尿素柱层析法分离共轭亚油酸异构体的研究.doc

尿素柱层析法分离共轭亚油酸异构体的研究摘要研究了负载型尿素层析柱分离共轭亚油酸甲酯异构体过程中的影响因素，考察了甲醇残留量，尿素与硅胶的比例，不同温度下结晶的固定相，不同过柱温度，不同流动相及负载溶剂对分离效果的影响，得到最佳条件下分离效果为10反12顺共轭亚油酸含量从原料的40%提高到59%。关键词 尿素柱层析 共轭亚油酸甲酯 异构体前言尿素柱层析法是利用被分离链状分子在尿素负载固定相和流动相之间的分配平衡常数的差异，经过多次分配平衡实现分离目的的，侯相林等1利用尿素柱层析分离制得含量为83%以上的-亚麻酸乙酯，证明尿素柱层析法对不同双键数的链状分子具有较好的分离效果，而发明专利（￥）报道尿素柱层析法可以很好的分离顺式油酸和反式油酸，说明在尿素柱层析分离过程中，反式油酸较顺式油酸更容易保留在固定相中，反式油酸和尿素的结合稳定性更接近饱和脂肪酸。而文献#研究了神经酸和芥酸在尿素柱层析中的分离行为，证明脂肪酸饱和尾链的长短是决定与尿素结合稳定重要因素，而Klare S Markley等发现不饱和脂肪酸与尿素的结合稳定性常数和脂肪酸分子截面影响较大，脂肪酸分子横截面越大包藏越困难，而不饱和双键越多分子截面越大。共轭亚油酸是亚油酸共轭化的产物，亚油酸两个顺式双键中的一个在共轭化过程中会发生位移，同时顺式双键转化为反式双键。共轭亚油酸主要是（顺9，反l1）二烯酸和（l0反，12顺）二烯酸的混合物。这两种异构体所具有的生理功能有很大差异，为了更好的发挥其各自的优异功能，有必要将两种异构体进行分离。目前大都是将亚油酸从其他脂肪酸中纯化的方法，没有针对共轭亚油酸异构体分离的直接方法，已经做的比较好的方法有尿素包合法，该法虽然成本较低，但存在收率低，污染严重等问题；无溶剂尿素包合+超临界CO2萃取技术+冷冻分离方法分离两种异构体，工艺复杂，成本高，产业化困难也有利用假丝酵母脂肪酶两步选择性酯化和分子蒸馏相结合，该方法虽然分离效果很好，但是成本高，收率低，难于产业化。尿素柱层析的优点：常压低温下实现各种脂肪酸的分离，能够比较完整的保留各脂肪酸的功效与生理功能。工艺简单、产品纯度高、操作成本低、甲醇和尿素用量少、易于回收、绿色环保、易于产业化。1 实验材料与方法1.1主要材料与试剂无水甲醇、石油醚、尿素、无水硫酸镁、浓硫酸均为分析纯；柱层析硅胶、共轭亚油酸样品（油酸13.1%、 c9，tl1CLA32%、c12，tl0CLA40.3%、其他CLA14.6%）。1.2设备与仪器层析柱（260）cm；自动控温水浴装置；磁力搅拌器；真空干燥箱；减压蒸馏装置；电子天平：上海恒平；HXSPGC-950气相色谱仪。1.3实验方法1.3.1共轭亚油酸的甲酯化处理在100ml无水甲醇中加入3ml浓硫酸，将20g共轭亚油酸样品加入其中， 50水浴回流5h，减压蒸馏脱除甲醇后，用石油醚和水（1：1，V/V）萃取分液，有机相用蒸馏水洗至中性，无水硫酸镁干燥，过滤，减压蒸馏脱除石油醚，得到共轭亚油酸甲酯。1.3.2柱层析固定相的制备称取一定量尿素和甲醇并在60下完全溶解，加入一定量的柱层析用硅胶，在此温度下搅拌10min，冷却至室温后，将下层硅胶翻动与上层尿素晶体混合，放入冰箱上层。取出后抽滤去除甲醇，并置于真空烘箱中烘干。1.3.3固定相中溶剂残留量的检测精确移取2mL蒸馏水于八个试管中（容量瓶），分别加入3L、5L、10L、25L、50L、75L、100L、125L无水甲醇，在柱温100，汽化室和检测室150的色谱条件下（检测器），进样量3L、，得到甲醇体积与峰面积的线性关系曲线：y=0.9532x，线性度R2=0.9972。 准确称取0.5g固定相，加入2Ml蒸馏水，充分摇动，过滤，滤液景象气相色谱分析，进样量3L。以经过换算得到的线性曲线w%=0.1906A作为溶剂残留量大小的比较依据。 其中：w为固定相中甲醇的质量分数，A为色谱图中甲醇峰面积。1.3.4装柱 称取60g柱层析固定相放入石油醚中浸泡、搅动除去其中的气泡；带气泡驱除完全，湿法装入层析玻璃管柱中，制备成负载型尿素层析柱。1.3.5尿素柱层析分离共轭亚油酸甲酯 取一定量的共轭亚油酸甲酯，加入到层析柱上层，以石油醚为洗脱剂洗脱，每10mL收集一个洗脱份，对洗脱份进行色谱分析，确定共轭亚油酸各异构体含量。1.3.6共轭亚油酸异构体的检测 初温200，汽化室和检测室温度为230，TL9900色谱工作站，氢火焰检测器，峰面积归一化法计算共轭亚油酸甲酯的相对含量。检测方法？2结果与讨论2.1共轭亚油酸甲酯原料的组成甲酯化后的共轭亚油酸样品进行气相色谱分析，得到共轭亚油酸样品组成如图1， A1为油酸15.46%，A2为c9，t11共轭亚油酸31.37%，A3为t10，c12共轭亚油酸41.3%，A4与A5均为全反式共轭亚油酸异构体，含量分别为5.52%和6.35%。2.2溶剂残留量对分离效果的影响2.2.1甲醇残留量对分离效果的影响34号 22号 16号 23号 18号 15号图2 甲醇残留量不同对洗脱过程的影响（图中依次是由甲残量最少到最多的变化，其中16号为最好分离效果）由图中可以看到，甲醇的影响很大，随着洗脱的进行，甲醇残留量逐渐降低，初期被包合的共轭亚油酸其他异构体，油酸，以及c9，t11CLA都会被洗脱下来。而且洗脱进行到约20号洗脱份时，c9，t11CLA和t10，c12CLA两异构体含量曲线渐渐接近，洗脱到最后，二者可能会交叉。固定相中残留的甲醇可能的作用一是提供尿素与脂肪酸发生包合的微环境，使分子间有更多的碰撞，实现四棱柱向其他构型的转变，另一方面是维持所形成包合物新构型的稳定性。（丁明玉 现代纯化与分离技术）洗脱初期由于体系中甲醇残留量较高，有包合的微环境，使得三者有机会与尿素接触，进入尿素孔道，形成包合物。随着洗脱的进行，甲醇残留量逐渐降低，过少的甲醇残留量不能维持包合物的稳定性，不断加入的流动相会冲击破坏包合物，因而三者被洗脱。固相中残留甲醇也有可能是起到一种助晶剂的作用，即当尿素晶体中存在少量甲醇时，使得尿素四方晶体呈现缺损状态，这种不完整的晶体具有较高的表面能，极易与链状的饱和脂肪酸形成六方晶体，弯曲状的多不饱和脂肪段不易与之形成晶体。（Dom art C，M iyauehi D T，Sumerwed W NrIhe fraetionation of marine oil fatty acids with ureaJ.J.A m.Oil Chem.Soc.,1995.72(6)：481 483）2.2.2甲醇残留量对样品中各组分分离效果的影响图3甲醇残留量对CLA各组分含量变化的影响尿素柱层析主要存在两种作用原理，一种是空间阻碍作用，一种是尿素包合作用，对于，c9，t11来讲，其顺式双键在9位，同油酸结构一样，碳链在9位发生弯曲，从发生弯曲到碳链末端共有9个碳原子可以被尿素包合，且在层析柱中，二者受到的空间阻碍作用及被尿素包合的机会一样，而t10，c12CLA发生弯曲的位置在12位，从发生弯曲到碳链末端仅有6个碳原子，不易被包合，受到的主要是空间位阻的作用。当甲醇残留量较低时，体系中以空间位阻作用为主，尿素包合作用不显著，油酸及c9，t11CLA 由于弯曲度小，空间位阻小，更容易被洗脱下来，所以含量较高。而当甲醇残留量较高时，由于尿包对CLA的其他异构体的包合更有利，会占据大部分有效的尿素孔道，所以导致对油酸和c9，t11CLA的包合效果相对降低，容易被洗脱下来，使得二者含量相对较高。2.3不同尿素硅胶比例图4不同尿素硅胶质量比对分离效果的影响图中，a（1：1）b（3：2）c（2：1）d（纯尿素）由图1可以看到，尿素含量不是越多越好，纯尿素的效果较差，1：1时效果最好 。加入硅胶作为载体，增大了比表面积，使得脂肪酸与尿素有更多的接触机会。2.4不同结晶温度对分离效果的影响图5 不同结晶温度对分离效果的影响在冰箱上层和冬天室温下所结晶体作为固定相的效果要比下层好，两异构体含量差距较大，可能由于结晶条件比较温和，所结晶体均匀。2.5过柱温度对分离效果的影响图6 不同过柱温度对分离效果的影响图中a（0）b（室温）c（30）低柱温时分离效果好于高柱温，可能是由于高柱温时柱壁的石油醚挥发严重，产生大量气泡，导致柱效降低。另外过柱温度应同结晶温度保持一致，突然升温可能会使所结晶体构型遭到破坏。2.6洗脱溶剂不同图7不同洗脱溶剂对分离效果的影响与用石油醚洗脱相比较，乙酸乙酯虽然有一定的效果，但是油酸包合的并不牢固，很快就会被洗脱。用石油醚与甲醇的混合液洗脱并没有起到很好的效果，可能是洗脱过程中加入的甲醇不会进入尿素与结晶时的甲醇形成的微环境中，所以后续加入的甲醇并不会对包合起到作用。2.7负载溶剂不同图8 不同负载溶剂对分离效果的影响与无水甲醇相比，用无水乙醇做负载溶剂也有效果，但是由于溶解等量的尿素所需的温度较高，故而不易采用。综上，当甲醇残留量在最适范围内时，尿素硅胶比例为1：1，以无水甲醇为负载溶剂，固定相结晶温度约为0到8，用石油醚做流动相，控制层析柱温度为0到8，上样量为1ml，流速为0.7到1.2ml/min洗脱，将洗脱样通过GC分析得到t10，c12CLA的浓度为59%。2.8尿素包合的效果想要很好的分离两种主要异构体首先要将油酸及CLA 的其他异构体除去。所以采用尿素包合之后的原料进行柱层析。由于尿包后回收率很低，所以首先经过多次尿素包合尝试。但是经过尿素二次包合后发现油酸及CLA 的其他异构体含量确实下降很多，但c9，t11含量却增大了。2.9截取固定相的问题（37）固114.17517.471619.004521.427427.9215固210.417318.375920.672940.89299.6409固37.504410.703911.198465.0965.4974固412.194223.69330.026122.749311.3374对已过柱的固定相分四段截取下来，发现尿素对CLA的其他异构体包合作用最显著，其次是油酸，c9，t11CLA。t10，c12CLA也有一定量的截留，可能是由于空间位阻作用使得t10，c12CLA有所截留。2.10柱子二次利用问题（35）将已经利用过一次的柱子，用石油醚和甲醇的混合液淋洗几次，二次上样，再次利用固定相分离，考察效果。 图柱子二次利用时的分离效果柱子二次利用时，对油酸及CLA 的其他两种异构体的包合效果并不好，说明后续加入的甲醇并不会对尿素包合脂肪酸的微环境产生影响，而第一次过柱后固定相中残留的甲醇量已随流动相洗脱完全。 关于分离存在极限的解释Bengen.F., T echnical Oil Mission Reel 6,frames 263 270 (in German) Reel143,frame 135 139(in E nglish ) 得出脂肪酸与尿素形成包合物的两个基本条件：（1）碳链必须大于四个碳原子（2）碳链必须是直链。C9，t11可被包合的碳链是9个，而t10，c12 可被包合的碳链是6个，二者均可被包合，只是c9，t11更易包合而已。若仅从其难易度上似乎二者可以分离，但是文献Klare S Markley. Fatty acids- Therechemistry,properties,production and uses,2nd EditionM.Interscience Publishers,1965,Part3:2315- 2325.中又指出不饱和脂肪酸受双键影响