用大孔树脂分离和定量三七中二重组皂苷和三重组皂苷.doc

用大孔树脂分离和定量三七中二重组皂苷和三重组皂苷摘要 2 二重组皂苷PDS和三重组皂苷PTS是三七中最主要的两组成分，并具有多种药理活性。在本文的研究中，开发了一种简单的方法用大孔树脂分离三七中二重组皂苷和三重组苷。这里考察了四种分离二重组皂苷和三重组皂苷的树脂，包括D-101, DA-201, DM-301 and DS-401，在这其中，DS-401具有最好的分离效果。 3 PDS和PTS的DS-401树脂平衡吸附的数据是在25被吸附出来的。用最佳的参数值来完成DS-401树脂的动态吸附和解吸附实验。由于树脂不同的吸附力，PTS and PDS 能够被充分的分离，分别用30% and 80% 的乙醇溶液。根据最佳的吸附条件，从三七中对PTS and PDS进行大规模制备。在这个之后，他测了这个含量，PLE是一种高压液相测取方法，由PLE粗提22.5% and 16.4% 的PTS and PDS，纯化后增加到88.2% and 92.6% ，回收率达到80.2% and 82.3%。 前言4 三七又名田七，是一种非常常用的中药，他主要用于治疗咯血和血肿在中国400年的医药历史上。现在的医药药理学表明，三七及其主要的药理成分具有抗癌和保肝作用，同时具有保护心脑血管系统的作用。达玛烷型皂苷被认为是三七中主要的活性成分。 5 根据不同的苷元，他的皂苷分为2类：PTS and PDS。然而，研究发现人参皂苷的活性和他的结构有关，因此，从分离出不同的皂苷对未来药理学的研究室很有价值的。目前，已经有一些方法来分离这两种皂苷PTS and PDS，例如液液萃取，硅胶柱色谱，透析，氢氧化钠沉淀法等等，但是以上这些方法都有耗时长，工作强度大以及效率低的缺点，6 大孔树脂是一种很耐用亲水聚合物，具有很高的吸附性能来吸附分子，成本低，容易重复利用。他的纯化原理是根据不同的分子量，极性，不同分子结构。这些不同的特点导致他们有不同的吸附性。在近年的研究中，大孔树脂被广泛的用于中草药生物活性分离和纯化。在这篇文章中，运用了大孔树脂中的4中方法对三七中的PTS and PDS吸附和解吸附，包括7 D-101, DA-201, DM-301 and DS-401，开发了一种有效的方法用，适当的树脂分离和纯化这两种皂苷。在三七中有12种最重要的皂苷，三七皂苷R1,人参皂苷 Rg1, Re, Rf, Rb1, Rg2, Rc, Rb2, Rb3, Rd, Rg3 and 三七皂苷 K ，这些皂苷是对三七进行质量评价的标准。8 实验部分样品和试剂三七药材是来自于中国云南省的文山地区，三七皂苷R1是来自于中国食品检验所人参皂苷标品来自于美国加州的一个实验室三七皂苷K自制的从三七中获得，纯度98%。9 吸附剂大孔树脂的测验，包括D-101, DA-201, DM-301 and DS-401, 是来自于天津的这个公司。测得树脂都是交叉聚苯乙烯聚合物。他们的物理和化学性质在表一。公式 表面积 孔径 粒径 极性（非，极，中级，弱极性） 含水量（解释） 树脂的含水量的测定:分别取四种树脂称重并放在玻璃容器，在烘箱内以105干燥，直到重量不再变化为止。各种树脂的含水量见表一。10用高相液相色谱法制备粗提物高效液相色谱简写PLE，他是用了这么一个仪器系统，这个实验室摸索了一个最佳方法，取三七的干燥粉末，放置在6个33毫升的不锈钢容器内。最佳条件就是他的粒径（三七药材的粉碎程度）0.30.45毫米 ，溶剂是甲醇，温度150，静止时间15分，压力6.895103 兆帕，提取三次，ple提取液进行合并浓缩干燥，减压旋转蒸发仪60，干燥旋转完的残渣溶于600毫升水中，溶液储存于4摄氏度。11液相分析选用这个仪器，配备了一个真空除气器，四级步进泵和自动进样器。这个是他的溶柱，柱长，内径，粒径，柱温是40度，流动相是水和乙腈，梯度洗脱的三个程序030 min, 1819% B; 3040 min, 1931% B; 4060 min,3156% B. 流速是1.5 ml/min。，波长设定为203 纳米 ，进样量10微升。12 静态吸附和解吸附的实验过程取一定数量的树脂，相当于干重的0.5克，置于玻璃瓶内加盖，加入15毫升的提取物(PLE)，密封震荡在25度下用水浴蒸嗱器征纳12小时，吸附后的上清液用液相分析，到达吸附平衡以后，将残留的溶液提去，倒掉，树脂用15毫升的蒸馏水进行冲洗4次，然后用15毫升80%乙醇解吸附。13 这个瓶子在25度下进行12小时震荡，解吸附溶液进行液相分析。树脂的初始选择是根据他的吸附能力，树脂吸附和解吸附的比值。，不同浓度的水提物15毫升，做PTS and PDS的等温线选择D-101 and DS-401这两种树脂。14动态吸附和解吸附的实验过程动态吸附和解吸附的实验条件是在一个玻璃柱中湿法桩柱选择DS-401树脂4g(干重)。他的柱体积是19.2毫升，在穿透体积实验中，样品流过柱子的流速是1 ml/min，在洗脱液中PTS and PDS这两种皂苷的浓度用液相进行监控。 对于解吸附实验呢，是在吸附平衡以后，解吸附剂的条件是用不同梯度进行冲洗，水，15 30% and 80% 的乙醇，流速是1 ml/min.洗脱液中的PTS and PDS用液相色谱检验。16 带有紫外检测器的液相色谱在我们之前的研究工作中，已经开发出了三七的定量检验方法，就是用紫外液相色谱法和蒸发光散射色谱法，他们都具有很好的精度，回收率和精密度，在这片文章中，使用紫外液相色谱法，分析的时间为60分，在图2可以看到混合表样的色谱图和PLE高压液相萃取提取物的色谱图。17 根据前面用液相色谱完成的这五种主要皂苷的线性，回归和线性范围考察。见表2。根据这个方法的确立，在PLE的提取中PTS and PDS的纯度分别达到22.5% and 16.4%,（图：保留时间 线性方程 回归方程相关系数 线性范围）18 不同树脂的吸附能力 不同树脂的吸附和解吸附能力的计算用以下几个公式：吸附能力=（初始浓度-平衡后浓度）*初始上样体积/树脂重量吸附率=（初始浓度-平衡后浓度）/初始浓度*100%洗脱率=洗脱液浓度*洗脱液体积/（初始浓度-平衡后浓度*初始上样体积）*100%19 在表3中可以看到，这是通过刚才的公式计算结果（吸附能力，吸附率，洗脱率），我们可以看出DS-401D-101 DM-301 DA-201.因此DS-401 and D-101 被选作分离PTS and PDS的研究20 吸附等温线平衡吸附等温线是考察在25不同溶液浓度。母液浓缩去水，在减压的旋转蒸发仪中，然后稀释成不同浓度的溶液。三重组皂苷的初始浓度是7.93, 6.77, 5.43, 4.03 and 2.68 mg/ml，二重组皂苷的初始浓度5.42, 4.87, 3.78, 2.42 and 1.65 mg/ml。PTS and PDS吸附等温线树脂DS-401 and D-101见图3。当PTS初始浓度是5.43 mg/ml,对应PDS 初始浓度是 3.78 mg/ml.的时候，吸附到达饱和状态。21 DS-401的吸附动力学考察图4是用 DS-401树脂考察PTS and PDS 的吸附动力学曲线。吸附能力随着吸附的时间增加而增加，到达100分钟时达到平衡。PTS and PDS的吸附能力在初始20分钟极具增加，这表明DS-401树脂具有对PTS and PDS 有很好的吸附性。因此，在接下来的研究中吸附的时间必须大于20分钟。24 乙醇的最佳浓度 用适当的乙醇浓度来提取PTS and PDS，从浓度的20%到80%，在吸附平衡后进行解吸附实验，见图5。（横坐标为乙醇浓度，纵坐标为解吸附率）。随着乙醇浓度的增加，用DS-401树脂对PTS and PDS解吸附率明显增加。乙醇浓度达到20%时，PDS 是很难被洗脱的，而PTS的解吸附率对比其他浓度，这时是最低的。当乙醇浓度超过30%时，PDS的解吸附率显著增加，乙醇浓度80%达到峰值。所以，对于PTS and PDS来说，30% 到80% 乙醇浓度是最适当的解吸附溶液。26 穿透体积 穿透体积在固相萃取中是非常重要的，因为他代表取样容积，在上样的过程中不会被损失。穿透点是露出液浓度达到注入液浓度的1%。图6 DS-401树脂PTS and PDS穿透体积是80毫升，相当于4个柱体积（前面说到一个柱体积19.2）27 DS-401树脂的动态吸附曲线为了获得更好的分离结果，取30%的剩余树脂进行吸附和解吸附研究。根据以上的突破体积数据，用干重4.0 g DS-401 树脂填充到56ml样品中，在吸附平衡以后，树脂用60ml的蒸馏水冲洗，目的是为了洗去高极性的三七皂苷成分，例如糖类和氨基酸。然后，用160 ml of 30% 乙醇和80 ml of 80% 乙醇冲洗吸附。图7（横坐标体积，纵坐标浓度） A 蒸馏水，冲洗时什么都没有，B 30% 乙醇冲洗，这个区间三重组皂苷就出来了，二重组皂苷几乎没有，但在100毫升时，有二重组皂苷的解吸附增加，因此用30%乙醇冲洗到100毫升时停止接收，但是继续冲洗到160毫升，这部分的就倒去不要了。到160毫升时用C 80%的乙醇冲洗，就得到了二重组皂苷。29图8显示了PTS and PDS 的色谱图， 我们可以看到这两种皂苷用DS-401 树脂被完全分离了。通过DS-401 树脂的处理以后，这个PTS and PDS的含量从PLE提取的22.5% and 16.4% 达到87.3% and 90.4% 。30 用适当的条件用一个玻璃柱从三七中大规模制备二重组和三重组皂苷，根据色谱图原理，柱体积，床柱体积，洗脱液体积以及上样和流速设为原来的20倍。最佳的条件6.71 g of PTS and 5.04 g of PDS 从PLE提取他们含量的22.5% and 16.4%达到88.2% and 92.6% ，这个量相当于从180克的三七中提取。这两种皂苷的回收率是80.2% and 82.3%。31 总结在本文的研究中，用大孔树脂柱从三七中成功提取分离PTS and PDS ，并提供了一个最有效的方法。这里从四种树脂中检测DS-401低极性树脂分离效果最好。在平衡吸