多氯联苯对非洲爪蟾变态发育的影响研究.doc

多氯联苯对非洲爪蟾变态发育的影响研究周景明1，秦占芬2，徐晓白2 (1.郑州大学生物工程系，河南郑州 450001；2.中国科学院生态环境研究中心，北京 100085) 摘要：将非洲爪蟾蝌蚪从发育的第52期开始暴露在不同浓度(0、10、25、50、100 g/L)的多氯联苯(Aroclor1254)中，直到变态结束，研究其对非洲爪蟾变态发育的影响。结果表明，在变态高峰期前，对照组和试验组的存活率无显著的差别，而在变态高峰期，浓度高于10 g/L的试验组蝌蚪大量死亡，各组存活率分别为25 g/L组72.9%,50 g/L组53.1%,100 g/L组12.3%；各浓度组蝌蚪在变态结束时的体重无显著差异(P0.05)；50 g/L组和100 g/L组蝌蚪变态高峰期所需的时间与对照组相比差异显著(P0.05)；25 g/L以上浓度组，蝌蚪甲状腺组织表现不同程度的滤泡扩张，滤泡上皮细胞增生、叠加，滤泡数目增多等。提示多氯联苯可干扰非洲爪蟾的变态发育，两栖类变态试验可以作为筛选甲状腺激素干扰物的一种简便可行的方法。 关键词：多氯联苯；非洲爪蟾；变态；内分泌干扰物；甲状腺激素干扰物 多氯联苯 (polychlorinated biphenyls，PCBs)是一类在联苯环上有不同氯原子取代的芳香族化合物的总称。由于PCBs的稳定的理化性质，曾被广泛用作工业电器设备的绝缘油，也用作热交换油、真空泵油、除尘剂、无碳复写纸和增塑剂等1。PCBs作为一种普遍存在的环境持久性有机污染物，具有广泛的内分泌干扰作用，既可干扰雌激素，又可干扰甲状腺激素的功能23。文献报道PCBs对甲状腺素的干扰作用比其对雌激素的干扰作用要强的多，几乎所有的PCBs混合物和同类物都可干扰甲状腺激素的自身稳态4，故PCBs是一种重要的甲状腺素干扰物。但大部分报道都来自实验动物(大鼠、小鼠、狨猴等)单剂量短期暴露PCBs同类物或混合物的结果3。近20年来，世界范围内两栖动物的种类和种群数目减少而畸形青蛙大量增加，包括PCBs在内的工农业化学污染物被怀疑为可疑的原因之一5，但有关PCBs对两栖动物影响的研究少有报道69。 两栖动物生活周期比较复杂，幼体生长速度快，在食物链中具有水陆两栖的独特地位，卵、鳃和皮肤具有渗透性，能对污染物富积和放大，从而成为环境污染的前哨物种。非洲爪蟾作为重要的模式生物，近年来在环境毒理学中得到越来越多的应用，其变态发育大体可以分为3个时期，即变态早期(premetamorphosis)包括第1期至第53期，变态前期(prometamorphosis)包括第54期至第57期，变态的高峰期(metamorphic climax)包括第58期至第66期。本试验采纳了美国内分泌干扰物筛选与检测顾问委员会(EDSTAC)对于两栖动物变态试验修订草案的建议，将爪蟾蝌蚪从第52期开始暴露不同浓度的多氯联苯(Aroclor1254)到变态结束，研究对非洲爪蟾变态发育的影响，同时也为非洲爪蟾在筛选和确证甲状腺素干扰物中的应用探索一些可行的检测终点。 1材料与方法 1.1实验动物 成年非洲爪蟾，雌雄各半，购自中国科学院发育与遗传研究所。 1.2主要仪器与试剂 体视显微镜、生物显微镜和Aroclor1254购自美国Supelco公司，绒毛膜促性腺激素(hCG)购自上海第一生化药业有限公司。 1.3诱导排卵 在室温20 左右时，晚上给雌、雄爪蟾腹腔内分别注射hCG(雄蛙500 IU，雌蛙1 000 IU)。注射后置于盛有FETAX溶液的桶中(FETAX溶液的配制参见文献10，距桶底15 cm处放置一个孔径合适的网筛，约2 h后雌雄合抱，次日早晨开始产卵。排卵结束后，自然孵化，4 d后投喂刚孵出的卤虫，每3 d换水1次。 1.4试验分组 随机挑选发育到第52期的正常蝌蚪(日龄大约为21 d，此期蝌蚪前肢芽呈不规则圆锥形，后肢芽开始出现髁部缢痕及平行足)进行暴露试验，试验共分为5组，分别为对照组、10 g/L组、25 g /L组、50 g/L组和100 g/L组，每组30只蝌蚪，放入盛有18 L自来水的玻璃缸中，自来水经沙炭滤柱过滤、充分曝气。每组设3个重复。 1.5方法 每3 d换水1次，每次换水后各浓度组加入相应剂量的Aroclor1254母液，以无水乙醇作为溶剂，溶剂的含量不超过1/10 000(V/V)，混合均匀，对照组加入相应剂量的溶剂。每天观察蝌蚪的生长发育情况，移去死亡的蝌蚪并记录。每天记录达到变态高峰期，即前腿展开(第58期)的蝌蚪数，一旦变态完成即从缸中取出，拭去水分，称重，测其体长。 1.6甲状腺组织学观察 将刚完成变态的非洲爪蟾轻微麻醉后，针刺枕骨大孔致死，从腹中线剖开腹腔，用Bouines液固定24 h，然后转入700 mL/L的乙醇溶液中保存。用大头针固定在解剖盘中，放在体视显微镜下仔细地在舌骨嵴两侧找出甲状腺，连同邻近的肌肉一起取下，梯度乙醇脱水，石蜡包埋，HE染色。 1.4统计分析 所有数据用SPSS(10.0)统计软件进行单因素方差分析(oneway ANOVA)。 2结果 2.1从第52期开始暴露于Aroclor1254对爪蟾存活率的影响 从第52期开始暴露于Aroclor1254对非洲爪蟾蝌蚪在变态高峰期前(第58期)和变态结束时(第66期)存活率的影响如图1所示。在变态高峰期，即前腿展开以前，对照组和试验组的存活率无显著的差别，都在85%以上，而在变态高峰期，即第58期第66期，浓度高于10 g/L的试验组蝌蚪大量死亡，存活在25 g/L组为72.9%,50 g/L组为53.1%，100 g/L组为12.3%，与对照组(90%)相比差异显著(P0.05)。 注：*表示P0.05。Note：* means P0.05)，而100 g/L组则显著大于其余各组(P0.05，图3)。 图2从第52期开始暴露于Aroclor1254，爪蟾变态结束时体重的变化 Fig.2Body weight of Xenopus laevis tadpole at stage 66 after exposed to Aroclor1254 from stage 52 注：*表示P0.05。 Note：*Means P0.05)，分别为14.77 d和14.85 d，对照组为13.27 d，而50 g/L组、100 g/L组与对照组相比差异显著(P0.05)，分别为18.75 d和20.14 d。 注：*表示P0.05。 Note：* Means P0.05. 图4从第52期开始暴露于Aroclor1254对爪蟾变态高峰期所需时间的影响 Fig.4Time needed of metamorphic climax(from stage 58 to stage 66) of Xenopus laevis tadpole after exposed to Aroclor1254 2.5从第52期开始暴露于A1254对非洲爪蟾甲状腺组织病理学的影响 从第52期开始暴露于A1254到变态结束时为止，非洲爪蟾第66期时的甲状腺组织病理学变化见图5。由图5可以看出，对照组蝌蚪甲状腺滤泡细胞呈单层排列，滤泡不扩张；10 g/L组与对照组相比无明显的组织学改变；25 g/L组部分滤泡扩张，滤泡上皮细胞增生、叠加，滤泡数目增多；50 g/L组甲状腺滤泡明显扩张，数目增多，大部分滤泡上皮增生呈叠加状排列，与滤泡上皮接触的胶体出现大量明显的空泡；100 g/L组滤泡极度扩张，数目增多，滤泡上皮细胞呈叠加状排列。 A，B.对照组；C.10 g/L组；D.25 g/L组；E.50 g/L组；F.100 g A/L组 A，B.Control group；C.10 g/L group；D.25 g/L group；E.50 g/L group；F.100 g/L group 图5非洲爪蟾蝌蚪从第52期暴露于Aroclor1254后甲状腺组织切片(HE) Fig.5Histological changes of thyroid gland of Xenopus laevis exposed to Aroclor 1254 stained by HE 3讨论 3.1暴露于Aroclor1254对非洲爪蟾存活率的影响 PCBs具有极强的生物富集能力，虽没有测定Aroclor1254在爪蟾蝌蚪体内的实际富集水平，据文献报道，在爪蟾体内应富集了较高浓度的Aroclor12547。在变态高峰期时蝌蚪尾部降解，脂溶性化合物被释放到血液，发挥毒性作用67。另一方面，TH能增强卤代化合物的毒性9，在变态高峰期甲状腺素的水平达到最高峰，因此在此期蝌蚪对卤代化合物的敏感性也增加了。在本试验中，变态以前各组蝌蚪的存活率无显著差别，而在变态完成时，除10 g/L组外，各组的存活率差异显著。可见对于两栖类动物来说，污染物的富集毒性可能会在变态高峰期时表现出来，增加敏感性，从这一意义上来说，两栖类动物适于进行持久性有机污染物的生态毒理学评价。 3.2暴露于Aroclor1254对非洲爪蟾生长发育影响 蝌蚪的生长发育与很多因素有关，组内死亡率的增加相当于降低了该群体的密度，从而可能使其增加体重1011，同时，TH水平的降低会增加变态发育的时间，使其生长发育期延长，从而体重增加12。100 g/L组的蝌蚪在暴露20 d后，进食量明显减少，生长速度减慢，但另一方面，100 g/L组的蝌蚪在变态高峰期大量死亡，降低了密度，该组蝌蚪到达变态高峰期所需的时间以及变态高峰期所需的时间明显增加了，意味着生长发育期延长，从而弥补了因进食量减少而造成的生长缓慢。故各组之间蝌蚪体重变化不明显。 3.3暴露于Aroclor1254对非洲爪蟾变态发育的影响 两栖类动物的变态直接受甲状腺激素的控制，外源性的TH可以诱导蝌蚪提前变态，而除去甲状腺的蝌蚪或化学抑制物处理的蝌蚪则部分抑制或完全抑制其变态发育，变态发育期延长或生长为巨型蝌蚪13。Fort D J等1417将非洲爪蟾的变态发育作为筛选甲状腺激素干扰物的一种方法，认为是一种有效的筛选手段。PCBs是一种已知的甲状腺激素干扰物，可以直接干扰TH的生成，TH代谢酶类的诱导，与转甲状腺蛋白的竞争性结合，以及干扰下丘脑垂体甲状腺轴的反馈调节等途径来干扰TH的作用23,1819。在本试验中，非洲爪蟾蝌蚪从第52期开始暴露于Aroclor1254,100 g/L组抑制了爪蟾到达变态高峰期所需的时间，而50 g/L以上浓度延长了变态高峰期所需的时间，可见PCBs可以干扰非洲爪蟾的变态发育过程。虽然这些浓度远高于环境中PCBs的浓度，但在污染地区，经过食物链逐级富集后有可能达到抑制其变态的浓度，从而可能影响两栖类动物的生存和繁殖。两栖类变态试验可以作为筛选甲状腺激素干扰物的一种简便可行的方法。 3.4暴露于Aroclor1254对非洲爪蟾甲状腺组织结构的影响 有关PCBs暴露引起的甲状腺组织学变化的报道较多，如大鼠在怀孕期暴露PCB118后仔鼠甲状腺滤泡细胞空泡化，细胞高度增加，胶体面积减少，提示持续性的TSH的刺激作用20，而关于两栖类暴露于PCBs后引起的甲状腺组织病理学的研究还未见报道。 本试验中，非洲