用sephadexG50分离核黄素与丙.ppt

SephadexG50分离核黄与丙球 实验原理 葡聚糖凝胶 外国商品名为Sephadex 它是由葡聚糖Dextran交联而成 葡聚糖是血浆的代用品 由蔗糖发酵而来 发酵得到的葡聚糖相对分子质量差别很大 用乙醇进行部分沉淀后 选择相对分子量为30000 50000的部分 经交联后就得到不溶于水的葡聚糖凝胶 在制备凝胶时添加不同比例的交联剂可得到交联度 交联剂在原料总质量中所占的百分数 不同的凝胶 交联度越大 网状结构越紧密 吸水量越小 吸水后体积膨胀越少 凝胶的型号就是根据吸水量而来 如G25的吸水量 1g干胶所吸水为25mL 型号数字相当于吸水量乘以10葡聚糖凝胶的化学性质比较稳定 不溶于水 弱酸 弱碱和盐溶液 本身具有很弱的酸性 在120 加热30分钟灭菌而不被破坏 但高于120 即便黄 若长时间不用 需加防腐剂 葡聚糖凝胶G50的性质 干粒直径 粗粒100 300中粒50 150细粒20 80极细10 40吸水量 5 0 0 3mL g干凝胶膨胀体积 9 11mL g分离肽或球状蛋白 1500 30000浸泡时间 20 需3h 100 需1h 名词解释 核黄素 维生素B2 又称核黄素 维他命B2 分子式C17H20N4O6 作为维生素B族的成员之一 核黄素水溶性较低 但在碱性溶液中容易溶解 在强酸溶液中稳定 光照及紫外照射引起不可逆的分解 可溶于氯化钠溶液 维生素B2是机体中许多酶系统的重要辅基的组成成分 参与物质和能量代谢 核黄素在机体中有递氢的作用 并是机体中一些重要的氧化还原酶的辅酶 丙种球蛋白 按其来源不同可分为两种 一种是从健康人静脉血中提取制成的人血丙种球蛋白 另一种是从健康人胎盘血中提取制成的人胎盘血丙种球蛋白 二者作用相同 后者价格低于前者 且用量多于前者 但目前已停产 有些人盲目地 错误地认为丙种球蛋白是营养药 是补针 于是不管病情轻重 有病无病地滥用 结果会导致不良反应 实验试剂与器材 葡聚糖G50悬液样品液层析柱 玻璃管 橡皮筋 乳胶管微量进样器 长针头 铁架台 实验步骤 装柱 取直径0 8 1 2cm 长度为25cm的层析柱 在上口绕橡皮筋 出口处装有乳胶管 柱内加蒸馏水2 3mL 排出乳胶管内的气泡 抬高乳胶管防止柱内蒸馏水排空 自顶部缓缓加入经膨胀的葡聚糖G50悬液 待顶部凝胶沉淀2 3cm时将乳胶管放低 仍继续加入上述悬液至凝胶层积至18cm高度即可 操作过程中应防止气泡与分层现象的发生 让凝胶自然下沉 使表面平整 平整胶面 待凝胶柱层稳定后 以洗脱液 蒸馏水 洗柱5分钟 调节流速至4滴 min加样 待蒸馏水流至柱面平时 注意不可使柱面干掉 马上沿层析柱内壁小心加4滴样品于柱床面 注意尽量不使床面搅动 马上加入1 2倍样品体积的蒸馏水 反复两次 可加大量蒸馏水洗脱 这样可使样品稀释最小 洗脱 样品一旦加入后马上用量筒或刻度离心管收集流出液 床柱上不断加蒸馏水 待红色 血红蛋白 流出一半时记录体积 此时血红蛋白Ve也为V0继续收集流出液 待黄色 核黄素 流出一半时记录体积 此时核黄素Ve用蒸馏水反复加在柱床上面 洗柱10分钟 然后将主柱内凝胶回收在凝胶瓶内 实验中注意事项 在收集过程中 要保持流出液的流速稳定