片段是很不容易的事。将分离的DNA片段与用BamH I酶切并去除5端磷酸的载体连接转化大肠杆菌宿主。在相应的选择性平板上筛选重组质粒。如果实验成功则绝大多数的转化子应含有插入片段大小合适的重组质粒，同时转化子应该足够多以确保绝大部分基因被包含在转化子的质粒中。将转化子收集起来就获得了该供体菌的基因库。一个完整的基因库应收集的转化子的数量一般可用Charke-Carbon公式计算：Nln(1-P)/ln(1-f)。其中N为构建基因文库的重组转化子总数，P为基因文库的完备性（即某一基因被克隆的概率），f为克隆片段长度和生物单倍体基因组总长之比，例如酿酒酵母的基因组总长为12,068 kb，如克隆片段的长度为5 kb，如要求基因文库的完备性为0.9，则根据上式计算N应为5,550，即收集的重组菌落数应不少于5,550，在绝大部分情况下，P0.9是完全足够的。第二步是从基因文库中筛选含目的基因的重组菌。根据对目的基因的了解，可以采用不同的方法进行筛选，其中最常用的方法可能是菌落原位杂交法。这种方法首先要求知道目的基因的部分序列。利用这一部分序列制成带标记的探针，用探针去找出含目的基因的重组菌。其过程如图6-4 所示。 图6-4 菌落原位杂交首先将基因文库涂布相应的抗菌素平板，控制每块平板的菌落数在50200。将菌落影印到一形状与平板相似的尼龙膜上，将粘有菌落的尼龙膜用NaOH处理使细胞破裂DNA释放到膜上，同时DNA在强碱性条件下变性为单链，烘烤使DNA固定在膜上。将粘有DNA的尼龙膜适当处理后，放入杂交袋中，加入已被标记的探针。标记常用放射性元素如32P，当然在缺乏防护条件的情况下也可以用生物素和地高锌标记，不过灵敏度不如放射性标记。将探针作预处理，使其成为单链，加入杂交袋中，杂交过夜。探针和目的基因的对应片段是互补的，因此如某一菌落含有的重组质粒插入了目的基因则探针应与粘有该菌落的膜在对应位置结合并把标记也一起带到膜上，通过一定的方式这一位置可以被显示出来，在原平板上找到对应的菌落，这个菌落所含的质粒中应插入了目的基因。如插入片段不是很长可以将插入片段的序列全部测出，通过序列比对找出目的基因。如插入片段很长则可以将插入片段进一步酶切成小片段再寻找到含目的基因的小片段，这一过程常被称为亚克隆。用菌落原位杂交筛选目的基因首先要获得目的基因的部分序列或至少是一段与目的基因序列相似性很高的DNA片段，显然这一序列还必须是宿主菌所没有的。这一片段一般可以通过两条途径获得，一是将已知的来源于其他物种的同源基因的序列（一般采用保守性更好的氨基酸序列）进行比对，找出其中高度保守的序列，根据保守序列设计引物，以供体菌染色体DNA为模板通过PCR获得目的基因的部分片段，如果序列分析确认PCR所获片段确实是目的基因的片段则这一片段可以用于制作探针。另一种方法是分离目的基因编码的蛋白质，通过分析氨基酸序列设计简并引物再通过PCR获得目的基因的部分序列，再根据这部分序列通过杂交“钓”出基因的全序列。从基因库中筛选目的基因的另一类方法是通过目的基因的产物来筛选。一般如果目的基因的产物很容易检测，如产物是淀粉酶、蛋白酶等则可以直接在平板上筛选。有些目的基因还可以通过与宿主菌的功能互补来筛选，使用这一方法必须有相应的基因功能缺陷的菌株。采用免疫学方法也能比较方便的检测基因的产物。当然采用这些方法的一个共同的前提是目的基因在宿主菌中能表达出有活性或至少是结构相近的产物。一般来讲原核生物的基因在大肠杆菌中都能或多或少的表达出一些产物，而真核生物基因由于含有内含子，在大肠杆菌中一般不能表达出有活性的产物。有两种方法可以有助于这一问题的解决，一是在构建基因文库时采用大肠杆菌酿酒酵母穿梭载体，构建以酿酒酵母为宿主的基因库，筛选含目的重组酿酒酵母，获得相应的重组酵母后再从酵母中提取质粒以获得目的基因，这一方法对筛选酵母基因一般是有效的。酿酒酵母自身的基因一般不含内含子因此切除内含子的能力不强，而且不同的生物切除内含子的方式不同，因此将这一方法用于筛选其他物种的基因时常常会失败。构建cDNA文库是解决这一问题的更有效的方法，这一方法首先提取提取供体菌的总mRNA通过逆转录获得第一条cDNA单链，再以该单链为模板合成第二条cDNA链，形成cDNA双链，将这些cDNA链克隆到质粒载体上即会获得所谓的cDNA文库，cDNA文库来源于mRNA序列因此不含内含子，用这一方法很多真核基因在大肠杆菌就能表达出有活性的产物。上面介绍的从基因文库中筛选目的基因的方法主要针对相对较小的单个基因。如克隆的目的基因较大，特别是大于5kb时，用质粒文库往往很难拿到完整的基因，另外在研究微生物代谢时，催化某一代谢途径的酶往往以基因簇的形式存在，如要把整个基因簇一次克隆出来则需要每个克隆含有的插入片段很长，这也是质粒文库所不能实现的。构建含长片段DNA的基因文库时可以采用BAC载体和YAC载体，这种载体能插入数百kb的DNA片段。构建BAC库和YAC库的原理与构建质粒文库相似但采用的实验技术要复杂得多。2. PCR的基本原理PCR是多聚酶链式反应（Polymerase Chain Reaction）的简称，其基本原理如图6-5所示。 图6-5 PCR反应原理PCR技术最基本的应用是从大量DNA中将已知序列的目标基因的拷贝数极大提高，以便将其分离出来。如图6-5所示，首先针对已知序列的目标基因，设计一对引物。每一条引物的序列分别与目标DNA双链的一条链的3端互补。PCR反应一般在一500 L或更小的离心管中进行，反应液一般包括模板，即包含目标基因的双链DNA片段、引物、耐热DNA聚合酶（以Taq酶最常用）、含四种碱基的脱氧核糖核苷三磷酸（dATP、dTTP、dGTP、dCTP简称dNTPs）、当然还有酶反应所需的缓冲液等成分。PCR反应一个循环的第一步是高温变性。图6-5采用的是95，在此温度下目标基因所在的DNA片段双链分开，变为单链。第二步是复性，即体系温度降低，DNA双链又重新结合为双链，在反应体系中，引物的拷贝数远远超过模板的拷贝数，因此目标基因复性时，其两端首先和引物结合为双链，即 复性后目标基因两端是分别和引物结合的，而不是和原有的互补链结合。复性温度因引物和实验目的不同而变化，一般为4070，以5060最常见，图中以55为例。第三步是链的延伸，体系温度升到72，这是耐热DNA聚合酶作用的最适温度，从引物的3端开始合成DNA链。反应结束时目标基因的量增加了一倍，即由1变成了2。第二个循环结束时目标基因由2增加到4，依次类推，n个反应后目标基因的量达到了原来的2n倍。在实际工作中真正有用的是那些两端都由加入的引物组成的DNA片段，这些DNA分子的量一般为2n2（n1）。一次PCR反应以2535个循环为比较多见。在实际的PCR反应中，每一次循环后目标基因的量都不可能象理论推算的那样增加，最后获得的目标基因的量一般都通过电泳来作初步判断。PCR技术不光能用于扩增已知序列的基因，也能用于克隆新基因和基因的改造，并广泛应用于疾病检测司法鉴定等许多领域。第二节 大肠杆菌基因工程大肠杆菌是基因工程实验最常用的宿主菌，这主要是因为大肠杆菌的一些菌株如JM109、DH5等经多次遗传改造已具有很高的转化率，从这些宿主中提取质粒也远比从其他宿主中提取质粒简单，因此许多以非大肠杆菌为宿主的基因工程实验也往往先以大肠杆菌为宿主进行DNA片段的拼接，获得所需要的重组载体或重组DNA片段后再转化相应的宿主菌。一、大肠杆菌感受态细胞的制备和转化外源DNA进入宿主并稳定遗传，这一过程称为转化，获得高的转化效率关键在于制备高质量的感受态细胞。最常用的制备感受态大肠杆菌的方法是CaCl2法，这一方法的优点是简便，其转化率一般能达到106个转化子/微克超螺旋质粒，这在大部分基因工程实验中已经够用。目前，转化大肠杆菌转化率最高的方法可能是电击转化法，这种方法能获得高达109个转化子/微克超螺旋质粒的转化率，这一方法的缺点是需要专门的电转化仪和电击杯，其中电击杯价格昂贵而且只能使用23次，因此电击转化法一般只在进行需要高转化率的实验，如构建基因文库时使用。在没有电转化仪的情况下，有一些化学转化法如Inoue法和Hanahan法也能获得108以上的转化率，但是这两种方法都依赖于大容量冷冻离心机而且对操作技巧有很高的要求，事实上真的要获得108以上的转化率往往需要较长时间的条件摸索。实验6-1 用氯化钙制备和转化感受态大肠杆菌 1实验材料LB培养基 ：NaCl 10 g/L, Trypton 10g/L, Yeast Extract 5 g/LSOC培养基：在每100 ml已灭菌的LB培养基中加入以下已灭菌的成分：0.25 mol/L KCl 1ml，2 mol/L MgCl2 0.5 ml，20葡萄糖 2 ml0.25 mol/L KCl：18.6 g KCl溶于1 L水中2 mol/L MgCl2：406 g MgCl26H2O溶于1 L水中氯化镁氯化钙溶液：MgCl2 80 mmol/L，CaCl2 20 mmol/L，取16.24 g MgCl26H2O、2.2 g无水 CaCl2溶于1 L水中氯化钙溶液：0.1mol/L，取无水氯化钙11.1 g溶液1 L水中(4 保藏)甘油溶液：CaCl2 0.1 mol/L，35 丙三醇，取无水11.1 g CaCl2，350 ml分析纯丙三醇，用纯水定容至1 L以上试剂均0.08 MPa，灭菌20 min大肠杆菌JM109待转化质粒37回转式恒温调速摇瓶柜 恒温水浴锅（两台，分别为37、42）高速冷冻离心机 2操作步骤： (1)制备感受态细胞挑取大肠杆菌新鲜单菌落一个于2 ml液体LB培养基中，37振荡培养过夜。取0.2 ml培养液于含50 mlLB培养基的500 ml三角瓶中，37 剧烈振荡培养至OD600值为0.30.4，将装有菌液的三角瓶放入冰水中，轻轻摇晃使菌液迅速冷却。取预冷的50 ml离心管一个，将菌液倒入离心管中，冰浴15 min。于4，4,000 r/min 离心5 min，弃尽上清液。加入预冷的氯化镁氯化钙溶液20 ml，轻轻吹吸悬浮菌体，于冰水中放置15min。于4，4,000 r/min离心5min，弃尽上清液，用预冷的氯化钙溶液2 ml溶液悬浮体。菌液在冰水中放置15 min，用无菌吸头将菌液分装到1.5 ml 离心管中，一般为每管200 L。到这一步就已经获得了感受态细胞，可立即用于转化，也可在4放置48小时，在最初的1224小时内转化率可提高46倍。上述感受态细胞也可加入1/2体积的甘油溶液后在-70保藏，但经冷藏的感受态细胞转化率有较大幅度的下降，以作者的经验，下面介绍的以PEG制备的感受态细胞更适合于低温长期保藏。(2)转化取感受态细胞一管，在冰水中放置10 min。加入待转化的质粒（200L 感受态细胞加入质粒体积不超过10 L），轻轻混匀，在冰水中放置30 min。将管子放入42 水浴中，准确计时90 s，迅速取出放回冰水中，静止5 min。加入SOC培养基800 L，轻轻混合，37 水浴45 min。将菌液适当稀释后涂布含相应抗菌素的固体LB平板，37培养培养1218h后即可见菌落。CaCl2法是一种简便快速的制备感受态细胞的方法，上面介绍的操作方法需要使用冷冻离心机，目前国内很多实验室不具有这种价格昂贵的仪器，其实对这一方法略作改变，用一台普通台式高速离心机即可完成操作。实验6-2 用氯化钙制备感受态大肠杆菌1材料和方法LB培养基：NaCl 10 g/L, Trypton 10g/L, Yeast Extract 5 g/L氯化钙溶液：0.1mol/L，取无水氯化钙11.1 g溶液1 L水中(4 保藏)以上试剂均0.08 MPa，灭菌20 min37回转式恒温调速摇瓶柜 恒温水浴锅（两台，分别为37、42）台式高速离心机 挑取大肠杆菌JM109新鲜单菌落一个于装有15 ml液体LB培养基的100 ml三角瓶中中，37振荡培养至OD600值为0.30.4，将装有菌液的三角瓶放入冰水中，轻轻摇晃使菌液迅速冷却。取预冷的1.5 ml离心管若干个，用无菌枪头将菌液分装到离心管中，每管装菌液1.5 ml。离心管迅速放入冰水中，静止30min。8,000r/min 离心30 s，离心后将离心管迅速放入冰水中静置2 min，弃尽上清液。加入预冷的氯化钙溶液约400 L，轻轻吹吸悬浮菌体，于冰水中放置15 min。8,000 r/min离心30 s，迅速放回冰水中，静置2 min。弃尽上清，加入预冷的氯化钙溶液100 L，轻轻吹吸悬浮菌体，菌悬液迅速放回冰水中。所获菌悬液即为感受态细胞，可立即用于转化，也可在4放置1224 h这样可获得更高的转化率。采用这一方法要获得较高的转化率的关键是保持低温，即菌液离开冰水的时间要尽可能短。根据作者的经验，即使在夏天实验室温度高达35 时只要操作迅速所获感受态细胞的转化率也能达到5106以上。实验6-3用PEG制备和转化大肠杆菌感受态细胞1. 实验材料LB培养基 ：NaCl 10 g/L, Trypton 10g/L, Yeast Extract 5 g/LA液：Trypton 10 g/L，Yeast Extract 5 g/L，NaCl 10 g/L，MgSO4 10 mol/L（每升加入MgSO47H2O 2.5g），葡萄糖 20 g/L。分装于250 ml三角瓶中，每瓶50 ml。B液：甘油 360 g/L，PEG8000 120 g/L，MgSO4 12 mol/L，Trypton 10 g/L，Yeast Extract 5 g/L，NaCl 10 g/L。以上试剂均过滤除菌。大肠杆菌 JM109待转化质粒37回转式恒温调速摇瓶柜 恒温水浴锅（两台，分别为37、42）高速冷冻离心机 2操作步骤感受态细胞制备：大肠杆菌JM 109于LB培养基中振荡培养过夜。取0.5 ml培养液于50 ml A液中，剧烈振荡培养约90 min，至对数期。冰水浴30 min，6,000 r/min离心8 min。弃尽上清，加入0.5 ml 用冰水预冷的A液，轻柔悬浮细胞，并保持低温（不可用漩涡混合仪）。加入2.5 ml 冰水预冷的B液，轻柔混合。以100 L每支分装到1.5 ml 冰预冷的Eppendorf管中（用未经处理的普通国产Eppendorf管灭菌即可）。冰水浴90 min，-70保藏或直接用于转化。转化：取出感受态细胞，在冰水中融化。加入待转化的DNA，体积不超过5 L，用粗口吸头轻柔混合，不可用漩涡混合仪。冰水浴20 min。42热激60 s。加入1 ml LB培养基，37水浴60 min。涂布含相应抗菌素的LB平板。37，培养12 h，菌落计数。用PEG法制备的感受态细胞的转化率略高于氯化钙法，但对操作技巧有一定的要求，其中加入溶液B后将菌悬液与溶液B混合是一关键步骤，因为这一步溶液粘度很大不容易混合，而同时又必须保证在轻柔操作的基础上充分混匀。与氯化钙法相比这一方法的特点是所制备的感受态细胞更适合于冷冻保藏，由这一方法制备的感受态细胞在-70保藏三个月后转化率一般仍能达到107数量级，这是采用氯化钙法难以实现的。另外采用本方案时各种试剂须采用过滤除菌，如采用高温灭菌会导致转化率大幅度下降。实验6-4大肠杆菌的电击转化1.实验材料LB培养基 ：NaCl 10 g/L, Trypton 10g/L, Yeast Extract 5 g/L无菌水10甘油溶液GYT：100 ml甘油、1.25 g Yeast Extract、2.5 g Trypton，溶于1 L纯水中以上试剂均0.08 MPa，灭菌20 min大肠杆菌 JM109待转化质粒37回转式恒温调速摇瓶柜 恒温水浴锅（两台，分别为37、42）高速冷冻离心机 2操作步骤感受态细胞制备从新鲜的LB平板上挑取一个大肠杆菌菌落，接种于含15 ml LB培养液的三角瓶中，37振荡培养过夜。取5 ml菌液于含500 ml LB培养基的2 L三角瓶中，37振荡培养，培养至OD600值接近0.4时将三角瓶放入冰水混合物中，轻轻摇动使菌液迅速冷却。将菌液转移到预冷的离心管中，4，3,000 r/min，离心15 min，弃尽上清，用500 ml冰预冷的无菌水悬浮细胞，菌液在冰水中放置5 min。4，3,000 r/min，离心20 min，倒掉上清液，用250 ml冰预冷的10甘油悬浮细胞，悬液在冰水中放置10 min。4，3,000 r/min，离心20 min，倒掉上清，用10 ml冰预冷的10甘油悬浮细胞。4，3,000r/min，离心20 min用无菌吸管将液体吸尽，加入1 ml冰预冷的GYT培养液，在冰水中轻轻摇动，使菌液逐步悬浮。取少量菌液稀释后测定OD值，用冰预冷的GYT培养液稀释菌液至2101031010个细胞/ml 。上述感受态细胞可以直接使用。如要冷冻保藏可以按每份50 L分装到500 L离心管中，没入液氮中快速冷冻，在-70保藏。电击转化取感受态细胞一份，加入待转化DNA 12 L（如果是连接产物应先将其用无水乙醇沉淀，弃尽上清，再用75的乙醇洗涤，再用无菌水溶解）。调节好电转化仪参数，使电脉冲为25 F，电压为2500 V，电阻为200 W。将菌液与DNA的混合物加入冰预冷的电击杯中，将电击杯迅速放入电转化仪中，启动电击。注意电击后仪器显示的数字不可能与设定的参数完全一致但应接近。电击后迅速将电击杯取出加入1 ml 常温SOC培养液。将菌液转移至一1.5 ml离心管中，于37 培养1 h菌液适当稀释后涂布含20 mmol/L MgSO4和适当抗生素LB培养基，37培养1216 h。二、大肠杆菌中质粒的提取与纯化最常用的从大肠杆菌中提取质粒的方法是由Birnboim和Doly于1979年建立的SDS碱裂解法，这一方法的基本原理是在含强阴离子洗涤剂的碱性溶液中细胞破裂而染色体和蛋白质变性，并和破裂的细胞壁互相缠绕成大型复合物，分子量较小的质粒DNA和RNA释放到上清液中，前者被被十二烷基硫酸盐包盖。当用钾离子取代钠离子时，这些复合物会从溶液中有效的沉淀下来。也有一些研究者认为用SDS和碱处理细胞时细胞膜和细胞壁中的蛋白质、脂类等被去除而肽聚糖骨架依然存在，分子量较小的质粒和RNA可以从肽聚糖骨架的网格中“钻到”溶液中而分子量较大的染色体和一部分变性的蛋白质则留在网格内，在随后用溶液III处理时后者形成沉淀。不管哪种解释更接近实际情况，用SDS和强碱处理细胞是使质粒和染色体分离的关键步骤，这时染色体和其他成分形成的复合物是比较脆弱的，如动作过于剧烈或处理时间过长则会有较多的染色体释放到清夜中在随后用溶液III处理时这部分染色体依然和质粒混在一起，由于质粒和染色体均属于DNA因此两者很难再被分开。实验6-5 质粒的大量提取与纯化1实验材料LB培养基：NaCl 10 g/L, Trypton 10g/L, Yeast Extract 5 g/LTris.HCl 100 mmol/L (pH 8.0)：取12.1 g 三（羟甲基）氨基甲烷于500 ml纯水中，用HCl调pH至8.0，定容至1 LEDTA.Na2 100mmol/L(pH 8.0)：取EDTA.Na22H2O 37 g，溶于500 ml纯水中，以10NaOH溶液调pH至8.0，定容至1 LSolI：葡萄糖 50 mmol/L，Tris.HCl 25 mmol/L (pH 8.0), EDTA 10mmol/L，(pH 8.0) ，在500 ml纯水中加入葡萄糖7.3 g、Tris.HCl 100 mmol/L (pH 8.0) 250 ml，EDTA.Na2 100mmol/L(pH: 8.0) 10 ml，定容至1 L 4保藏SolII：NaOH 0.2mol/L，SDS 1%，临用前以20% SDS，400 g/L NaOH新鲜配制。乙酸钾3mol/L：876 g乙酸钾，溶于1 L纯水中Sol III：乙酸钾3mol/L 60 ml，冰乙酸11.5 ml，水28.5 ml（pH 4.8）。TE: Tris.HCl 10 mmol/L (pH 8.0)，EDTA 1 mmol/L (pH 8.0)，Tris.HCl 100 mmol/L (pH 8.0) 100 ml、EDTA.Na2 100mmol/L(pH 8.0) 10 ml用纯水定容至1 L5 mol/L LiCl：211.95 g LiCl 溶于800 ml纯水中，定容至1 LRNase A（5 g/ml）：取RNase A 0.5 g，溶于1 ml纯水中，煮沸5min13 PEG8000：取PEG8000 13 g，溶于100 ml纯水中平衡酚：上海华美生物工程公司产品含质粒的大肠杆菌100 ml以上容量离心机台式高速离心机水浴锅2操作步骤将含质粒的菌株接种液体LB培养基，加入相应的抗菌素，振荡培养12-18 h。取100 ml菌液于离心管，3,000 r/min,15 min离心收集菌体。用SolI 5 ml悬浮菌体，转入50 ml离心管中。以下各步需轻柔操作加入SolII 10 ml，将离心管颠倒数次，使菌体裂解，室温放置3 min。加入预冷的SolIII 7.5 ml，颠倒混合，冰水放置15min。3,000 r/min，10min离心。取上清液于另一50 ml离心管中，弃沉淀。加入0.6-1倍体积的异丙醇，颠倒混匀，放置20-30 min。3,000 r/min，10 min钟离心，弃上清。以1 ml TE或无菌水溶解沉淀，转入2 ml离心管中。质粒的纯化加入5 mol/L LiCl 1 ml，混匀，放置5 min。8,000 r/min，离心10 min, 上清液转入一5 ml离心管中。加入1.5 ml异丙醇，混匀，放置5 min，8.000 r/min，离心10 min，弃尽上清。用500 L TE溶解，加RNase （5 g/ml） 5 L，37保温30 min。加入等体积的13 PEG8000，混匀，室温放置5 min。8,000r/min，离心15 min，弃尽上清，用400 ml TE溶解沉淀。加入等体积的平衡酚，颠倒，放置5min，8,000r/min离心5 min。取上清于另一支离心管中，加入等体积的氯仿，颠倒，放置5 min。取上清于另一离心管中，加入2.5倍体积的无水乙醇，混匀，放置20-30min。8,000 r/min,10min离心。弃上清，用70%乙醇洗涤沉淀，最后以20 LTE或无菌水溶解沉淀，-20保存。实验6-6 质粒的小量提取1实验材料LB培养基：NaCl 10 g/L, Trypton 10g/L, Yeast Extract 5 g/LTris.HCl 100 mmol/L (pH 8.0)：取12.1 g 三（羟甲基）氨基甲烷于500 ml纯水中，用HCl调pH至8.0，定容至1 LEDTA.Na2 100mmol/L(pH 8.0): 取EDTA.Na2.2H2O 37 g，溶于500 ml纯水中，以10NaOH溶液调pH至8.0，定容至1 LSolI：葡萄糖 50 mmol/L，Tris.HCl 25 mmol/L (pH8.0), EDTA 10mmol/L，(pH8.0) ，在500 ml纯水中加入葡萄糖7.3 g、Tris.HCl 100 mmol/L (pH 8.0) 250 ml，EDTA.Na2 100mmol/L(pH 8.0) 10 ml，定容至1 L 4保藏SolII：NaOH 0.2mol/L, SDS 1%，临用前以20% SDS，400 g/L NaOH新鲜配制。乙酸钾3mol/L：876 g乙酸钾，溶于1 L纯水中SolIII：乙酸钾3mol/L 60 ml，冰乙酸11.5 ml，水28.5 ml（pH 4.8）。TE: Tris.HCl 10 mmol/L (pH 8.0), EDTA 1 mmol/L (pH 8.0)，Tris.HCl 100 mmol/L (pH 8.0) 100 ml、EDTA.Na2 100mmol/L(pH 8.0) 10 ml用纯水定容至1 LRNase A (5 g/ml)：取RNase A 0.5 g，溶于1 ml纯水中，煮沸5 min平衡酚：上海华美生物工程公司产品含质粒的大肠杆菌台式高速离心机水浴锅将含质粒的菌株接种2 ml液体LB培养基，加入相应的抗菌素，振荡培养至稳定期（如接种新鲜菌落一般应培养45h）。取1.5 ml菌液于离心管， 8,000 r/min,1 min离心收集菌体,弃尽上清。用Sol200 L悬浮菌体。加入Sol400 L，将离心管颠倒数次，使菌体裂解，室温放置3 min。加入预冷的Sol 300 L，颠倒混合，8,000 r/min,10 min离心。取上清液于另一1.5 ml离心管中。加入0.6-1倍体积的异丙醇，颠倒混匀，放置3 min。8,000 r/min,5 min离心，弃上清。以100 L TE或无菌水溶解沉淀，加RNase （5 mg/ml） 1 L，37保温30 min。 小量提取质粒的方法十分便捷，所获得的质粒能用于酶切、电泳等绝大部分分子生物学操作，只是混有较多的杂质，其中可能含有DNA水解酶，因此必须冷冻保藏。实验6-7 用硅胶膜分离法小量提取质粒目前用于提取质粒的试剂盒一般都采用硅胶来分离质粒。质粒提取的基本原理与前面介绍的方法是相同的，即在含强阳离子洗涤剂的碱性溶液中使质粒与染色体和大部分蛋白质分离。前面介绍的质粒小量提取法中，利用异丙醇使DNA等大分子沉淀出来并用RNase将RNA消化掉，这个方法的主要缺点是异丙醇沉淀时会将溶液中蛋白质等杂质也一起带出来，这些物质对质粒的酶切等性质有时有很大影响，另外异丙醇沉淀还会将一些DNA水解酶也带到沉淀中，从而使所获质粒很容易自动降解，所以在质粒大量提取的方法中使用了酚抽提这一繁琐又有一定危险的步骤以去尽蛋白质。硅胶具有一特殊的性质，即在高离子强度的溶液中可以与核酸专一性的结合，而在离子强度降低后又能与所结合的核酸分离。质粒提取试剂盒就是根据这一原理实现质粒的快速纯化。下面介绍一种质粒快速提取试剂盒的操作方法。所有试剂均由试剂盒配套操作步骤 取过夜培养菌液，离心，弃上清。 取1.5 ml离心管，倒入约1.5 ml菌液。8,000 r/min离心1 min。弃尽上清。 加入150 L溶液I彻底悬浮菌体。 加入200 L溶液II颠倒离心管数次，使细菌完全裂解，溶液透明。 加入500 L溶液III，颠倒离心管6-8次，可见白色絮状物产生。 8,000 r/min 离心5 min，直接将上清倒入质粒纯化柱，最高速离心15 s，使质粒结合于纯化柱上。 倒弃收集管内液体，在质粒纯化柱内加入750 L溶液75乙醇，最高速离心15s，洗去杂质。 倒弃收集管内液体，最高速再离心1 min，除去残留液体。 将质粒纯化柱放在质粒收集管上，加入50 LTE至管内柱面上，放置1 min。 用1.5 ml离心管作为收集管，8,000 r/min离心1 min，所得液体就是立即可用的超纯质粒。 在上述操作步骤中，溶液I、II、III和前面介绍的Sol I、II、III基本相同但成分有所改变。根据作者的经验，在Sol III中加入NaI提高离子强度，则用自制的Sol I、II、III代替试剂盒中的溶液也能达到相同的效果。由上述方法获得的质粒质量与采用大量提取的方法获得的质粒相近，在37下放置数天质粒不会降解，因此是一种非常简便有效的方法。三、外源基因在大肠杆菌中的高表达(一) 外源基因在大肠杆菌中高表达的原理根据中心法则，从基因到蛋白质要经过转录和翻译两个步骤。一个完整的原核基因至少应该包括启动子、SD序列、结构基因（包括翻译起始密码子和翻译终止密码子）和转录终止子。启动子控制基因表达的第一步，是高表达的关键，但其他环节也同样能显著影响基因的表达水平，例如结构基因中如果含大量稀有密码子有时可以使该基因在大肠杆菌中无法实现高表达，另外有时仅仅提高基因拷贝数也能大幅度提高基因的表达。外源基因在大肠杆菌中的高表达往往通过大肠杆菌的高表达载体来实现，下面我们通过对高表达载体的分析来理解影响基因高表达的因素。 如图6-7 pEtac是作者构建的一个大肠杆菌高表达载体 图 6-7 大肠杆菌高表达载体pEtac与普通的大肠杆菌载体相比，除复制子、筛选标记、多克隆位点外，pEtac还含有以下结构：1.强启动子载体pEtac采用的是tac启动子，这是一个由trp启动子的-35序列和lacUV5启动子的Pribnow序列构成的杂合启动子，能控制mRNA的高水平转录，并且不受葡萄糖抑制。载体pEtac上另一个与转录相关的结构是lacI基因，其产物为乳糖操纵子的阻遏蛋白，在无诱导物的情况下，阻遏蛋白能形成一四聚体与Pribnow序列下游的操纵基因lacO结合，从而抑制基因的转录，其调控方式与乳糖操纵子是相同的，即加入诱导物IPTG（异丙基-b-D-硫代半乳糖苷）后，诱导物与阻遏蛋白结合并使其改变构象，导致其与操纵基因的结合力下降而从操作基因上解离出来，tac启动子的转录被激活。在高表达载体中加入这种阻遏蛋白基因的目的是要降低基因的本底表达。强启动子能使基因高水平的表达，如果这种表达是组成型的，在菌体生长的过程中目的基因产物就会大量产生，这对菌体的生长会有不利影响，有时甚至会导致菌体无法生长而得不到转化子。Tac启动子含有乳糖操纵子来源的lacO基因，在大肠杆菌中其表达本身就受相应的阻遏蛋白的抑制。但是，大肠杆菌中，lacI基因的表达水平很低，当含tac启动子的载体进入大肠杆菌后，lacI阻遏蛋白无法与所有lacO结合，因此其tac启动子的本底表达会很高。针对这一情况，一种能过量表达阻遏蛋白的lacI基因的突变体lacIq被应用于表达系统，大肠杆菌JM109、DH5等菌株的基因型均为lacIq。载体pEtac本身含有lacIq基因，因此即使在普通的大肠杆菌菌株中也能过量表达lacI阻遏蛋白，使本底表达尽可能降低。被用于大肠杆菌高表达的启动子非常多，其中来源于噬菌体的启动子可能是表达水平最高的，这里介绍一类来源于T7噬菌体的启动子。T7噬菌体的基因1编码的T7 RNA聚合酶能选择性的激活T7噬菌体启动子的转录，其合成mRNA的速度比普通大肠杆菌的RNA聚合酶快5倍左右。下面介绍一种由美国Novagen公司提供的表达载体pET20(b)，此载体采用了T7噬菌体的外壳蛋白-10的启动子，习惯常称为T7启动子。图6-8 大肠杆菌高表达载体pET20(b)由图6-8可见，pET20b采用T7启动子控制基因的表达，在启动子的下游为pelB leader，是一大肠杆菌前导序列，前导序列下游是多克隆位点，pET20(b)实际上是一分泌型表达载体，插入多克隆位点的基因与前导序列融合表达，产物可进入细胞周质。由于pET系列载体的使用的T7启动子需要由T7 RNA聚合酶识别并激活转录，因此宿主菌必须能产生T7 RNA聚合酶。与pET系列载体配套的宿主菌有大肠杆菌BL21(DE3)，JM109(DE3)等，其中DE3代表这些宿主菌是噬菌体DE3的溶源菌。噬菌体DE3是噬菌体的衍生株，一段含有lacI、lacUV5启动子和T7 RNA聚合酶基因的DNA片段被插入其中int基因中，因此这些DE3的溶源菌能在lacUV5启动子控制下合成T7 RNA聚合酶以激活T7启动子的表达。载体pET20b本身并不含lacO基因，由于T7 RNA聚合酶的表达受IPTG诱导，因此这个载体也必须在IPTG诱导下才能高表达外源基因。2.SD序列在强启动子控制下转录产生大量mRNA只是基因高表达的第一步，基因的表达水平还与mRNA的翻译起始频率相关。大肠杆菌中，mRNA的翻译起始频率主要由其5端的一段称为核糖体结合位点的序列决定，当翻译起始密码子上游6至8个核苷酸的序列为5-UAAGGAGG-3时正好和核糖体小亚基中的16s rRNA 3端区域3-AUUCCUCC-5结合，这段序列常被成为SD序列，这个区域中碱基的变化会明显影响翻译的起始效率，其中又以GGAG这四个碱基最为重要，改变任何一个都会使基因的翻译起始频率大幅度下降。SD序列和翻译起始密码子之间的距离也明显影响翻译起始频率，当SD序列为UAAGGAGG时，与AUG之间的距离以68个碱基最有利于翻译起始。大肠杆菌中，翻译的起始密码子有AUG、GUG和UUG三种，其中以AUG最有利于翻译起始。另外SD序列与起始密码之间的碱基以及起始密码附近的碱基序列对基因表达也有影响，一般SD序列与起始密码之间的碱基A、T含量高有利于翻译起始。3.转录终止一个高表达载体在强启动子和多克隆位点下游往往含有强终止子。在强启动子下游如果没有强终止子往往会产生转录过头的