质粒提取及双酶切鉴定内切酶内切重组质粒

分子医学技能 张彦TEL 87330621 Departmentofbiochemistry molecularbiology 质粒DNA的制备 鉴定内切酶切割重组质粒 p70 p81 一 概述什么是质粒 plasmid 质粒是存在于细菌体内的一类独立于染色体的可以自主复制的双链环状DNA 在细胞内它们常以共价闭环的超螺旋形式存在 质粒DNA的一般特性 质粒是细菌内的共生型遗传因子有相对独立性 它能在细菌中垂直遗传并赋予宿主细胞一些表型 是双链闭合环状DNA 分子量大小不等 质粒DNA与宿主菌染色体DNA的两点不同 宿主菌染色体 chromosome DNA通常比质粒DNA要大得多 纯化分离的宿主菌DNA多为线性分子 而质粒DNA呈闭合环的形式 提取质粒DNA的目的与意义 是基因克隆 geneclone 的第一步 分离得到转运目的基因的载体 为基因重组 generecombination 作准备 质粒可以直接转化 transform 细胞 为目的基因 targetgene 的表达提供条件 基因载体 genevector 什么是基因载体把一个有用的目的DNA片断通过重组DNA技术 送进受体细胞中去进行复制和表达的工具 基因载体的作用 为目的基因提供进入受体细胞的转移能力 为目的基因提供在受体细胞中的复制 或整合 和表达所需条件 基因载体应具备特点 具有独立复制能力 在细胞中能大量繁殖 从而使目的基因大量扩增 具有适当的限制性内切酶识别和切割位点 具有供筛选用的遗传标记 作为表达载体应能利用宿主的酶系统 表达目的基因 相对分子量小 细胞内稳定性高 可转移性基因载体类型 质粒 噬菌体 phage 病毒 virus DNA 二 质粒DNA提取原理与方法核酸分离纯化的总原则 保证核酸一级结构 primarystructure 完整 排除其他分子的污染 蛋白质 脂类 糖 有机溶剂 金属离子 外源DNA RNA等 分离纯化质粒DNA的方法有很多种 碱裂解法 煮沸法 highpureplasmidisolationkit等 各种方法原理相似 都是利用两种DNA的差异来分离的 因此它们有共同的步骤 培养细菌使质粒扩增 细菌的收集与裂解收集 菌液高速离心的方法裂解细菌方法 去污剂法 有机溶剂法 碱裂解法 沸水裂解法 溶菌酶法 超声处理法等 根据质粒的大小 宿主菌菌株及裂解后的纯化方法等因素综合后加以选择 质粒DNA的纯化常用的方法有 超速离心 层析法 聚乙二醇沉淀法等 所有纯化方法都是利用了质粒DNA相对较小及共价闭合环状的性质 SDS碱裂解法制备质粒DNA的原理 在有EDTA及去污剂 SDS 存在的条件下 用碱处理细菌 可以使细菌的细胞壁破裂 释放出细胞内容物 染色体DNA 蛋白质和RNA等 强碱环境 pH12 0 12 6 可以使细菌线性染色体片段氢键断裂 双链解开变性 而质粒DNA共价闭合环状的双链并不完全分离 当加入高浓度酸性盐时 pH值恢复至中性 并在有高盐存在的条件下 变性染色体DNA与变性的蛋白质以及细胞碎片凝聚成不溶性沉淀物 质粒DNA又恢复天然构型 能溶解在上清液中 这样通过离心可以把染色体DNA 蛋白质 SDS复合物等一起除去 SDS碱裂解法抽提质粒的主要试剂溶液 由葡萄糖 EDTA Tris Cl组成 葡萄糖的作用是增加溶液的粘度 减小抽提过程中的机械剪切作用 防止破坏质粒 EDTA的作用是络合镁等二价金属离子 防止DNA酶对质粒分子的降解作用 Tris Cl调节溶菌液维持溶菌作用的最适PH范围 溶液II 由SDS 十二烷基硫酸钠 与NaOH组成SDS的作用是解聚核蛋白并与蛋白质分子结合使之变性 NaOH的作用是破坏氢键 使DNA分子变性 溶液III 由冰醋酸和KAc组成 能中和溶液 的碱性 使质粒DNA复性 并为染色体DNA缠绕提供盐环境 实验步骤及注意事项 加1 5ml培养物于EP管 12000rpm 30sec弃上清 倒置EP管于卫生纸上使液体流尽 加入100ul溶液I重悬沉淀 剧烈震荡EP管 摇匀 加入200 l溶液II 快速温和颠倒数次加入150 l冰冷溶液III 颠倒10s 冰浴4min 12000rpm 5min 转移上清到新EP管 加入等体积的酚 氯仿 1 1 混匀 12000rpm 5min转移水相至新EP管 加两倍体积无水乙醇 混匀 12000rpm 5min弃上清 倒置管于卫生纸上使液体流尽沉淀中加入1ml70 乙醇 12000rpm 5min去上清 静置5min干燥 TE20 l溶解质粒 注意事项 1 加样枪正确使用 2 标记自己所提取的质粒类型 pUC119或pUC119 U6 3 废液倒在水池中 枪头扔到垃圾捅中 4 加不同溶液要换枪头 5 离心前把管擦干 6 转移上清时不要吸到沉淀 7 吸取酚时枪头伸到下层溶液中 注意不要沾到皮肤 EcoR Hind 切割重组质粒 双酶切体系 ddH2O6 l质粒DNA10 l10 Mbuffer2 lEcoR 1 lHind 1 l 合计20 l 单酶切体系 ddH2O7 l质粒DNA10 l10 Mbuffer2 lHind 1 l 合计20 l 限制性核酸内切酶 限制性核酸内切酶是识别DNA的特异序列 并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶 限制性核酸内切酶 存在于细菌体内切割不同来源的DNA分子将产生特征性限制性酶切图谱 具有重大应用价值 分子手术刀 作用与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰系统 限制外源DNA 保护自身DNA 分类 基因工程技术中常用 型 第一个字母取自产生该酶的细菌属名 用大写 第二 第三个字母是该细菌的种名 用小写 第四个字母代表株 用罗马数字表示发现的先后次序 命名 Hind Haemophilusinfluenzaed株流感嗜血杆菌d株的第三种酶 类酶识别序列特点 回文结构 palindrome 切口 平端切口 粘端切口 BamH Hind 平端切口 粘端切口 影响限制酶活性的因素 1 星 活性酶的特异性改变或特异性降低而呈现的活性 EcoR GAATTCEcoR AATT2 甲基化识别序列中某些碱基甲基化后会阻碍酶活性 3 底物性状4 试剂 缓冲系统 三 DNA琼脂糖凝胶电泳原理在pH8 0 碱性 的环境中DNA的磷酸基团解离 使DNA在该环境中带负电荷 在电场中向正极方向泳动 因为各种DNA分子的电荷数 分子量 构象不同 它们在通过凝胶立体网格时所受的动力和阻力不同 所以泳动的速度有差异 以此达到分离的目的 DNA显色剂多用EB 它能和碱基间的氢键结合 在紫外光照射下呈橘红色 530nm 的荧光 实验步骤 1 胶带封制胶板两端 示教 2 放好梳子 等胶稍稍冷却后灌胶 3 待胶凝固后撕去胶带 将制胶板放在电泳槽中 轻轻拔掉梳子 4 加样 10 l质粒和2 lloadingbuffer在胶带上混匀 5 接通电源 开始电泳 120V 6 蓝色条带快到终点时停止电泳 EB染色5min 7 漂洗后紫外灯下观察结果 注意 1 灌胶时应避免出现气泡 2 拔梳子时动作要轻柔 注意不要