课题2　土壤中分解尿素的细菌的分离与计数

1 尿素的利用 尿素是一种重要的农业氮肥 尿素不能直接被农作物吸收 土壤中的细菌将尿素分解成氨之后才能被植物利用 2 细菌利用尿素的原因 土壤中的细菌分解尿素是因为它们能合成脲酶 课题背景 3 常见的分解尿素的微生物 芽孢杆菌 小球菌 假单胞杆菌 克氏杆菌 棒状杆菌 梭状芽孢杆菌 某些真菌和放线菌也能分解尿素 4 课题目的 从土壤中分离出能够分解尿素的细菌 统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌 专题2微生物的培养与应用 课题2 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 1 自然界中筛选菌株实例 启示 原因 DNA多聚酶链式反应是一种在体外将少量DNA大量复制的技术 此项技术要求使用耐高温 930C 的DNA聚合酶 一 筛选菌株 美国黄石国家公园的一个热泉 因为热泉温度70 800C 淘汰了绝大多数微生物 只有Taq细菌被筛选出来 寻找目的菌种时要根据它对生存环境的要求 到相应的环境中去寻找 如果请你来寻找这种耐高温的酶 你会去哪里寻找 为什么Taq细菌能从热泉中被筛选出来呢 方法 抑制大多数微生物不能生长 造成有利于该菌生长的环境结果 培养一定时间后 该菌数量上升 再通过平板稀释等方法对它进行纯化培养分离 2 实验室中微生物的筛选原理 人为提供有利于目的菌株生长的条件 包括营养 温度 pH等 同时抑制或阻止其他微生物生长 3 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数所需培养基 从物理性质看此培养基属于哪类 固体培养基 在此培养基中哪些作为碳源 氮源 碳源 氮源 培养基配方二KH2PO41 4gNa2HPO42 1gMgSO4 7H2O0 2g葡萄糖10 0g尿素1 0g琼脂15 0g 培养基配方一KH2PO41 4gNa2HPO41 4gNaNO32gMgSO4 7H2O3g葡萄糖10 0g琼脂15 0g 葡萄糖 尿素 尿素 培养基的氮源为尿素 只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素 以尿素作为氮源 缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿素 缺乏氮源而不能生长发育繁殖 而受到抑制 所以用此培养基就能够选择出分解尿素的微生物 4 培养基选择分解尿素的微生物的原理 选择培养基 在微生物学中 将允许特定种类的微生物生长 同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基 加入青霉素的培养基分离酵母菌 霉菌等真菌加入高浓度食盐的培养基分离金黄色葡萄球菌不加氮源的无氮培养基分离固氮菌不加含碳有机物的无碳培养基分离自养型微生物 举一反三 1 稀释涂布平板法 活菌计数法 统计平板上的菌落数2 显微镜直接计数 3 滤膜法 是检测水样中大肠细菌群的方法 4 测定细胞重量法 此法分为湿重法和干重法5 测定细胞总氮量或总碳量 利用血球计数板 不能区分死菌与活菌 不适于对运动细菌的计数 需要相对高的细菌浓度 二 统计菌落数目的方法 理论依据 当样品的稀释度足够高时 培养基表面生长的一个菌落 来源于样品稀释液中的一个活菌 1 稀释涂布平板法统计菌落数目 为了保证结果准确 一般选择菌落数在30 300的平板上进行计数 为使结果接近真实值可将同一稀释度加到三个或三个以上的平皿中 经涂布 培养计算出菌落平均数 统计的菌落往往比活菌的实际数目低 涂布平板法所选择的稀释度很重要 一般以三个稀释度中的第二个稀释度所出现的平均菌落数在50个左右为最好 稀释涂布平板法统计菌落数目注意事项 2 显微镜直接计数 利用血球计数板 在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量 不能区分死菌与活菌不适于对运动细菌的计数需要相对高的细菌浓度个体小的细菌在显微镜下难以观察 缺点 大方格 中方格 小方格 实例分析 在做分解尿素的细菌的筛选与统计菌落数目的实验时 A同学从对应的106倍稀释的培养基中筛选出大约150个菌落 但是其他同学在同样的稀释度下只选择出大约50个菌落 分析其原因 土样不同 培养基污染或操作失误 或者是混入了其他的含氮物质 原因 三 设置对照 对照实验是指除了被测试的条件外 其他条件都相同的实验 满足该条件的称为对照组 未满足该条件的称为实验组 方案一 由其他同学用与A同学相同土样进行实验 方案二 将A同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养 作为空白对照 以证明培养基是否受到污染 结果预测 如果结果与A同学一致 则证明A无误 如果结果不同 则证明A同学存在操作失误或培养基的配制有问题 A同学实验设计的方案有两种 设置对照的目的 可排除实验组中非测试因素对实验结果的影响 提高实验结果的可信度 1 实验设计的内容包括实验方案 材料用具 实施步骤和时间安排等 2 根据图示2 7填写以下实验流程 土壤取样 样品稀释 涂布平板后培养与观察 菌落计数 四 具体实验操作 一 土壤取样从肥沃 湿润的土壤中取样 先铲去表层土3cm左右 再取样 将样品装入事先准备好的信封中 二 样品的稀释 分离不同的微生物采用不同的稀释度 其原因是不同微生物在土壤中含量不同 其目的是保证获得菌落数在30 300之间 适于计数的平板 细菌稀释度为104 105 106 放线菌稀释度为103 104 105 真菌稀释度为102 103 104 为什么分离不同的微生物要采用不同的稀释度 测定土壤中细菌的总量和测定土壤中能分解尿素的细菌的数量 选用的稀释范围相同吗 二 样品的稀释 这是因为土壤中各类微生物的数量 单位 株 kg 是不同的 例如在干旱土壤中的上层样本中 好氧及兼性厌氧细菌数约为2185万 放线菌数约为477万 霉菌数约为23 1万 因此 为获得不同类型的微生物 就需要按不同的稀释度进行分离 同时还应当有针对性地提供选择培养的条件 三 微生物的培养与观察 培养不同微生物往往需要不同培养温度 细菌一般在30 37 培养1 2d 放线菌一般在25 28 培养5 7d 霉菌一般在25 28 的温度下培养3 4d 在菌落计数时 每隔24h统计一次菌落数目 选取菌落数目稳定时的记录作为结果 以防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目 点评 菌种中有些菌体增殖快 有些菌体增值慢 所以培养时间要充足 使得每个菌体都能形成肉眼可观察到的菌落 一般来说 在一定的培养条件下 相同的培养基 温度及培养时间 同种微生物表现出稳定的菌落特征 关注菌落的形态 大小 边缘 隆起程度 颜色 质地等等 都是区分细菌的重要手段 酵母菌菌落 放线菌菌落 霉菌菌落 一 无菌操作1 取土用的小铁铲和盛土样的信封在使用前都需要灭菌 2 应在火焰旁称取土壤 在火焰附近将称好的土样倒入锥形瓶中 塞好棉塞 3 在稀释土壤溶液的过程中 每一步都要在火焰旁操作 二 做好标记注明培养基种类 培养日期 平板培养样品的稀释度等 三 规划时间 一 培养物中是否有杂菌污染以及选择培养基是否筛选出菌落 二 样品的稀释操作是否成功如果得到了2个或2个以上菌落数目在30 300的平板 则说明稀释操作比较成功 三 重复组的结果是否一致 五 结果分析与评价 对分离的菌种作进一步的鉴定 还需要借助的方法 生物化学 如何鉴定 六 课外延伸 鉴定原理 在细菌分解尿素的化学反应中 细菌合成的将尿素分解成了 氨会使培养基的碱性 PH 因此 我们可以通过酚红指示剂检测培养基变化来判断该化学反应是否发生 脲酶 氨 增强 升高 pH 大肠杆菌呈深紫色 或黑色 有或无金属光泽 大肠杆菌在伊红美蓝琼脂 EMB 上典型特征 1 对细菌群体生长规律测定的正确的表述是 A 在液体培养基上进行B 至少接种一种细菌C 接种一个细菌D 及时补充消耗的营养物质2 使用选择培养基的目的是 A 培养细菌B 培养真菌C 使需要的微生物大量繁殖D 表现某微生物的特定性状与其他微生物加以区别3 能合成脲酶的微生物所需要的碳源和氮源分别是 A CO2和N2B 葡萄糖和NH3C CO2和尿素D 葡萄糖和尿素 实践训练 A C D 4 下列说法不正确的是 A 科学家从70 80度热泉中分离到耐高温的TaqDNA聚合酶B 统计某一稀释度的5个平板的菌