「RNA含量的测定—紫外吸收法」.doc

RNA含量的测定紫外吸收法一、目的1、掌握利用紫外吸光法测定RNA含量的原理和方法2、了解紫外分光光度计的使用原理。二、原理核酸、核苷酸及其衍生物的分子结构中的嘌呤、嘧啶碱基具有共轭双健系统(CC一CC 一)，能够强烈吸收250280nm 波长的紫外光。核酸(DNA，RNA)的最大紫外吸收值在260nm 处。遵照Lambert-Beer 定律，可以从紫外光吸收值的变化来测定核酸物质的含量。在不同pH 溶液中嘌呤、嘧啶碱基互变异构的情况不同，紫外吸收光也随之表现出明显的差异，它们的摩尔消光系数也随之不同。所以，在测定核酸物质时均应在固定的pH溶液中进行。三、材料1、干酵母粉（市售）。2、0.2氢氧化钠溶液，2gNaoH溶于蒸馏水并稀释至1000ml。3、标准RNA溶液：100g/mL。4、95%酸性乙醇和无水乙醇。5、分析天平6、紫外分光光度计7、离心机和离心管8、烧杯(10mL) 锥形瓶和玻璃棒9、容量瓶(100mL)10、移液管(5mL)和移液枪11、试管和试管架。四、操作1、RNA的提取置4g干酵母粉于 200ml锥形瓶中，加入0.2%NaOH溶液40ml，沸水浴加热30分钟，经常搅拌，后流水冷却，4000r/min，离心15分钟，留上清夜加入95%酸性乙醇40mL,边加边搅拌，后静置5-10分钟，再4000r/min离心5分钟，保留沉淀，再每次用10mL95%乙醇洗涤沉淀，3000r/min，离心5分钟，洗涤两次，再用无水乙醇洗涤两次，每次3000r/min离心5分钟，收集沉淀于滤纸上，沉淀即为粗RNA，晾干后测定RNA的浓度。2、样品处理称取0.20.25g粗品RNA，加入2ml0.2%的NaOH溶液，和1ml H2O溶解，调成糊状，再加入4050ml H2O溶解，调节pH至7.0，然后定容至100ml。（再取2ml定容至100ml待测）3、标准曲线绘制与样品测定配制标准RNA溶液梯度，取11支试管，洗干净后，标号为0、1、2、3、4、5、6、7、A、B、C按下表，测定其Abs值，做出工作曲线试管 0 1 2 3 4 5 6 7 A B C标准RNA液（g/ml） 0 5 10 15 20 25 30 35 粗品RNA（ml） 6 6 6五、实验结果 1、列表表2酵母RNA样品溶液吸光度测定结果试管01234567ABCAbs值00.1280.2260.3180.4190.5370.6220.7100.5230.5170.518 2、标准RNA曲线的绘制由吸光度-RNA浓度标准曲线可得，RNA样品溶液浓度为：C=25g/mL，因此可求出RNA样品溶液中RNA的含量为：m=2550100=0.125（g）则RNA样品的纯度为：=0.1250.2519100%=49.62%则干酵母粉中RNA的比例为：=0.1254100%=3.13%六、实验分析1、样品中RNA含量较低，可能原因如下：1) 粗制的RNA在空气下长时间放置，性质改变.2) 实验环境较差，人体唾液中含有RNA酶，飞溅到RNA上，RNA降解一部分。3) 在RNA的提取过程中，对RNA粗品的冲洗次数较少，导致其遗留杂质较多。标准RNA放置时间较长，物理性质发生改变，导致其吸光度变小。故标准曲线较理论的曲线y值偏小。故最终标准曲线上面所反映的样品RNA浓度偏大。2、测定RNA含量的几种方法及其比较（1） 定磷法：磷的测定方法很多，Fiske-Subbarow定磷法是一经典的但至今仍被经常采用的方法，它具有灵敏、简便的特点。各种含磷有机物经硫酸或过氯酸水解，使有机磷消化成为无机磷。无机磷在酸性条件下，与钼酸盐（常用钼酸铵或钼酸钠）反应生成磷钼酸盐络合物。用还原剂处理，磷钼酸盐络合物被还原生成钼蓝，在660nm处有最大光吸收峰。在一定浓度范围内，颜色的深浅与磷含量成正比关系。因此可应用分光光度法进行磷的定量测定。核酸是一类含磷化合物，其分子含有一定比例的磷，一般纯的RNA及其核苷酸含磷质量分数为9.0%；DNA及其核苷酸含磷质量分数为9.2%，即每100g核酸含有9.09.2g磷，也就是核酸量是含磷量的11倍左右，故测得磷的量，即可求得核酸量。这就是定磷法的理论依据，磷的定量测定是测定核酸含量常用手段之一。 生物有机磷材料中有时含有无机磷杂质，故用定磷法来测定该有机磷物质的量时，必须分别测定该样品的总磷量，即样品经过消化以后所测得的含磷量，以及该样品的无机磷含量，即样品未经消化直接测得的含磷量。将总磷量减去无机磷才是该有机磷物质的含磷量。（2）地衣酚法（苔黑酚法）：RNA含量测定，除可用紫外吸收法及定磷法外，常用地衣酚法测定。其反应原理是：当RNA与浓盐酸共热时，即发生降解，形成的核糖继而转变成糠醛，后者与3，5-二羟基甲苯（地衣酚或苔黑酚，orcinol）反应，在Fe 3+或Cu 2+催化下，生成鲜绿色复合物。反应产物在670nm处有最大吸收。RNA浓度在20250gml-1范围内，光吸收与RNA浓度成正比。地衣酚法特异性差，凡戊糖均有此反应，DNA和其他杂质也能与地衣酚反应产生类似颜色。因此，测定PNA时可先测得DNA含量再计算RNA含量；（3） 二苯胺法：DNA分子中的脱氧核糖基，在酸性溶液中变成-羟基-酮基戊醛，与二苯胺试剂一起加热产生蓝色反应，在595nm处有最大吸收。DNA在40400微克范围内，光密度与DNA的浓度成正比。在反应液中加入少量乙醛，可以提高反应灵敏度。除DNA外，脱氧木糖，阿拉伯糖也有同样反应。其它多数糖类，包括核糖