【生物化学简明教程】第四版03章 核酸.doc

3 核酸1 电泳分离四种核苷酸时，通常将缓冲液调到什么pH？此时它们是向哪极移动？移动的快慢顺序如何? 将四种核苷酸吸附于阴离子交换柱上时，应将溶液调到什么pH？ 如果用逐渐降低pH的洗脱液对阴离子交换树脂上的四种核苷酸进行洗脱分离，其洗脱顺序如何？为什么？ 解答： 电泳分离4种核苷酸时应取pH3.5 的缓冲液，在该pH时，这4种单核苷酸之间所带负电荷差异较大，它们都向正极移动，但移动的速度不同，依次为：UMPGMPAMPCMP； 应取pH8.0，这样可使核苷酸带较多负电荷，利于吸附于阴离子交换树脂柱。虽然pH 11.4时核苷酸带有更多的负电荷，但pH过高对分离不利。 当不考虑树脂的非极性吸附时，根据核苷酸负电荷的多少来决定洗脱速度，则洗脱顺序为CMPAMP GMP UMP，但实际上核苷酸和聚苯乙烯阴离子交换树脂之间存在着非极性吸附，嘌呤碱基的非极性吸附是嘧啶碱基的3倍。静电吸附与非极性吸附共同作用的结果使洗脱顺序为：CMP AMP UMP GMP。2为什么DNA不易被碱水解，而RNA容易被碱水解?解答：因为RNA的核糖上有2-OH基，在碱作用下形成2,3-环磷酸酯，继续水解产生2-核苷酸和3-核苷酸。DNA的脱氧核糖上无2-OH基，不能形成碱水解的中间产物，故对碱有一定抗性。3一个双螺旋DNA分子中有一条链的成分A = 0.30，G = 0.24， 请推测这一条链上的T和C的情况。 互补链的A，G，T和C的情况。解答： T + C = 10.300.24 = 0.46； T = 0.30，C = 0.24，A + G = 0.46。4对双链DNA而言， 若一条链中(A + G)/(T + C)= 0.7，则互补链中和整个DNA分子中(A+G)/(T+C)分别等于多少？ 若一条链中(A + T)/(G + C)= 0.7，则互补链中和整个DNA分子中(A + T)/(G + C)分别等于多少 ？ 解答： 设DNA的两条链分别为和则： A= T，T= A，G= C，C= G，因为：(A+ G)/（T+ C）= (T+ C)/（A+ G）= 0.7， 所以互补链中（A+ G）/（T+ C）= 1/0.7 =1.43；在整个DNA分子中，因为A = T， G = C，所以，A + G = T + C，（A + G）/（T + C）= 1； 假设同（1），则A+ T= T+ A，G+ C= C+ G，所以，（A+ T）/（G+ C）=（A+ T）/（G+ C）= 0.7 ；在整个DNA分子中，（A+ T+ A+ T）/（G+C+ G+C）= 2（A+ T）/2（G+C）= 0.75T7噬菌体DNA(双链B-DNA)的相对分子质量为2.5107，计算DNA链的长度(设核苷酸对的平均相对分子质量为640)。 解答：0.34 （2.5107/640）= 1.3 104nm = 13m。6如果人体有1014个细胞，每个体细胞的DNA含量为6.4 109个碱基对。试计算人体DNA的总长度是多少？是太阳地球之间距离(2.2 109 km)的多少倍？已知双链DNA每1000个核苷酸重1 10-18g，求人体DNA的总质量。 解答：每个体细胞的DNA的总长度为：6.4 109 0.34nm = 2.176 109 nm = 2.176m，人体内所有体细胞的DNA的总长度为：2.176m1014 = 2.1761011km，这个长度与太阳地球之间距离（2.2109 km）相比为：2.176 1011/2.2 109 = 99倍，每个核苷酸重1 10-18g/1000 = 10-21g，所以，总DNA 6.4 1023 10-21 = 6.4 102 = 640g。7有一个X噬菌体突变体的DNA长度是15m，而正常X噬菌体DNA的长度为17m，计算突变体DNA中丢失掉多少碱基对？解答：（1715） 103/0.34 = 5.88 103bp8概述超螺旋DNA的生物学意义。解答： 超螺旋DNA比松弛型DNA更紧密，使DNA分子的体积更小，得以包装在细胞内； 超螺旋会影响双螺旋分子的解旋能力,从而影响到DNA与其他分子之间的相互作用； 超螺旋有利于DNA的转录、复制及表达调控。9为什么自然界的超螺旋DNA多为负超螺旋？解答：环状DNA自身双螺旋的过度旋转或旋转不足都会导致超螺旋，这是因为超螺旋将使分子能够释放由于自身旋转带来的应力。双螺旋过度旋转导致正超螺旋，而旋转不足将导致负超螺旋。虽然两种超螺旋都能释放应力，但是负超螺旋时，如果发生DNA解链（即氢链断开，部分双螺旋分开）就能进一步释放应力，而DNA转录和复制需要解链。因此自然界环状DNA采取负超螺旋，这可以通过拓扑异构酶的操作实现。10真核生物基因组和原核生物基因组各有哪些特点?解答： 不同点: 真核生物DNA含量高，碱基对总数可达10 11，且与组蛋白稳定结合形成染色体，具有多个复制起点。原核生物DNA含量低，不含组蛋白，称为类核体，只有一个复制起点。 真核生物有多个呈线形的染色体；原核生物只有一条环形染色体。 真核生物DNA中含有大量重复序列，原核生物细胞中无重复序列。 真核生物中为蛋白质编码的大多数基因都含有内含子(有断裂基因)；原核生物中不含内含子。 真核生物的RNA是细胞核内合成的，它必须运输穿过核膜到细胞质才能翻译，这样严格的空间间隔在原核生物内是不存在的。 原核生物功能上密切相关的基因相互靠近，形成一个转录单位，称操纵子，真核生物不存在操纵子。 病毒基因组中普遍存在重叠基因，但近年发现这种情况在真核生物也不少见。相同点:都是由相同种类的核苷酸构成的的双螺旋结构，均是遗传信息的载体，均含有多个基因。11如何看待RNA功能的多样性?它的核心作用是什么? 解答：RNA的功能主要有: 控制蛋白质合成； 作用于RNA转录后加工与修饰； 参与细胞功能的调节； 生物催化与其他细胞持家功能；遗传信息的加工；可能是生物进化时比蛋白质和DNA更早出现的生物大分子。其核心作用是既可以作为信息分子又可以作为功能分子发挥作用。12什么是DNA变性？DNA变性后理化性质有何变化？解答：DNA双链转化成单链的过程称变性。引起DNA变性的因素很多，如高温、超声波、强酸、强碱、有机溶剂和某些化学试剂（如尿素，酰胺)等都能引起变性。DNA变性后的理化性质变化主要有： 天然DNA分子的双螺旋结构解链变成单链的无规则线团，生物学活性丧失； 天然的线型DNA分子直径与长度之比可达110，其水溶液具有很大的黏度。变性后，发生了螺旋-线团转变，黏度显著降低； 在氯化铯溶液中进行密度梯度离心，变性后的DNA浮力密度大大增加，故沉降系数S增加； DNA变性后，碱基的有序堆积被破坏，碱基被暴露出来，因此，紫外吸收值明显增加，产生所谓增色效应。 DNA分子具旋光性，旋光方向为右旋。由于DNA分子的高度不对称性，因此旋光性很强，其a = 150。当DNA分子变性时，比旋光值就大大下降。13哪些因素影响Tm值的大小？解答：影响Tm的因素主要有： G-C对含量。G-C对含3个氢键，A-T对含2个氢键，故G-C对相对含量愈高，Tm亦越高（图3-29）。在0.15mol/L NaCl,0.015mol/L柠檬酸钠溶液(1SSC)中，经验公式为：（G+C）% =（Tm - 69.3） 2.44。 溶液的离子强度。离子强度较低的介质中，Tm较低。在纯水中，DNA在室温下即可变性。分子生物学研究工作中需核酸变性时，常采用离子强度较低的溶液。 溶液的pH。高pH下，碱基广泛去质子而丧失形成氢键的有力，pH大于11.3时，DNA完全变性。pH低于5.0时，DNA易脱嘌呤，对单链DNA进行电泳时，常在凝胶中加入NaOH以维持变性关态。 变性剂。甲酰胺、尿素、甲醛等可破坏氢键，妨碍碱堆积，使Tm下降。对单链DNA进行电泳时，常使用上述变性剂。14哪些因素影响DNA复性的速度？解答：影响复性速度的因素主要有： 复性的温度，复性时单链随机碰撞，不能形成碱基配对或只形成局部碱基配对时，在较高的温度下两链重又分离，经过多次试探性碰撞才能形成正确的互补区。所以，核酸复性时温度不宜过低，Tm-25是较合适的复性温度。 单链片段的浓度，单链片段浓度越高，随机碰撞的频率越高，复性速度越快。 单链片段的长度，单链片段越大，扩散速度越慢，链间错配的概率也越高。因面复性速度也越慢，即DNA的核苷酸对数越多，复性的速度越慢，若以 C0为单链的初始浓度，t为复性的时间，复性达一半时的C0t值称C0t1/2，该数值越小，复性的速度越快。 单链片段的复杂度，在片段大小相似的情况下，片段内重复序列的重复次数越多，或者说复杂度越小，越容易形成互补区，复性的速度就越快。真核生物DNA的重复序列就是复生动力学的研究发现的，DNA的复杂度越小，复性速度越快。15概述分子杂交的概念和应用领域。解答：在退火条件下，不同来源的DNA互补区形成双链，或DNA单链和RNA单链的互补区形成DNA-RNA杂合双链的过程称分子杂交。通常对天然或人工合成的DNA或RNA片段进行放射性同位素或荧光标记，做成探针，经杂交后，检测放射性同位素或荧光物质的位置，寻找与探针有互补关系的DNA或RNA。直接用探针与菌落或组织细胞中的核酸杂交，因未改变核酸所在的位置，称原位杂交技术。将核酸直接点在膜上，再与探针杂交称点杂交，使用狭缝点样器时，称狭缝印迹杂交。该技术主要用于分析基因拷贝数和转录水平的变化，亦可用于检测病原微生物和生物制品中的核酸污染状况。杂交技术较广泛的应用是将样品DNA切割成大小不等的片段，经凝胶电泳分离后，用杂交技术寻找与探针互补的DNA片段。由于凝胶机械强度差，不适合于杂交过程中较高温度和较长时间的处理，Southern 提出一种方法，将电泳分离的DNA片段从凝胶转移到适当的膜（如硝酸纤维素膜或尼龙膜）上，在进行杂交操作，称Southern印迹法，或Southern杂交技术。随后，Alwine等提出将电泳分离后的变性RNA吸印到适当的膜上再进行分子杂交的技术，被戏称为 Northern印迹法，或Northern杂交。分子杂交广泛用于测定基因拷贝数、基因定位、确定生物的遗传进化关系等。Southern杂交和Northern杂交还可用于研究基因变异，基因重排，DNA多态性分析和疾病诊断。杂交技术和PCR技术的结合，使检出含量极少的DNA成为可能。促进了杂交技术在分子生物学和医学领域的广泛应用。DNA芯片技术也是以核酸的分子杂交为基础的。16概述核酸序列测定的方法和应用领域。解答：DNA的序列测定目前多采用Sanger提出的链终止法，和Gilbert提出的化学法。其中链终止法经不断改进，使用日益广泛。链终止法测序的技术基础主要有： 用凝胶电泳分离DNA单链片段时，小片段移动，大片段移动慢，用适当的方法可分离分子大小仅差一个核苷酸的DNA片段。 用合适的聚合酶可以在试管内合成单链DNA模板的互补链。反应体系中除单链模板外，还应包括合适的引物，4种脱氧核苷三磷酸和若干种适量的无机离子。如果在4个试管中分别进行合成反应，每个试管的反应体系能在一种核苷酸处随机中断链的合成，就可以得到4套分子大小不等的片段，如新合成的片段序列为-CCATCGTTGA-，在A处随机中断链的合成，可得到-CCA和-CCATCGTA两种片段，在G处中断合成可得到-CCATCG和-CCATCGTTG两种片段。在C和T处中断又可以得到相应的2套片段。用同位素或荧光物质标记这4套新合成的链，在凝胶中置于4个泳道中电泳，检测这4套片段的位置，即可直接读出核苷酸的序列。 在特定碱基处中断新链合成最有效的办法，是在上述4个试管中按一定比例分别加入一种相应的2,3-双脱氧核苷三磷酸（ddNTP），由于ddNTP的3位无-OH，不可能形成磷酸二酯键，故合成自然中断。如上述在A处中断的试管内，既有dATP，又有少量的ddATP，新合成的-CCA链中的A如果是ddAMP,则链的合成中断，如果是dAMP，则链仍可延伸。因此，链中有几个A，就能得到几种大小不等的以A为末端的片段。如果用放射性同位素标记新合成的链，则4个试管中新合成的链在凝胶的4个泳道电泳后，经放射自显影可检测带子的位置，由带子的位置可以直接读出核苷酸的序列。采用T7测序酶时，一次可读出400多个核苷酸的序列。近年采用4种射波长不同的荧光物质分别标记4种不同的双脱氧核苷酸，终止反应后4管反应物可在同一泳道电泳，用激光扫描收集电泳信号，经计算机处理 可将序列直接打印出来。采用毛细管电泳法测序时，这种技术一次可测定700个左右核苷酸的序列，一台仪器可以有