《黄酮类化合物》PPT课件.ppt

第二章黄酮类化合物ChaptertwoFlavonoids 2 1黄酮类化合物的概述 黄酮类化合物是广泛存在于自然界的一大类化合物 数量之多列天然酚性化合物之首 大多具有颜色 基本母核为2 苯基色原酮的一系列化合物 估计植物光合作用所固定的碳约有2 每年约109吨 转变成黄酮类化合物或与其紧密相关的其他化合物 近年来 泛指具有C6 C3 C6基本构型 天然黄酮化合物母体上常含有 OH OCH3等取代基 黄酮类化合物广泛存在于植物的所有部分 包括根 茎 心材 树皮 叶 花 果实中 在植物叶中大部分黄酮类化合物一般是以苷的形式存在 花 果 叶中较多 日常摄取的食物亦含有黄酮类化合物 芹菜 青苋菜 韭菜 洋葱 茶叶 番茄 蜂蜜 苹果 葡萄 花茎甘蓝 荞麦叶 罗马甜瓜 柑橘 柠檬 红橘 樱桃 柚子 青椒 木瓜 李 杏 咖啡 可可 红葡萄酒 各种小浆果等 2 2黄酮类化合物的分类 B环 苯基 连接的位置 2或3位 以及三碳链是否与B环构成环状结构等特点 将主要的天然黄酮类化合物分为 黄酮 flavones 黄酮醇 flavonol 黄烷醇 flavanol 二氢黄酮 flavanones 二氢黄酮醇 flavononol 异黄酮 isofeavones 查耳酮 chalcones 花色素 anthocyanins 等 2 3黄酮苷的构成方式 一 O 糖苷 苷元与糖以C O C方式连接 如 黄酮 二氢黄酮和异黄酮多在7位上连有羟基 黄酮醇和二氢黄酮醇多在3位羟基或3 7两位羟基上连有糖 二 C 糖苷 三 构成黄酮苷的糖类 单糖类单糖主要有D 葡萄糖 D 半乳糖 D 木糖 L 鼠李糖 L 阿拉伯糖及D 葡萄糖醛酸等 糖基不通过氧原子直接连在6位或8位碳上 如 葛根素 双糖类常见双糖有麦芽糖 乳糖 新橙皮糖 龙胆二糖 芸香糖等 三糖类常见三糖主要有槐三糖 sophortriose 鼠李三糖 rhamninose 龙胆三糖 Gentianose 等 芸香糖 龙胆二糖 龙胆三糖 2 4黄酮类化合物的理化性质 一 形态黄酮类化合物多数为结晶性固体 少数 如黄酮苷类 为无定形粉末 二 颜色 黄酮 黄酮醇及其苷类多呈灰黄至黄色 查耳酮为黄至橙黄色 而二氢黄酮 二氢黄酮醇 异黄酮类 因在分子结构中不存在交叉共轭体系 故不呈黄色 几乎为无色 花色素的颜色除了与共轭程度有关外 还与外界环境的pH有关 pH8 5 变为醌式结构显兰色 三 旋光性 二氢黄酮 二氢黄酮醇 黄烷醇 二氢异黄酮及其衍生物 具有旋光性 四 溶解度 一般黄酮苷元难溶于水 易溶于甲醇 乙醇 氯仿 乙醚 乙酸乙酯等有机溶剂及稀碱液中 花色苷水溶性较大 黄酮类化合物的羟基被糖苷化后 水溶性增加 脂溶性降低 五 酸碱性 黄酮类化合物因分子具有酚羟基 故显酸性 可溶于碱性水溶液 吡啶中 六 显色反应 黄酮类化合物的颜色反应主要是利用分子中的酚羟基及 吡喃酮环上的性质 2 5主要黄酮类化合物 一 黄酮 flavones 广泛分布于被子植物中 以唇形科 玄参科 爵麻科 苦苣苔科 菊科等植物中存在较多 该类化合物中以芹菜素和木犀草素最为常见 二 黄酮醇 flavonol 槲皮素R H 芦丁R 芸香糖各种蔬菜和水果中 芦丁为黄色粉末或极细微淡黄色针状晶体 溶于乙醇 丙酮 乙酸乙酯 不溶于苯 乙醚 氯仿等 三 二氢黄酮 flavanones 二氢黄酮醇 flavononol 具有饱和的C2一C3键 C4有羰基 C环成环 C3有羟基取代为二氢黄酮醇 如甘草苷 liquiritin 水飞蓟素 silybin 和杜鹃甲素 matteucinol 橙皮甙 三 查耳酮 Chalcone 查耳酮又称黄色二氢黄酮类 二氢黄酮类碱性条件可转化为2 羟基查耳酮 酸化后又可转变为无色的二氢黄酮 红花苷是红花中的主要成分 开花初期为无色新红花苷 后期变为黄色红花苷 干燥后变为醌式红花苷 二氢查耳酮的衍生物 衍生物具有甜味 回味时无苦味 理想的甜味剂 可用于食品和制药工业 柚皮苷 R 新橙皮糖R R H R OH 甜味为蔗糖的100倍 含于柑橘中 新橙皮甙R 新橙皮糖R H R OH R OCH3 甜味为蔗糖的1000倍 含于柑橘中 四 双黄酮 双黄酮类化合物是由两分子的黄酮类化合物通过C C和C O C两种方式连接 比如银杏叶的银杏素 ginkgetin 白果素 bilbetin 等以C C方式连接 桧素 hinoki 1avone 以C O C方式连接 C1 C8连接 化合物 RR R R 银杏素CH3CH3HH白果素HHHH 五 异黄酮和二氢异黄酮 这类化合物的特点是B环取代在C3位上 如大豆异黄酮 大豆异黄酮是一复杂的大家族 国外已经鉴定出10多种 大豆异黄酮的植物雌激素作用 大豆异黄酮的抗氧化活性作用 抗癌 抗肿瘤作用 防骨质疏松作用 调节血脂 降低血中胆固醇 预防和治疗动脉粥样硬化 豆科植物中葛根中含有的黄酮类化合物也都属于异黄酮衍生物 六 花色素又称花色甙元 花色素及其甙是形成花 果 叶颜色的主要成分 广泛存在于植物的花 果实等部位 一般以佯盐的形式存在 分子中存在高度的分子共振 致使有多种互变异构体的形式 3 5 7 三羟基 2 苯基苯并吡喃为基本结构 性质 花色素溶于水 由于花色素分子上吡喃环上氧原子为四价 通常可与酸成盐 由于花色素分子中苯环上带有多个羟基 决定其与醇的结合性高 钾 钠等金属元素也可改变花色素的颜色 尤其是铁元素更为明显 所以在水果和蔬菜加工中不用铁器 而用铝或不锈钢器皿 另外 花色素对光和温度也非常敏感 含花色素的食品在光下或稍高的温度下会很快变成褐色 四 提取和纯化 1 常规提取纯化方法 提取花色素甙一般采用盐酸酸化的甲醇 即将花瓣切碎 在0 1 的盐酸化甲醇中浸泡一夜便可得到红色的提取液 向上述提取液中加入3 5倍乙醚 充分振荡后静置于冰箱中 则花色素甙以糖浆或无结晶状的粗色素沉淀出现 将这种粗色素再次溶于0 1 盐酸化甲醇 在所得到红色溶液中加入乙醚稍加静置则花色素甙成为粉末状沉淀 这种操作过程反复几次则可逐渐提高花色素甙的纯度 分离各种色素 纸层析法和柱层析法均为有效的分离方法 五 花色素及其甙类的定性分析如果提取获得了花色素甙 通常应从以下三个方面对其进行定性分析 花色素 即甙元 的定性 糖的定性 花色素核上糖的结合位置 这些定性可采用纸层析法 薄层层析法 也可采用电泳色谱法 2 7黄酮类化合物的提取分离 一 提取法1 水提法 水提法仅限于提取黄酮苷类物质 在提取过程中要考虑加水量 浸泡时间 煎煮时间及煎煮次数等因素 此工艺成本低 安全 适合工业化大生产 但是用水提取时 提取液中杂质较多 如无机盐 蛋白质 糖等 给进一步分离带来许多麻烦 现在 已经很少单一使用本法 2 碱性水或碱性稀醇提取法 黄酮类化合物大多具有酚羟基 可以用碱性水或碱性稀醇浸出 经酸化后得黄酮类化合物 常用的碱性溶液是稀氢氧化钠和石灰水 氢氧化钙水溶液 根据不同的原料使用不同的碱性溶液 3 有机溶剂提取法 这是国内外使用最广泛的方法 有机溶剂主要用乙醇 甲醇 乙酸乙酯 乙醚等 主要用于提取脂溶性基团占优势的黄酮类化合物 对设备要求简单 产品得率高 但成本较高 杂质含量也较高 三种方法 冷浸法 渗漉法 回流法 有机溶剂提取法中最常使用的溶剂是乙醇 高浓度乙醇适于提取黄酮苷元类物质 低浓度乙醇适于提取黄酮苷类物质 4 微波法 在黄酮类化合物的提取方面取得了良好的效果 具有操作简便 副产物少 产率高及产物易提纯等优点 而且具有反应高效性和强选择性等特点 5 超声波法 从水芹中提取总黄酮类化合物 用超声波提取 黄酮的浸出率可达94 6 而用醇提法黄酮的浸出率仅为73 毕立君等 1999 6 酶解法 对于一些黄酮类物质由于被细胞壁包围而不易提取的原料可以采用酶解法进行提取 例如山楂中加入果胶酶和纤维素酶为主的复合酶液 提取量比目前常用的方法提高了2 3个百分点 提取原理是复合酶充分破坏了以纤维素为主的细胞壁结构及其细胞间相连的果胶物质 将山楂中的果胶完全分解成小分子物质 提取传质阻力减小 使果肉中的黄酮类化合物充分释放出来 7 超临界萃取法 生产银杏黄酮内脂的技术上取得了较大的突破 二 分离纯化方法 分离原理 1 极性不同 利用吸附能力或分配原理进行离2 酸性强弱不同 利用梯度pH萃取方法进行离3 分子大小不同 利用葡聚糖凝胶分子筛进行分离4 分子中某些特殊结构 利用与金属配合能力不同进行分离 常用分离方法 色谱方法 超滤方法等 柱色谱法 包括硅胶柱色谱法 聚酰胺柱色谱法 葡聚糖凝胶 SephadexLH 20 柱色谱法 C18填料柱色谱法 氧化铝柱色谱法等 其中氧化铝柱色谱法极少用 柱色谱法是分离单体的有效方法 根据填料粒度 可采用常压色谱 低压色谱 中压色谱以及高效 高压 液相色谱法 从国内外大量关于黄酮类化合物单体分离的文献来看 70 的研究采用硅胶柱色谱 20 的研究采用聚酰胺柱色谱 约10 的研究采用葡聚糖凝胶 SephadexLH 20 柱色谱和制备型高效 高压 液相色谱 HPLC 法 其中有许多研究同时采用其中几种方法进行分离 取得了满意的效果 而实际工业化生产中大多数采用硅胶柱色谱制备黄酮类单体化合物 大孔吸附树脂制备总黄酮 考虑到黄酮类化合物有多个酚羟基 极性较大 硅胶上也含有羟基 它们之间有较强的氢键作用力 易实现分离 且硅胶价格便宜 1 大孔树脂吸附分离 树脂吸附方法具有下列优点 吸附剂化学稳定性好 选择性好 易于分离极性不同的物质 无溶剂残留效应 分离的产物具有良好的化学纯度 吸附剂易于获取 价格低廉 操作条件温和 不破坏物质的性质 能耗低 操作简单方便 易于工业化 树脂吸附工艺广泛用于黄酮类化合物的提取纯化 将黄酮类化合物的水溶液通过大孔树脂柱 先用水洗 再用不同浓度的乙醇溶液分别洗脱 在某种浓度的乙醇洗脱液中即含有黄酮类 例如将银杏叶提取液通过一种大孔树脂 依次用水 25 乙醇 70 乙醇洗脱 在70 乙醇洗脱液中即含有银杏总黄酮 此法可用于总黄酮的纯化 2 硅胶柱色谱方法 硅胶柱色谱常用硅胶为100 200目 使用前需经过预处理 根据国外资料显示硅胶量与上柱样品量的最佳关系约为每克硅胶吸附30mg干燥样品 柱色谱常用硅胶是一种高活性吸附材料 属非晶态物质 其化学分子式为mSiO2 nH2O 不溶于水和任何溶剂 无毒无味 化学性质稳定 除强碱 氢氟酸外不易与其他物质发生反应 硅胶的化学组分和物理结构决定了它具有许多其他同类材料难以取代的特点 吸附性能高 热稳定性好 化学性质稳定 有较高的机械强度等 硅胶根据其孔径的大小分为大孔硅胶 粗孔硅胶 B型硅胶 细孔硅胶 由于孔隙结构的不同 因此它们的吸附性能各有特点 非极性与极性化合物都能用 范围广 适合分离黄酮类 黄酮醇类 二氢黄酮类 二氢黄醇酮类 异黄酮类和黄酮苷元 溶剂的洗脱能力对于不同的吸附剂来说是不同的 常用溶剂在硅胶上的洗脱能力 石油醚 四氯化碳 苯 氯仿 乙醚 乙酸乙酯 吡啶 丙酮 丙醇 乙醇 甲醇 水 3 离子交换法提取 分离 纯化可一步达到 适用于稀释倍数大的黄酮 可除去黄酮类化合物中的水溶性杂质 先用阴 或阳 离子交换树脂吸附黄酮 然后用水洗涤柱子 把水溶性杂质除去 再用甲醇把黄酮类化合物依次洗脱下来 由己内酰胺聚合而成的尼龙 66及由己二酸与己二胺聚合而成的尼龙 66 最适用于黄酮类化合物的分离 是目前最有效而简便的方法 常用洗脱剂有两类 水 10 一20 乙醇 或甲醇 适于黄酮苷的分离 氯仿 氯仿 甲醇 甲醇适于黄酮苷元的分离 4 聚酰胺柱色谱 具体操作 聚酰胺经80 100目筛去掉小于0 002nm的粒子 加水调成糊状 装1 2柱高 待沉降后 慢慢放掉水 用20 甲醇样品液上样 先用水洗脱 再依次用20 30 40 75 100 甲醇洗脱 每一段洗脱液用可见光或紫外光检查颜色 直到看不到色点 最后用0 3 4 5mol L盐酸洗脱 如果洗脱速度慢 可减压抽 每100mi 床体积 聚酰胺可上样1 5 2 5g 柱恢复 用5 NaOH洗 然后用水洗 再用10 乙酸洗 最后用蒸馏水洗至中性 固定相葡聚糖凝胶为具有许多孔隙的网状结构的固体 有分子筛的性质 分离游离黄酮 主要靠吸附作用 吸附强弱取决于含多少羟基 分离黄酮苷 决定于分子筛属性 洗脱时黄酮苷基本按分子量由大到小流出 5 葡聚糖凝胶柱色谱 用葡聚糖柱色谱分离黄酮实例 40g葡聚糖LH 20装柱 2 5cmX33cm 将166mg芸香苷和75mg槲皮素溶于22mI甲醇中上柱 用甲醇洗脱 4mL min 芸香糖在190 250ml流分中 槲皮素在190 250ml流分中 6 超滤法 以超滤膜两侧的压力差为驱动力 选用不同孔径的膜截流不同分子量物质 来进行超滤分离提取植物中有效成分的一种方法 可以有效的除去提取液中蛋白质 多糖 高分子单宁以及部分原花色素等杂质 用超滤法提取侧柏叶总黄酮时 可以使用一步就有效的除去脂溶性叶绿素和悬浮物微粒 简化了分析操作过程 提高了分析效率 提取效果比其它几种方法好 2 6黄酮类化合物的分析方法 主要有分光光度法 纸色谱法 薄层色谱法 TLC 气相色谱法 GC 高效液相色谱法 HPLC 等 一 分光光度法 1 比色法 利用黄酮类化合物结构上的酚羟基及其还原性进行显色 一般用硝酸铝 亚硝酸钠为显色剂 生成铝螯合物 在分光光度计上测定吸收度计算含量 一 含量测定方法 2 紫外分光光度法 含黄酮类化合物的样品经提取分离后 在紫外分光光度计上测定最大吸收波长处的吸收度 可计算含量 3 双波长分光光度法 单波长吸光光度法 用于植物试样测定时 由于受大量原花色素 叶绿素存在的底液干扰 方法的准确度较低 测定结果偏高 且重现性较差 采用双波长吸光光度法测定植物体内黄酮含量就则可以避免这些问题 采用双波长分光光度法 样品可不经分离 直接测定KR 参比波长 和KS 测定波长 处的吸收度 4 三波长分光光度法 此法可有效地消除了随浓度不同发生的本底漂移 油脂等干扰物质及吸收峰不对称给定量分析造成的影响 方法简便 灵敏 具有良好的准确性和精密度 二 色谱法 1 纸色谱法 纸色谱适合分离检识各种类型的黄酮类化合物 包括苷和苷元 双向纸色谱是检识植物粗提物中黄酮类化合物存在的最好方法之一 2 薄层色谱法 薄层色谱法常用于分离和检出植物粗提物中黄酮类化合物 一般采用吸附薄层 吸附剂大多用硅胶和聚酰胺 硅胶薄层主要用于分离大多数苷元 也可用于分离苷 采用薄层色谱法鉴别黄酮类化合物方法简便 特异性强 重现性好 但定量检测精度不够 3 高效液相色谱 HPLC 法 具有分离效果好 准确性好 分析速度快及仪器自动化程度高等特点 尤其适合于挥发性低 热稳定性差 分子量大及离子型化合物的分析 已广泛用于天然产物的分析 黄酮类物质的HPLC分析常用的色谱柱为反相C18柱 2 7黄酮类化合物的生理功能 一 抗氧化及抗自由基作用 自由基与人的病变 心脏病 糖尿病 肿瘤 类风湿等 生理 衰老 有密切关系 大多数自由基的氧化性很强 在生理和生物化学中 极少量的自由基就可能对人体健康造成很大的损害 黄酮类化合物则能够清除体内自由基 对防止疾病以及人的健康有积极的意义 黄酮是具有酚羟基的一类还原性化合物 在复杂反应体系中 由于其自身被氧化而具有抗氧化作用 其作用机理在于它阻止了自由基在体内产生三个阶段 1 与O2 反应阻断自由基的引发连锁反应 2 与金属离子鳌合阻断自由基生成 3 与脂质过氧基 ROO 反应阻断过氧化过程 二 对心血管系统的作用 黄酮类化合物对心血管疾病的预防和治疗主要是基于对低密度脂蛋白LDL氧化的防止作用 三 抗肿瘤 抗癌作用 四 抗炎 抗过敏 抑菌 抗病毒作用 五 雌激素作用 六 降血