.动物细胞培养技术

动物细胞培养技术绪论部分1）细胞的基本概念：细胞（包括单个个体）在体外条件下的生长，成为细胞培养。2）组织培养：其本意是指从体内取出组织和细胞，模拟体内生理环境，在无菌，适当温度和一定营养条件下使之生存和生长并维持其结构和功能的方法。（组织培养从广义上说分为动物组织营养和植物组织营养两大类。）组织培养常用术语贴壁依赖性：为细胞需贴附于第五或支撑物上才能生长的性质。细胞一代时间：单个细胞连续两次分裂的时间相隔，可借助显微电影照相术来精确确定。群体倍增时间：在对数生长期进行计算的细胞增加一倍所需时间。克隆;单个细胞通过有丝分裂形成的细胞群体，他们的遗传特性相同。原代培养：从体内取出细胞或组织的第一次培养。传代或传代培养：不论是否稀释，将细胞从一个培养瓶转移或移植到另一个培养瓶。细胞杂交：两个或多个不同的细胞融合导致一个含核体的形成。细胞培养：其本意是指从体内取出组织和细胞，模拟体内生理环境，在无菌、适当温度和一定营养条件下，使之生存和生长并维持其结构和功能的方法。细胞培养的作用：在病毒学上的作用（病毒的分离细胞培养在药物学上的作用（新药的制备、药效的鉴别、病毒疫苗的生产、单抗的制备）；细胞培养在肿瘤学研究上的作用（例如化疗中的药物使用剂量、癌症研究等）细胞培养在细胞功能与分化研究中的应用；细胞培养在免疫学中的应用1)Harrison首先解剖出蛙胚原始脊髓节段进行培养。哈里森悬滴培养法。建立起一套合理的无菌操作技术。（淋巴）一般皆公认Harrison为“组织培养之父”，凹玻片悬滴制备培养技术，对生物学知识的研究做出十分重要贡献。2) Carrel 反复传代的方法使细胞系存活34年。他采用的无菌技术，以及后来设计的培养瓶(卡氏瓶，Carrel flask)等都是对组织培养的重要贡献。特别是他的连续培养，为后来的传代培养奠定了基础。 30年代传入我国，50年代逐渐发展细 胞 培 养 设 施和 基 本 条 件（一）细胞实验室基本原则：防止微生物污染和有害物的影响。和其它微生物培养不能在同一区域进行。净化工作室细胞培养实验室区域设置一般分三区：无菌室、缓冲间、准备室一、准备室的主要作用消毒和培养物质的准备以及供应物品的保藏等。准备室内应有的设备：水槽和盛物台、酸缸、水盆和桶、电炉和锅、物品准备台和水纯化装置、高压蒸汽消毒器、电热干燥消毒箱、储柜或储架。二、缓冲室1）减少外界污染源带入培养室2）应有消毒水、无菌衣和紫外灯或臭氧机三、无菌室（操作室或培养室无菌室要求1）培养室要密闭、无外窗2）空气调节机要用中央风机3）培养室的墙壁最好贴瓷片，墙壁要光滑无死角，地面可用水磨石或瓷砖4）装有紫外灯，天花板不宜高过2.5米无菌室应放置的设备： 超净工作台、倒置显微镜、二氧化碳培养箱、真空泵或气泵、冰箱、杂物柜、小型低速离心机 。（二）超净工作台原理：鼓风机驱动空气通过高效空气微粒滤层净化后，通过工作台面，形成无菌环境。按气流方向可分为外流式和侧流式：外流式：净化的气流朝操作者方向流动。侧流式：气流从上向下或从左至右流向对侧。使用注意事项：每三个月清洗一次粗滤网；根据情况更换除菌滤网；二、常用的大型必备装置和仪器 1.培养箱：二氧化碳培养箱，CO2培养箱设定的条件为37，5CO2。使用CO2培养箱培养细胞时应注意： 用螺旋口瓶培养细胞时，需将瓶盖微松，以保证通气。 保持培养箱内空气干净，定期消毒。 箱内灭菌蒸馏水，也可加入防腐剂以保持箱内湿度，避免培养液蒸发2.倒置显微镜： 了解细胞生长情况，及时发现污染和污染类型。注意事项: 在照明期间,注意不要触及灯泡和集光镜，不要将易燃物质靠近灯泡；随时关闭电源3、冷冻保存装置细胞培养中常需储存细胞，常用的是液氮容器。液氮罐为双层结构，中间为真空层。内胆颈部与体部经焊接相连。 总的来说，可分为窄颈瓶和宽颈瓶。使用时应注意事项：1、搬动和装入液氮时，要小心缓慢加入；2、由于液氮不断挥发，经注意观察存留液氮情况，及时定期补充，防止挥发过多而致细胞受损。4.冰箱-20 。粉状培养基、消化酶、谷氨酰胺要贮存在4；血清、配制的抗生素、谷氨酰胺溶液等，需长期冷冻。如有条件，可配置-80 冰箱5.水纯化装置(1)自动双重纯水蒸馏器：(2)自动纯水仪双蒸器使用应注意事项：1、使用时先开启冷却水水源。2、要调节去离子水或蒸馏水流速，使之进入一次横式烧瓶的速度基本上与二次横式烧瓶的流出速度相等。3、停用时应先关闭去离子水，再关闭电源，最后关闭冷却水。4、不可用普通自来水蒸馏。5、不宜使用存放数日的三蒸水。新购回的蒸馏器清洗方法：1.自来水冲洗；2.在1稀盐酸中浸泡24h，再用自来水冲洗；3.用单蒸水涮洗数次；4.安装好后，开始10min内蒸馏出来的水，舍去不用。蒸馏器清洗步骤：1、移下冷却管，小心加入约100ml浓盐酸到横式烧瓶内；2、半小时后，放出盐酸，自来水冲洗数次，去离子水冲洗后备用。6.离心机一般1000rpm就可使细胞沉降，速度过大易使细胞损伤，实验室配置4000rpm国产离心机即可。7.pH计（酸度计）培养用的许多溶液要求pH值(7.27.4)8.天平一般用电子天平配制溶液。一般组织培养需配置一台小型的普通天平9.高压蒸汽消毒装置：1）大容量高压灭菌器 2）全自动手提式灭菌器 用于培养的培养器皿、三蒸水、一些培养用液、手术器材、胶塞等均需高压蒸汽灭菌。对于手术器械、培养器皿等物品在灭菌后要迅速使之干燥。10.电热干燥箱温度范围在50300;主要用于器皿的干燥及干热消毒。干热消毒（160 ，2小时）,主要用于玻璃器皿消毒 磁力搅拌器二、最常用的培养器具1.过滤除菌装置：微孔滤膜滤器：滤膜的材料为混合纤维素酯，孔径有数种，常用有0.22微米和0.1微米两种。主要包括正压式不锈钢滤器和针头式加压塑料小滤器。可换膜式滤器有多种类型：a、正压式金属滤器又称筒式不锈钢滤器。2.手术器械作用：解剖动物，取材和原代培养中切割组织。手术刀柄及刀片、组织剪、虹膜剪、镊子、止血钳等。3.培养器皿体外培养须使用大量的各式瓶皿。玻璃器皿选用透明度好、无毒的中性硬质玻璃制成。塑料培养器皿的生长面带负电荷多为玻璃瓶，常用翻盖胶塞的盐水瓶，存放培养液、血清、试剂等。(2)培养瓶：有玻璃的和塑料的两种，培养瓶：胶塞，螺旋盖。胶塞用于密闭培养。培养瓶的结构:瓶口开口方向略朝上，与瓶身成一定角度培养瓶的规格一般指培养瓶壁生长面的面积或培养瓶的容积（3）培养皿：主要用于盛放、处理、分离组织，也可用于集落形成的测定及单层细胞贴壁培养等实验。(4)多孔培养板：仅有塑料的一种。其规格有4孔、6孔、24孔、96孔培养板。优点是节约样品和试剂，可同时检测大量样本。(5)移液管和吸管：移液管为有刻度的吸管。吸管有直头和弯头两种。(6)离心管：一般离心管。微量离心管(又称Eppendorf管)，规格有1.5ml、1ml、0.5ml等。(7)其它器皿：如配制溶液的烧杯、量筒、漏斗、试管，消毒吸管用的消毒筒、以及冻存细胞用的玻璃安瓿或塑料冻存管等。 5.特殊用具(1)筛网：金属或尼龙筛网两种材料。金属筛网又分为不锈钢网和铜网两种。筛网的规格有“目”与“孔径”两种表示方法。金属筛网有150目(孔径为100 m)、200目(74m)、400目(40m)等规格，尼龙筛网有孔径为50 m、75m、100m以及250m等多种规格。(2)细胞刮刀：细胞刮刀(cell scraper)用于将贴壁生长的培养细胞从培养瓶皿的壁上刮除下来。6.杂用品试管架、培养瓶支架、微量加样器支架、酒精灯，小件用品包装消毒用的铝饭盒，密封瓶口用的各型胶塞，吸取液体用的乳胶滴头，耐压抽气胶管，玻璃器皿泡酸用的酸缸、抽滤装置等7、洗刷装置：超声波清洗仪无菌制度1、一般情况下细胞间每日消毒一次（包括缓冲间），方法为紫外线消毒（每次30分钟至1小时）一次，另外每周用10乳酸在紧闭门窗下熏蒸30分钟；2、实验完毕应及时清理所用物品，注意台面整洁；3、及时清洗所用隔离衣，并高压灭菌后存放于指定位置； 4、除实验必须的用品外，其它物品不得带入净化室；进入缓冲间必须更换指定消毒的拖鞋；5、人员流动：原则为进出净化室应按次序开、关门，只有将前面打开的门关闭后才允许打开下一个门，使缓冲间起到应有的作用。作业题1.常用的大型必备装置和仪器有那些？2.CO2培养箱、电热干烤箱、倒置显微镜和液氮罐使用注意事项?3.双蒸器使用时操作步骤？4.双蒸器使用一段时间后清洗步骤？5.常用过滤除菌装置有那几种，筒式不锈钢滤器属于那一种。试述实验室设计原则、方案和要求。培养室的功能、条件和要求。试述细胞培养的无菌环境 。提问：常用的过滤除菌装置有那几种？筒式不锈钢滤器属那一种？鼓风干燥箱使用时应注意事项？双蒸器使用时应注意事项？1.清洁液配置方法及注意事项.2.甲醛产生气体的方法.3.玻璃器皿，橡胶塞，橡胶管，金属器械，塑料制品，注射式滤器，培养瓶盖的清洗步骤。1、原代培养的概念及优点。2、解离释放细胞的方法有哪几种并说明其优缺点。3、提示需要更换培养液的因素有哪几点。4、如何实现悬浮细胞的培养清洗和消毒的作用：1清除表面残留的有毒有害物质及微生物。2改变玻璃表面性质。一、纯净水制备（1）纯化水制备应注意事项：1.纯化水装置应放在洁净、无尘、清静的地方。 2.贮在专用的玻璃瓶内,标记日期，最好随用随制。（2）纯化水的常用制备方法：1.去离子法和石英双重玻璃蒸馏器法结合2. 超纯水装置制备纯化水去污剂的选择和使用：碱性去污剂和浓硫酸洗液配合使用玻璃器皿的清洗有效清洗需注意事项:1用后应立即浸泡；2挑选合适的去污剂；3流水冲洗20次后，再用去离子水和重蒸馏水漂洗；4洗后应及时晾干或烘干；5包装后，放置干净处，待消毒。（一）玻璃器皿的清洗步骤1.浸泡：新购买的 5%盐酸过夜。目的：软化和溶解附着物2.刷洗：放在洗涤剂中反复刷洗。注意事项：（1）不留死角。（2）防止破坏器皿表面的光洁度。（3）用软毛刷。3.浸酸 ：酸液又称清洁液,有强氧化作用。分类:强酸、次强酸和弱酸（硫酸）。不少于六小时，一般过夜。注意安全！4. 冲洗 “注满水-倒空” 或注入“2/3的水后振荡冲洗” 20次以上蒸馏水冲洗23次 重蒸水一次。（二）塑料制品的清洗清洗程序为：使用后立即流水冲洗自来水过夜用纱布或棉签和50洗涤液刷洗流水冲洗晾干浸于清洁液中15分钟流水冲洗20遍以上蒸馏水浸洗三次双蒸水中泡24小时后冲洗晾干。（三）金属器械的清洗新的：先用沾有汽油的纱布擦去油脂 流水冲净酒精棉球擦拭晾干。用过的金属器械立即用酒精棉球擦拭干净。（四）橡皮帽和橡皮塞的清洗新的：2%NaOH溶液中浸泡过夜 流水冲洗，2%5%HCl浸泡30分钟流水冲洗去离子水浸泡过夜或煮沸20分钟。用过的可沸水处理，清水漂洗，去离子水冲洗，烘干即可。二、包装1防止消毒灭菌后再次遭受污染2包装材料常用包装纸、牛皮纸、硫酸纸、棉布、铝饭盒、玻璃或金属制吸管筒、纸绳等。 3包装分为局部包装和全包装两类。三、消毒和灭菌物理方法,化学方法，抗生素（一）物理消毒法1.紫外线消毒： G最敏感，作用机制:直接:破坏核酸及蛋白质间接:产生的臭氧杀死微生物同辐射强度和照射剂量呈正相关照明 对培养细胞与试剂有不良影响 （二）电离辐射消毒作用原理:射线或加速离子辐射物品以杀灭微生物射线由放射性核素60 Co 产生，加速粒子由电子加速器产生灭菌的特点: 1.灭菌时物品不会升温 2.辐射的穿透力强，可直接对密封包装的物品进行灭菌；3. 不适合消毒活的生物材料。（三）湿热灭菌 1高压蒸汽灭菌法 是最常用的灭菌方法，2煮沸消毒法也时常用的消毒方法，它具有条件简单.使用方便等优点。3.干热灭菌：用于不会被高温损坏的物品。4.过滤除菌 ： 用于遇热不稳定的试剂或培养液（二）化学消毒法常用的化学消毒剂包括甲醛、环氧乙烷、乙醇、新洁尔灭、氯已定（洗必泰）、戊二醛、碘伏和碘酊、乳酸、来苏尔等。1.甲醛 水溶液和气体对各种细菌、芽孢及真菌等微生物均有杀灭作用。消毒对象：无菌室内的空气和物体表面。甲醛产生气体的方法：（1）多聚甲醛加热法：将多聚甲醛研成粉末，铺在金属板上，加热至150以上即产生甲醛气体。多聚甲醛用量为每平方米10-20g，作用时间12-24小时。（2）甲醛水溶液蒸发法：将40%甲醛水溶液（福尔马林）倒入蒸发皿中，加热蒸发。福尔马林的用量为每平方米25ml，作用时间12-24小时。（三）抗生素消毒法培养用液，可用于预防和急救。针对不同微生物选择不同的抗生素各种消毒灭菌使用范围：过滤除菌、紫外照射、乳酸熏蒸、甲醛熏蒸等可消毒实验室空气。新洁尔灭等可消毒实验室地面。高压蒸汽消毒、紫外照射灯可消毒器械。高压蒸汽消毒、过滤除菌可消毒培养用液培养用液分类：平衡盐溶液、培养基、杂用液平衡盐溶液（BSS）：组成：无机盐、葡萄糖等。作用：维持渗透压、保持pH值稳定、提供简单营养。一般配为浓缩液.常用的几种平衡盐溶液：Ringer，PBS，D-Hanks 和Hanks，Earle组织培养基分类来源：天然；人工合成。基质的状态：半固体；液体培养基的基本要求：（一）基本营养物质：氨基酸，单糖，维生素，无机离子与微量元素。（二）促生长因子及激素（三）无毒无污染（四）温度：35-37（五） pH（六）渗透压天然培养基是指来自动物体液或利用组织分离提取的一类培养基。优点：营养丰富，效果好。缺点：成分复杂；来源受限；批间有差异；易污染。血清、胚胎浸出液、血浆。血清1、种类：小牛（1030D）、新生牛（24H）、胎牛。2.血清的成分及作用：1）提供基本的营养物质2）提供贴壁和扩展因子3）提供激素及各种生长因子4）提供结合蛋白5）对培养细胞提供某些保护作用，可中和有毒物质3.使用血清的缺点1）可能改变细胞在体内的正常状态2）有些物质对细胞产生毒性作用3）每批血清之间都有差别4）取材过程有可能带入支原体、病毒4.血清的质量标准取材对象、取材过程：胎牛、新生牛、小牛外观特征;好的血清应该是透明清亮，土黄色或棕黄色，无沉淀或极少量沉淀，比较粘稠。如果发现血清浑浊，不透明，含许多沉淀物，说明血清污染或血清中的蛋白质变性；若血清曾棕红色，说明血清中的血红蛋白含量太高，取材时有溶血现象；如果摇晃时感觉液体稀薄，说明血清中掺入的生理盐水太多。5血清的使用和储存1）使用前的处理：灭活2）储存条件:-20。3）使用浓度：一般说来，含5小牛血清的培养基对大多数细胞可以维持细胞不死，但支持细胞生长一般需加 10血清。注意事项:1、逐步解冻，否则蛋白质凝集产生沉淀； 2、避免反复冻融。三、合成培养基基本培养基：固体、液体；无血清培养基；无蛋白培养基（一）基本培养基（通用培养基）；添加天然培养基后成为完全培养基。基础培养基的分类：1、199培养基1092、低限量基础Eagle培养基（minimum essential media，MEM）3、DMEM （Dulbeccos modified Eagle medium）：增加了各成分的用量；分高糖型和低糖型。5、RPMI1640（1630，1634）培养基的配制：培养液配好后，要先抽取少许放入培养瓶内在37摄氏度温箱内置24到48H，以检测培养液是否有污染，按后方可用于实验。每次配液量以使用两周左右为宜，一次配液不要太多。意识短期内用不完造成营养成分损失需要补加，步骤繁琐效果也不理想，二是量大易造成污染，一旦污染损失也较大。 杂用液（其它培养用液）一、消化液1、胰酶（trypsin）溶液原理：细胞间蛋白质水解，使细胞解离；活性表示方法(酪蛋白)：1：125或1：250；配制浓度：0.1%或0.25%，作用2-10分钟；最适PH值是89；注意:用无钙镁溶液配制。血清和钙镁离子均可抑制其活性；过滤除菌。如何中止胰酶消化？2、EDTA溶液：可吸收钙镁离子，破坏细胞间连接，使细胞分离；使用浓度:0.02%。可高压灭菌。可单独使用，也可配合胰酶使用。不会被血清中和。3、胶原酶（collagenase）溶液1)作用对象:可使细胞间质和胶原水解，对细胞损伤较小。2)经常用于上皮类细胞的原代培养。3)使用浓度:0.10.3mg或200000U/L。4)PH值6.5。5)不受血清和钙镁离子抑制；价格昂贵。二、PH值调整液1）碳酸氢钠溶液是培养基中必须添加的成分，一般按照说明书要求添加。2)HEPES液:是一种弱酸,能防止培养基PH值迅速变动,可维持PH值在7.0左右.呈橘红色，生长过程变化不大.3)谷氨酰胺补充溶液在细胞代谢中起重要作用,在溶液中很不稳定，易降解，在使用前添加。一般4放置两周后大部分降解；使用终浓度:0.002mol/L；配置成100倍浓缩液，过滤除菌分装。20贮存。4)抗生素（双抗溶液）青霉素使用终浓度:100000U/L链霉素使用终浓度:0.1g/L配置方法:100倍浓缩液,可用培养液或PBS配置。可防止培养过程中因操作不慎导致的微生物污染。选择哪一种抗生素，剂量多少，何时加入等，与污染源、抗菌素的抗菌范围、抗菌素的稳定性等有密切的关系。细胞培养的基本操作技术体外培养细胞缺乏抗感染能力，所以防止污染是决定培养成功或失败的首要条件。即便使用设备完善的实验室，若实验者粗心大意，技术操作不规范,也会导致污染。因而,为在一切操作中最大可能地保证无菌，每一项工作都必须做到有条不紊和完全可靠。 一、培养前的准备1.准备所需培养用物品（写出物品清单）。在开始实验前要制定好实验计划和操作程序。有关数据的计算要事先做好。根据实验要求，准备各种所需器材和物品、然后开始消毒，清点无误后将其放置操作场所(培养室、超净台)内。这可以避免开始实验后，因物品不全往返拿取而增加污染机会。二、培养操作过程中要求：动作准确敏捷有序，但又不必太快；培养用液开口后应45度倾斜，不再重复使用的应立即封口；吸管不能重复使用；不能面向操作台讲话或咳嗽；不能用手触及已消毒器皿，如已接触，要用火焰烧灼消毒或取备品更换。三.操作完毕,及时清理各物品（培养操作物品的合理放置,酒精灯,包装用品,废弃物品,瓶子吸管等物品的处理）原代培养的概念：从体内取出组织或细胞的第一次培养。(原代培养是建立各种细胞系的第一步。)原代培养的优点：生物性状尚未发生很大的变化；具有二倍体遗传性，大多数细胞表现原来的细胞特性。取材基本要求及注意事项:1、取材要准、取材步骤可灵活；2、取材的组织尽快培养（可浸入培养液于冰浴或4，时间不能超过24h）；3、严格无菌操作（可用抗生素漂洗）；4、用锋利的器械减少损伤；5、血液、脂肪、杂质等尽量除去；6、原代培养尽量使用营养丰富的培养基；7、一般分化低的组织较分化高的组织易培养植块与分离细胞原代培养的材料制备过程示意图 （2）鸡胚的取材：一般为7、8日龄的鸡胚。解离释放细胞的方法一、机械解离细胞法（剪切法、吸管吹打法、过筛法）优缺点及注意事项：简单方便、所需时间少；对细胞损伤较大，应根据细胞的耐受能力来调整强度和时间。二、酶学解离细胞法： 胰蛋白酶、胶原酶等胰蛋白酶解离细胞法：主要用于消化细胞间质。也可置于4冷消化过夜。1酶学解离方法的讨论：对细胞的伤害较小（避免过度消化）；注意控制酶量、作用时间、处理温度。2、胶原酶水解结缔组织中的胶原蛋白成分，针对含较多结缔组织和胶原成分的组织。消化过程与胰酶消化类似。3螯合剂解离细胞方法EDTA-Na等，常与胰酶1：1或2：1混合使用。讨论：较胰蛋白酶缓和，对单层细胞较好；分离效果差，不易除去。3悬浮细胞培养：1、可用聚四氟乙烯外膜包被的磁棒搅动。2、可通过增加培养液的黏度来帮助细胞呈悬浮状态（给培养液中加入低浓度的透明质酸复合物或0.06%0.12%的甲基纤维素注意要点：1、培养液与培养物；2、PH值三更换培养液：提示需要更换新的培养液的因素:1.pH值下降（红变黄色）2.细胞浓度3. 细胞形态学 细胞核四周充满颗粒，细胞质呈空泡化，细胞变圆，或出现细胞与底物脱离时 。原代培养失败可能：1、分离细胞时损伤细胞；2、培养条件不合适。体外培养细胞生长类型：按照生长方式可分为黏附型和悬浮型两大类黏附型细胞：是指由它们繁衍出来的细胞只有贴附于不起化学作用的物体表面时，才能生长，生存或维持其功能的细胞悬浮型细胞：则是不必附着于固相支持物表面，而在悬浮状态下即可生长的细胞 按照培养细胞的主要形态，可将其分为几大类型：(一)上皮型细胞 (二)成纤维型细胞 (三)游走型细胞 (四)多形型细胞 (一)上皮型细胞：泛指那些外形上类似上皮细胞，大体为扁平样的培养细胞。主要形态学特征：扁平，形态较为规整，呈多角形，胞体近中央处有扁圆的细胞核；细胞之间相互衔接或呈镶嵌状紧密排列，相互拥挤呈现“铺路石样”。(二)成纤维型细胞外形与体内成纤维细胞形状相似，胞体大致呈长条形、梭形或不规则形成纤维型细胞的起源; 来源于中胚层主要形态学特征细胞呈梭形、长条形、多角形或不规则形。多数情况下，细胞之间排列疏松，有较大细胞间隙。也常见相互平行排列，呈现放射状、漩涡状等走行。(三)游走型细胞具有类似巨噬细胞样的特征。形态学特征：细胞相互分开 ；常具有胞质突起(伪足)。当细胞密度增大时，游走受限，类似上皮型或成纤维型的细胞。(四)多形型细胞；1）多形型细胞是一些形态上不规则的细胞，不规则形态由胞质突起所致。2）一般分胞体和胞突两部分。胞突为细长形。3)体外培养中最常见的是神经元和神经胶质细胞二、悬浮型细胞形态学特点：胞体始终成球形原本就以悬浮状态生长的细胞（如血液白细胞）以及某些肿瘤细胞。体外培养特点：1.培养密度可以较大，培养效率高2.传代以及收获细胞都比较容易3.不方便观察影响体外培养细胞形态学特征的主要因素；血清成分、培养液中的添加成分、培养液的酸碱度、气相环境、温度条件。体外培养细胞的形态并不完全是恒定的。可因各种因素而发生改变，包括PH、细胞密度、污染等的影响。一、培养细胞分化状态的变化1.去分化或脱分化：置于体外培养的细胞，体内的主要调节因素丧失；增殖约束逐渐取消，分化特征逐渐减弱，原本各种各样的分化细胞，逐渐失去各自的形态与功能个性，表现出某种趋同性防止细胞去分化的措施:提高接种的细胞密度(高于105个/cm2)；提高钙离子浓度(300-1500mol/L)；使用诱导分化的激素(如氢化可的松)与/或生长因子。自发转化(transformation)细胞:必然发生核型改变转化细胞的性状可随着细胞分裂传递给子代细胞二.培养细胞的增殖能力与该种细胞在体内的增殖能力相仿。只有获得永生性的肿瘤细胞才可以在体外无限制的传代。三.体外培养细胞的生长过程体外培养细胞整个生命活动可分为:一、原(初)代培养期 二、传(继)代培养期 三、衰退期一、原代培养期: 概念:从体内取出组织细胞开始培养到第一次进行传代之前的这一段时期.,一般为1-4周原代培养期特征:1)完成过渡和适应过程,恢复分裂增殖和生长发育能力.2)细胞呈现 异质性（细胞成分混杂，类型较多）.3)最接近在体时情况原代培养期细胞主要生长生物学行为:1.黏附和贴壁: 与细胞表面及固相表面所带的电荷性质 和量有关 不同细胞的黏附能力不同 黏附：数分钟至数十分钟内 贴壁：数小时或更长时间影响细胞黏附和贴壁的因素1.培养器皿表面包被某些细胞外基质成分【胶原、多聚赖氨酸（鸟氨酸）、层黏连蛋白、纤维连接蛋白(FN)等促进细胞黏附】；2. 培养液的悬浮力（黏度、培养液流动或摇晃）；3. 培养液中的离子成分及其浓度（Ca）；4. 培养液的温度 ；5. 某些生长因子。二 传代培养期:指由首次传代开始经反复传代一直到培养物开始衰退之前的全部时间。特点:1、历时时间长;2、分裂增殖活动旺盛, 生长活跃，增殖能力强的细胞处于优势;3、发生转化的概率增大;4、逐渐进入去分化状态.一代;细胞自接种至新培养皿中至其下一次再传代接种的时间为细胞的一代。每传一代细胞的生长过程分为:潜伏期,指数生长期,停滞期.潜伏期:指对传代操作所致损伤的恢复和对新环境的适应期影响潜伏期长短的因素；1）细胞种类（连续细胞系）2）接种的细胞密度（大）3)培养条件4)传代时间是否合适指数生长期判断细胞生长是否旺盛的指标1.有丝分裂指数（mototic index MI）培养物中分裂相数量占全部细胞数量的百分比。一般细胞为0.1-0.5 %，连续细胞系为3-5%。2.细胞群体倍增时间接触抑制:正常有机体细胞相互接触连接成片时,表现出由于接触而相互抑制的特征.肿瘤细胞没有接触抑制现象当细胞形成单层时，细胞变得拥挤，与培养液接触的表面区域因而减少，其分裂将停止。密度依赖性生长抑制：细胞密度增大而至的分裂抑制现象。DNA合成受限、营养供应不足、细胞代谢产物过多。停滞期也称平台期若传代不及时，细胞将因酸中毒影响下一代的生长。影响动物细胞体外生长的因素；一、营养成分和生长基质营养条件是基本条件。生长基质对培养细胞尤其是贴壁依赖性细胞是重要的二、温度条件对细胞的影响培养细胞对较低温度的耐受能力比较高温度的强高温的影响1.破坏了细胞内的酶2.能破坏细胞膜上的脂类3.影响细胞的分裂三、气相环境对细胞生长的影响O2参与细胞的能量代谢过程；CO2对维持酸碱度很重要：HCO3 /CO2缓冲对，大多数有机体细胞最适PH范围7.2-7.4四、辐射线对细胞生长的影响1.可见光1)初期可加快细胞的某些生长活动2)扰乱细胞的分裂活动3）对细胞造成损伤并使提前退化2.紫外线:能破坏细胞的遗传物质和蛋白质结构.五、影响细胞生长的其他因素1.橡胶制品：纯橡胶与硅胶毒性低，黑橡胶毒性强；2.离心处理的影响：离心力越大对细胞造成的影响越大；3.培养液的冲击力：液体流动时产生的气泡对细胞有较大的影响；4.污染对细胞的影响：微生物污染，其他细胞污染。一名词解释 :1.黏附型细胞 2. 悬浮型细胞3. 去分化或脱分化4. 原代培养期5.接触抑制(contact inhibition)6.有丝分裂指数（mototic index MI）二、填 空：1.体外培养细胞的生物学特征具有两重性：（1）它的基本生物学特性与体内的细胞相似。（2）生长环境改变，失去了在体时有机体整体的生长调节机制。2.培养细胞的外形一般与在体时明显不同;按照培养细胞的主要形态，可将黏附型细胞分为几大类型：-,-,-,-.3.影响体外培养细胞的形态学特性的主要因素有血清因素,培养液中的添加成分、培养液的酸碱度、气相环境、温度条件等4自发转化(transformation)的细胞必然发生核型转变;转化细胞的性状可随着细胞分裂传递给子代细胞5细胞在体外培养过程中除了去分化的特性之外可发生自发转化现象6体外培养细胞与固相表面亲和性的大小与细胞表面及固相表面所带的电荷性质和量有关7影响潜伏期长短的因素有-,-,-,-8、影响细胞黏附和贴壁的因素培养液的温度 、培养液的悬浮力、培养液中的离子成分及其浓度、培养器皿表面包被某些生物活性物质9. 气相环境对细胞生长的影响主要指-和-对细胞的影响.三、选择题：1. 细胞相互分开 ；常具有胞质突起(伪足)。当细胞密度增大相互连接成片时，游走受限，形状上类似上皮型细胞或成纤维型的细胞是下列那一种细胞的形态学特征。（1）上皮型细胞 （2） 成纤维型细胞 （3）游走型细胞 （4） 多形型细胞2细胞扁平，形态较为规整，呈多角形，胞体近中央处有扁圆的细胞核；细胞之间相互衔接或呈镶嵌状紧密排列，相互拥挤呈现“铺路石样”是下列哪一种细胞的形态学特征。（1）上皮型细胞 （2） 成纤维型细胞 （3）游走型细胞 （4） 多形型细胞3细胞呈梭形、长条形、多角形或不规则形。多数情况下，细胞之间排列疏松，有较大细胞间隙。也常见相互平行排列，呈现放射状、漩涡状等走行 是下列哪一种细胞的形态学特征。（1）上皮型细胞 （2） 成纤维型细胞 （3）游走型细胞 （4） 多形型细胞4自发转化(transformation)细胞特征有那些（多选）（1）必然发生核型改变（2）不一定发生核型改变.（3）转化细胞的性状可随着细胞分裂传递给子代细胞（4）转化细胞的性状不随着细胞分裂传递给子代细胞5每传一代细胞的生长过程分为:（1）潜伏期;（2）原代培养期（3）指数生长期;（4）传代培养期（5）衰退期（6）停滞期6辐射线对细胞生长的影响主要指：（1）可见光,（2）紫外线,（3）X射线、（4）射线、（5）射线7、防止细胞去分化的措施（多选）:（1）提高接种的细胞密度（2）降低接种的细胞密度（3）提高钙离子浓度 （4）降低钙离子浓度8、原代培养期特征（多选）:（1）完成过渡和适应过程（2）细胞呈现异质性（3）最接近在体时情况 （4）恢复分裂增殖和生长发育能力三简答题：1. 上皮型细胞的起源及主要形态学特征2. 成纤维型细胞的起源及主要形态学特征3. 简述体外培养细胞的生长类型。4. 悬浮型细胞的形态学特征及体外培养特点4. 防止细胞分化,促进细胞增殖的措施5. 简述体外培养细胞的生长过程分期6. 影响细胞黏附和贴壁的因素7. 传代培养期的概念及特点 细胞系与细胞克隆1、细胞系（cell line）：原代培养物经首次传代后即成。2、有限细胞系（finite cell line）：不能继续传代或传代数有限。3、连续细胞系（continuous cell line）即连续传代的细胞系。4、细胞株（cell strain）通过选择法和克隆形成法从原代培养物或细胞系中获得的具有特殊性质和标志的培养物传代培养（passage）概念：无论是否稀释，将细胞从一个培养瓶转移或移植到另一个培养瓶。（一）传代培养的方法1、从生长器皿上解离细胞的方法：从1-8依次加深。2、单层培养细胞的一般传代步骤: 倒出旧液-PBS洗涤-胰蛋白酶消化-吸出消化液-加入培养液吹散细胞-计数-稀释-培养3、悬浮细胞的传代培养离心法：离心后去上清，加培养液，吹打，传代。直接传代法：将细胞慢慢沉淀，将上清吸去1/2-2/3，加培养基，传代。(二) 传代培养的注意事项1、传代时机与传代培养的细胞密度：细胞没生长到足以覆盖的瓶底壁的大部分表面前，不要急于传代。2、传代数或代数：指对培养物传代的次数。3、尽量少传代，避免转化。二、细胞系的建立正常细胞系建立的程序包括：原代培养、第一次传代、常规传代和冻存、复苏等阶段。 细胞系的维持1、细胞系档案要记录好：组织来源、培养基要求、传代时间等；2、传代换液有规律，否则会引起生物学特性改变；3、多种细胞维持传代，要防止交叉污染；4、要有充足的冻存储备，防止因污染造成绝种；另外，细胞暂时不用，最好冻存，以免老化或性状改变。三 、细胞克隆细胞克隆（clone）是指单个细胞通过有丝分裂形成的细胞群体，他们的遗传特性相同。细胞克隆化培养（cell cloning culture）：又称单个细胞分离培养，是指将单个细胞在一定支持物上增殖培养而产生细胞群落的过程。细胞的培养污染和排除一、污染的途径、对细胞的影响；二、污染的预防及排除。污染：培养环境中混入对细胞生存有害的成分（微生物、化学物）或造成细胞不纯的异物（非同种其它细胞）。第一节 污染途径一.空气操作室与外界隔离不严或消毒不充分 ；净化工作台使用过久，滤板未定期更换或长久不更换，滤气受尘埃堵塞 ；春夏季南方地区多雨，空气湿度大，含菌量多 。二. 清洗消毒 培养用物品、材料洗刷不净，培养用液和器材灭菌不彻底也会引入微生物和有毒物质。 三.操作器材和溶液使用前未仔细检查是否污染过 ；吸管、刀、剪沾染微生物；瓶口封不严；培养两种以上细胞，使用同一吸管或营养液。四.血清被支原体和病毒污染。 五. 组织 手术中污染；组织本身带菌；用碘酒后擦拭不净造成碘污染。第二节 污染对细胞的影响增殖缓慢、分裂相减少、粗糙、轮廓增强。停止增殖，分裂相消失，胞质中出现大量堆积物，变圆或崩溃从瓶壁脱落。 污染物不同，对细胞的影响不同。一、真菌污染倒置显微镜下可见丝状、管状或树枝状的菌丝纵横交错在细胞之间或培养基中，有的呈链状排列。 真菌污染后，细胞生长变慢，但最后由于营养耗尽及毒性作用而使细胞脱落死亡。 二、细菌污染培养液变黄，混浊；48h以内很明显; 细胞很快崩解死亡。镜下可见菌体。污染后细胞发生病理改变，胞内颗粒增多、增粗，最后变圆脱落死亡，造成试验失败和细胞株(系)丢失。 三、支原体污染支原体是介于细菌与病毒之间能独立生活的最小微生物，最小直径0.2m，一般过滤除菌无法去除它 。光镜下难以看清它的形态结构，电镜下可见 。对细胞的影响多数无明显变化，或有微细变化却因传代或换液而缓解。 增殖缓慢、部分细胞变圆、从瓶壁脱落。细菌、酵母、真菌、霉菌和支原体是细胞培养的常见污染物如何判断是否存在微生物污染，一般说来，微生物污染具有以下特点： 1)pH值突然改变：细菌污染pH值大都降低、酵母污染pH值很少改变，只有污染很严重时才会改变，真菌污染pH值会上升。如果48h内pH值急剧变化，应考虑细菌污染的可能。2) 培养基出现云雾状，有时在表面一片薄层云雾或泡沫，或细胞表面长出点状物，当移动培养瓶时消失。 3)如怀疑支原体污染，可用Hochest33258染色，荧光显微镜观察。 第三节 污染的预防和排除 一、污染的预防1.器皿准备中的预防主要包括以下方面：检查超净工作台滤网检查培养器皿是否有消毒标志。 检查新配制的培养液操作前提前半小时启动超净工作台及紫外消毒灯操作者应消毒双手和戴口罩2.操作过程中的预防 不宜过早开瓶；开瓶后瓶口不能与风向相逆，不再使用的培养液应立即封闭瓶口,不允许触及器皿的无菌部分注意火焰烧灼及火焰附近工作；应专管专用； 培养的细胞勿过早暴露于空气中；操作时不准交谈、咳嗽；操作完毕应整理好工作台面，并消毒擦拭工作面，关闭超净工作台。 其他方面的预防应及早冻存有价值的培养物定期更换培养系统中的抗生素，或尽可能不用抗生素； 对新引进的细胞株应加强观察，防止外来的污染源； 定期清洁消毒CO2培养箱二、污染的排除1抗生素排除法加入510倍于常用量的抗生素后作用2448小时，再换入常规培养液 。抗生素对杀灭细菌较有效。联合用药比单独用药效果好。预防用药比污染后再用药效果好。 2.加温除菌 将受支原体污染的细胞置于41中作用510小时(最长可达18小时)以杀灭支原体。但对细胞有不良影响 ，需预试验。3.动物体内接种 接种在同种动物皮下或腹腔，如肿瘤细胞。4.与巨噬细胞共培养 吞噬微生物并将其消化。1.污染的概念2.污染的途径主要有？3.在细胞培养过程中如何预防污染4.污染排除的方法细胞的冻存，复苏与运输发展史1776年，Spallanzani最早发表：“冷”处理对马精子生命活动影响。1900年前后，基本肯定生物成分能够在零下温度贮存的事实。 1949年至1960年 称“甘油时期”1959年：二甲基亚砜(DMSO） 一、培养物的冷冻保存与复苏1、概念：1）冷冻保存：是将体外培养物悬浮在加有或不加冷冻保护剂的溶液中，以一定的冷冻速率降至零下某一温度，并在此温度下对其长期保存的过程。2）复苏：是以一定的复温速率将冻存的培养物恢复到常温的过程。3）细胞内冰晶的损伤：因细胞内部结冰而致的细胞损伤被称为细胞内冰晶的损伤。4）溶质损伤：保存溶液溶质浓度增高而致的细胞损伤被称为溶质损伤。2、影响冷冻效果的因素：1）冷冻速率 细胞冷至-5-15之间时，细胞外溶液先出现结冰而细胞内仍保持未结冰状态，细胞内未结冰的水分子会向细胞外流动。冷冻速度不同外渗情况不同。1）速度慢，细胞内水分外渗多，细胞内溶质浓度增高,细胞内不发生结冰；2）速度快，细胞内水分没有足够的时间外渗，随着温度的下降会发生细胞内结冰；3）非常快(即超快速冷冻)，则细胞内形成的冰晶非常小或不结冰而呈玻璃状凝固。不同细胞的最适冷冻速率不同。例如，小鼠骨髓干细胞、酵母、人红细胞的最适冷冻速率分别为1.6/min、7/min和200/min“慢速冷冻”或“快速冷冻”是相对的。细胞与细胞之间最适冷冻速率可在1.63000/min之间变动。对一种细胞进行冷冻前，要知其最适冷冻速率2.冷冻保存温度液氮温度(-196)是目前最佳冷冻保存温度。3.复温速率复温速率是指在细胞复苏时温度升高的速度。一般来说复温速度越快越好。常规的做法是，在37水浴中，于12min内完成复温。 4.冷冻保护剂冷冻保护剂是指可以保护细胞免受冷冻损伤的物质冷冻保护剂可分为渗透性和非渗透性两类。渗透性冷冻保护剂一般是一些小分子的物质。该类保护剂主要包括甘油、DMSO、乙二醇、丙二醇、乙酰胺、甲醇等DMSO在常温下对细胞的毒副作用较大。在4时，其毒副作用大为减弱DMSO，不需高压灭菌。在常温下，DMSO对人体有毒。冻存时DMSO平衡应在4下进行。非渗透性冷冻保护剂不能渗透到细胞内，一般是些大分子物质。该类保护剂主要包括聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、蔗糖、聚乙二醇、葡聚糖、白蛋白及羟乙基淀粉等。冷冻保存方法1、非玻璃化冻存利用各种温级的冰箱分阶段降温至-70-80或者是利用降温仪以及