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浅谈结核分枝杆菌的快速诊断著者：于小跃 于海龙 王玉邦 田皓 李云指导教师：罗红摘要：结核是一种常见的传染病，一直是威胁人类生命健康的传染病的主要杀手之一。目前，虽然常规细菌学检查依然是临床诊断的金标准，但由于分枝杆菌生长缓慢，其分离，鉴定和药敏实验通常要几周或更长时间，因此其快速断具有十分重要的临床应用价值，分子生物学技术是目前临床应用的重要的快速检验方法。此外，还有新兴的噬菌体裂解技术。本文将主要介绍这两种方法。关键词：结核杆菌，分子生物学技术，核酸探针法，PCR，PCR-SSCP，基因芯片技术，噬菌体裂解技术1882年，德国细菌学家Kohn发现结核分枝杆菌(MTB)为结核病的致病菌。至此，人类从未停止过对结核分枝杆菌以及抗结核药物的研究。近年来，结核病在全球范围内又死灰复燃，成为传染病的首位杀手。由于人口剧增，移民增加，吸毒酗酒与贫困等原因以及细菌本身耐药性的产生，结核病日益严重，发病率呈回升趋势。全世界已有1/3约20亿人感染了结核分枝杆菌。每年有900万新结核病人，约300万人死于结核病1。因此，早期快速诊断MTB感染，为临床积极治疗提供依据，更显得极为重要。结核病的快速准确诊断是控制结核病的重要措施。一、结核分枝杆菌实验室诊断概况结核分枝杆菌是一种细长略弯曲的杆菌，分枝状排列，一般的染色方法不易着色，常用Ziehl-Neelsen抗酸染色方法，故又称抗酸杆菌2。该菌为专性需氧菌，营养要求较高，生长缓慢，繁殖一代需18小时，在固定培养基上25周才出现肉眼可见的菌落3。因此在临床上很容易贻误病情，不利于早期治疗，所以对结核分枝杆菌的快速诊断也迫在眉睫！目前对结核分枝杆菌的诊断方法大致可以分为四类。第一类为常规的细菌学检验方法，如涂片染色法、细菌培养法等。虽然仍作为检验MTB的金标准，但该方法缺乏特异性、耗时长（一般需要一周左右的时间），且假阴性率高，只能结合临床表现和X线检查。故而对早期快速诊断MTB并不适用。第二类为免疫学方法，依靠检测MTB特异性抗原进行诊断。乐军等4提出了用ELISPOT检测MTB特异抗原T淋巴细胞的频率，该方法特异度为95.5%。Lyshchenkok等5通过检测MTB重组抗原来提高MTB的敏感性，即鸡尾酒式MTB特异性复合抗原。第三类是利用分子生物学方法进行快速诊断，该方法耗时短（只需12天）且特异性和敏感性较高，是目前临床上的理想诊断方法。第四类是目前仍在探索和研究中的分枝杆菌噬菌体裂解法应用于MTB的临床诊断。本文将重点介绍分子生物学方法和噬菌体裂解法应用于临床中对MTB的快速诊断。二、结核分枝杆菌的实验室快速诊断技术(一) 分子生物学技术1.核酸探针法核酸探针是指带有放射性和非放射性核酸标记物的已知序列的DNA或RNA片段。核酸探针法的基本原理是利用已知的核酸探针检测MTB核酸样品中特定的基因序列，如有顺序完全互补的核苷酸序列，则通过核苷酸间碱基互补的原理互相结合，形成杂交体，再通过显色或显影的方法将MTB的核苷酸顺序的位置或大小显示出来。近年来，已将核酸探针应用于对细菌、病毒等的临床诊断中。张灵霞等6报道通过利用DNA探针、辣根过氧化物酶发光来检测痰、脑脊液等结核标本，有较高的敏感性。2.基因芯片技术基因芯片又称DNA芯片或蛋白质芯片，系指将大量（通常每平方厘米点阵密度高于400）序列已知的寡聚核苷酸探针分子固定于支持物（如玻璃板，硝酸纤维素膜等）上，与待检标本中标记的DNA或RNA进行分子杂交，通过检测每个探针分子的杂交信号强度，进而获取样品分子的数量和序列信息7。张俊仙等8以DNA直接测序法为对照，用DNA微阵列技术分析28种分枝杆菌标准菌株和9种非分枝杆菌菌株。结果显示，DNA微阵列技术的特异性为100%，并可以同时鉴别出其种属。因此，DNA微列阵技术可简便，快速，灵敏且特异性好地将大多数分枝杆菌鉴定到种属，为临床治疗提供快速、准确的诊断。 3.PCR及其衍生技术PCR是一种体外核酸扩增系统，根据DNA分子天然复制的过程，通过高温变性、低温退火、适温延伸过程，经过若干循环，将特异的DNA片段进行扩增，从而进行临床检测。PCR的方法敏感性优于常规方法，但在扩增过程中不可避免地会出现污染，如用电泳法鉴别产物，引起产物的交叉感染；非特异性扩增；结果不准确出现较高的假阴性和假阳性率等等。因此，产生了PCR的衍生方法逆转录PCR逆转录PCR即以RNA为模板，先将RNA逆转录为cDNA，再进行PCR检测。mRNA与DNA及rRNA不同，在于其易被破坏，典型的半衰期只有2-3min，细菌死亡之后mRNA便会从死细菌细胞中快速消失，因此mRNA的存在通常是结核基因连续转录的标志。因此，以mRNA为基础的扩增试验可用于区分活菌还是死菌94.PCR-SSCP多聚酶链式反应-单链构象多态性分析法（PCR-SSCP），主要用于结核杆菌耐药性的检测。其原理为根据在非变性聚丙烯酰胺凝胶中相同长度单链DNA片段泳动距离的改变判定单个碱基变异。由于利福平耐药突变只在特定区域内发生，而通过PCR方法扩增这段基因，电泳直接判定突变有无，大大简化了突变分析操作。Telenti10最先评估了放射性同位素标记PCR-SSCP方法的结核杆菌ropB突变中的应用价值。所有利福平耐药菌株均成功地被检测出来，证明此方法特异准确。它可以同时进行大量临床标本筛选，使结果报告时间缩至4872小时。目前国内外本方法的研究较多，并已有成功用于临床痰标本及脑脊液标本检测的报道11、12、13。SSCP方法为临床快速简便鉴定结核杆菌ropB基因突变开辟了新领域，尽管存在一定不足，如每次电泳均需有标准结核杆菌株对照及有时差异不易区分、不能鉴别沉默突变14等，但仍不失为一种有广泛应用前景的方法。分子生物学技术，能够对临床早期疑似病人的结核病进行早期的快速诊断，而且灵敏度和特异性较高，不失为临床上诊断结核分枝杆菌的快速方法。但是在实践中，由于成本和实验室条件要求较高，该方法在临床上的普及受到了一定的制约。 (二) 噬菌体裂解技术从1947年Gardner首次分离出分枝杆菌噬菌体，至今已分离出了250余种。噬菌体作为一项新的研究工具逐渐被开发和利用16。从而开辟出一个对MTB研究和诊断的新领域。分枝杆菌噬菌体是一种专性寄生于分枝杆菌的DNA或RNA病毒，有裂解型（毒型）和温和型（溶原型）两类。分枝杆菌噬菌体具有病毒的共同生物学特性：个体小，结构简单，能通过滤器，没有独立的代谢酶系，只能在活的处于代谢状态的宿主体内繁殖。分枝杆菌噬菌体感染细菌具有种属行异性，即一种噬菌体只能感染一个细菌种属，甚至于一个种属的几株细菌。裂解型噬菌体感染宿主菌后，依赖宿主菌的代谢酶系，合成子代噬菌体，最终产生一种裂解酶，破坏杀灭宿主菌，不与宿主菌的DNA发生转导，裂解型噬菌体已在分枝杆菌快速诊断及药敏试验中得到广泛应用17.18。由于分枝杆菌噬菌体D29能够感染裂解型结核分枝杆菌，一些学者已研究开发出分枝杆菌噬菌体试剂盒（FASTPlagueTBtm）用于快速检测结核分枝杆菌19.20。噬菌体裂解法检测结核分枝杆菌的基本原理是21：分枝杆菌噬菌体只能感染活的结核分枝杆菌，当结核分枝杆菌与噬菌体D29混合孵育时，噬菌体D29感染结核分枝杆菌，随后加入强效的杀毒剂（FAS）22，杀死培养基内所有游离的噬菌体，而菌体内的噬菌体不受影响。感染的噬菌体在靶菌体内繁殖并裂解菌体释放子代噬菌体，这些噬菌体又感染和裂解随后加入的指示菌细菌（耻后分枝杆菌），在琼脂培养基上形成噬菌斑，由此可以判断标本中存在活的结核分枝杆菌。若标本中没有活的结核分枝杆菌，则噬菌体被全部杀死，培养皿中不全出现噬菌斑，即为阴性。而且，噬菌斑的数目与结核分枝杆菌的数量成正比。噬菌体裂解技术的优势在于其敏感性和特异性好，省时，但是此方法在临床上应用不稳定，只能针对法的结核杆菌。三总结与展望母前结核病仍是威胁人类生命的主要杀手，而快速准确的病原学诊断可以早期指导治疗，降低死亡率。虽然，快速诊断的分子生