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有功能的人类乙型肝炎病毒聚合酶的提纯与表达摘要 目的 ：排除细胞质的因素，识别一种有效的方法，可以提炼有用的乙型肝炎病毒的聚合酶。 方法 : 完整的 HBV-POL（843个氨基酸） 的5端 用多个组氨酸标记，在大肠杆菌体内高水平表达。缓冲液溶解HBV-POL,树脂层析法提纯。大多数重组的HBV-POL被洗提在有NP-40存在的100mmol/l的咪唑溶液中，一种弱的洗涤剂保持HBV-POL的活性。一种还原的药剂应用在HBV-POL的提纯过程中，保护易溶解的HBV-POL免受多余的二硫化物的粘连。 结果 :应用大肠杆菌大规模生产完整的HBV-POL。提纯的HBV-POL有稳定的反转录酶和DNA聚合酶的活性。提纯的蛋白高纯度且有反转录酶的活性。结论 ：应用纯净的方法大规模生产HBV-POL,便于结晶化，详细研究其结构和机制。 这种提纯方法的能力能获得人类HBV-POL的一种酶地活跃形式 ，有助于研究药物去治疗人类的慢性肝炎。介绍HBV感染是全球的公众健康问题，据估算全球有350-400百万人被慢性感染，有很大一部分人最后患了威胁生命的肝的疾病，如肝硬化、肝癌或其他疑难杂症。HBV自我复制通过与翻译相反的步骤，用聚合酶根据自己的基因组被编码。HBV-POL是个多功能蛋白质，有启动蛋白的活力，以及DNA聚合酶和反转录酶的活性，有RNA- H酶活性，但它是短的校对活性。大多数合格的治疗慢性肝炎的药物都是核苷酸反转录酶的抑制剂，就是把HBV-POL当作靶子。几十年用这种方法治疗效果已经受限，因此急需一种更快更容易更高效的药物去治疗这种病。HBV-POL这种酶在不同的系统中表达以及对它大量的提纯是困难的。基于这些问题，治疗药物的发展不能取得令人满意的进步，这种酶的生物研究被引领。有一些群体成功的使这种酶在体外表达，并且表达完整，这种表达需要DDDP和RDDP的活性。人类的HBV-POL被表达是在体外的兔子网状细胞系统中进行的，体外表达的这种酶只有DDDP活性，没有RDDP活性。在大肠杆菌中有RDDP活性，它与一种蛋白结合了。有酶活力的HBV-POL在大肠杆菌被获得，但得需要GRP94的一种聚合酶陪同表达才行。但是这种没有分子伴侣陪同表达，稳定且大规模的完整HBV-POL被表达出来还没有人报道过。在这项研究中，HBV-POL携带六个组氨酸在大肠杆菌中被表达。HBV-POL有大约2.5%的半胱氨酸剩余，是一个大分子，因此，这种蛋白被期望能进入体内。基于这个原因，所有的溶解产物被高浓度的SDS溶解。降低剂量进入体内，然后SDS被一种弱的洗涤剂替换在洗的过程中，最后靶蛋白被纯化。纯化的HBV-POL有DDDP和RDDP的活性。这是第一次在大肠杆菌中没有分子伴侣或者其它助手HBV-POL得以表达。这种酶可能有助于药物发展在治疗CHB中。原料和方法质粒构造肝组织来自慢性乙型肝炎的携带者，并有表面抗原，此患者曾做过切除手术。肿瘤组织被解剖，切成小块放在液氮中备用。组织中的DNA被提取。HBV-POL相关的的东西被加强，使用更专一的聚合酶。对于一个完整的的P基因需要：CPNotIF01:GTTGCGGCCGCATAATGGCCCTATCTTATCCPBstBIR01: ATTTTCGAATTCTCACGGTGGTTTCCA大肠杆菌的转化质粒pTrcHis-A-Pol被化学转变在有决定权的DH5的细胞中，此细胞由Real Biotech公司供给。IPTG加入到5ml的过夜的大肠杆菌中，最终浓度为1mmol/L，分别孵化4、8、12、16小时, 分别保存在 18, 24,30, 37 和42下。 离心法获得细胞，在裂解缓冲液中混匀。蛋白质的表达水平由反-Xpress抗体决定。组氨酸标记的HBV-POL的表达与纯化被转化的细胞在100mL的LB肉汤中培养，直到培养达到OD600 0.6-0.8。添加IPTG使最终浓度为1mmol/L，在18下孵化8-10小时，并不断摇晃。感应的细胞通过离心法获得，在2000g 、20 min、 4条件下. 裂解-缓冲液体积与细胞小粒的比率为4：1.溶菌液在室温下孵化30分钟，超声波降解10 10 s。在每一个音波下样本在冰中冷却5-10s。悬浮液在室温下离心30min，20 000 g 。悬浮在表面的物质需要转移到Ni-NTA树脂柱中，加入16ml的平衡缓冲液相平衡（和前面没有加裂解酶的裂解液组分相同）。树脂和浮在表面的溶菌液完全并缓和的混合 ，室温保存45-60分钟。树脂用8mL的洗涤缓冲液洗6-8次（50mmol/L磷酸盐缓冲液，pH 8.0, 0.5 mmol/L NaCl, 1% NP-40，10 mmol/L咪唑，20 mmol/L 2-mercaptoethanol，1 Roche蛋白质抑制剂混合物）。用6 mL E-50,E-75,和 E-100 洗提缓冲液洗提HBV-POL片段（50 mmol/L磷酸盐缓冲夜, pH 8.0,0.5 mmol/L NaCl, 1% NP-40, 1 Roche蛋白质抑制剂混合物），将DDT加到收集管中使最终浓度为5 mmol/L。E-50, E-75,和E-100缓冲液中咪唑的浓度分别为50 mmol/L, 75 mmol/L and100 mmol/L,获得小片段洗提的HBV-POL，保存在-70。纯化的蛋白样品的浓度由一个BCA测试决定，以牛的血清白蛋白为标准。Anti-反转录酶多克隆抗体的准备在全长的聚合酶纯化前需准备RT多克隆抗体（数据不展示）。重组的RT（304-693个氨基酸）由大肠杆菌中提取。五十个微小纯化的RT和Freunds完全辅佐物注射到小鼠的皮下。另一个50 g纯化的RT和Freunds在第一次注射后的两周注射。在第二次注射两周后处死小鼠，为了取血清中的anti-RT多克隆抗体。用ELISA检测抗体滴定量和RT肽的比率，应大于1：32000.SDS-PAGE, dot blot 和蛋白免疫印记法分析全部的溶菌液和其他的洗提部分在95下加压5分钟。蛋白质用SDS-PAGE法分离。Gels 用Coomassie Blue染色。对于bot blot分析法，每个样本取1mL滴到硝化纤维膜上，此膜第一步需用稀释的1/4000anti-Xpress抗体和goat-anti-mouse共轭碱性磷酸酶处理。对于蛋白免疫印记分析，蛋白质转移到膜上，第一步需用稀释的1/4000anti-RT和goat-anti-mouse共轭碱性HVB-POL的体外转录与翻译的表述重组的质粒pT7-Pol用Qiagen Midiprep DNA纯化装备纯化。体外转录与翻译需用连接网状细胞的溶菌液系统TNTT7。两个小质粒DNA模板转录并翻译成蛋白质，无论有没有S35标记的甲硫氨酸，在30、75分钟的条件下都能发生反应。加入0.1 mg/mL环己酰亚胺（用以检验聚合酶活性）或SDS样缓冲液（用以检验翻译效率）后体外翻译就停止了。体外翻译的蛋白质通过4%-12% SDS-PAGE分离开，在放射自显影之前先干燥。DNA聚合酶活性和RT活性检测DDDP 和 RT/RDDP的检测可以通过合成DNA，使用poly (dA) oligo (dT)12-18 和 poly (rA) oligo (dT)12-18作为引物，分别反应。标准的酶反应包括50 mmol/L Tris-HCl pH 7.4, 50 mmol/L KCl,10 mmol/L MgCl2, 1 mmol/L DTT, 0.01% Nonidet P-40,50 ng同聚物模板poly(dA) oligo(dT)12-18用来检测DDDP的活性，poly(dA) oligo(dT)12-18用来检测RDDP的活性，2 mCi-32PdTTP(3000 Ci/mmol)。为了检测RDDP的活性，反应中要加入RNA酶和无RNA酶的水。加入0.5mg的纯化的HBV-Pol或5 L来自TNT-T7连接的网状细胞的溶菌产物于反应液中。来自网状细胞溶菌酶系统的DNA聚合酶活性将通过加入60 mmol/L的aphidicolin和1 mmol/L NEM被抑制。37孵育75分钟后，在0.5%SDS存在的情况下加入0.2mg/ml的蛋白激酶K来停止反应。继续孵育20分钟，印迹到Whatman DE81滤纸。滤纸用0.5 mol/L Na2HPO4洗三次，蒸馏水洗一次。放射性用液体闪烁记数法测得，使用Packard Tri-Carb Series2300液体闪烁记数器。结果表达，吸入最优化和HBV-Pol in E. coli的纯化靶蛋白高表达水平对于在亲合性套色板中获得理想的洗提结果是至关重要的。为了获得最高的表达水平，实验在各种条件下进行。重组HBV-Pol是一个95kDa的大分子一个完整的HBV-Pol和一个5kDa的标记片断，表达要在低温和或长或短的反应时间下进行。不同的蛋白质在低温下变得稳定，包含物的合成是受调控的。降低反应介质的温度会降低中间产物结合的机率，允许一级蛋白和折叠蛋白有更多时间重新折叠成自身的、可溶的三级结构。获得充足的重组聚合酶的另一个至关重要的因素是恰当的感应时间。表达的蛋白质的数量随着感应次数而变化。HBV-POL水平在转化了重组质粒pTrcHis-A-Pol的大肠杆菌中被检测。HBV-POL表达水平在感应8小时时达到最高，与那些或长或短的的时间相比。在这种温度条件下，最低的温度18，曾做过测试，测试显示了最高的表达水平，与高温相比较。根据那些数据，在整个实验的条件下，HBV-POL表达得以实施。对于HBV-POL的纯化，一个改变本性的纯化方案被应用。根据以前的裂解数据，在4弱洗涤剂存的情况下，包括主体没有被溶解，在固定的过程中降低了靶蛋白的数量。一个更强的洗涤剂SDS被应用在裂解过程中，为了溶解包含在主体中超表达的HBV-POL和改变一些在全部溶菌液中蛋白酶的本性。HBV-POL片段在洗提缓冲液（50, 75, 100 mmol/mL咪唑）中被洗提。数据3A显示，一个显著的HBV-POL条带在SDS-PADE中被发现,通过蛋白质免疫印记法分析更证实了纯化结果。DDT，一个更强的还原化学剂对于长期蛋白贮藏是适合的，曾被应用到HBV-POL纯化的许多实验中，以一个高浓度的状态。尽管在目前的研究中，强的洗涤剂容易使镍松脂减少，2-mercaptoethanol在所有的步骤中被使用除了洗提。为了长期保存，DDT是最后加入到HBV-POL片段中的。SDS-PAGE 和Western blotting显示了高效率的纯化效果。denaturing-renaturing在纯化过程中的参与展示，纯化重组的HBV-POL是稳定的，单一成分的的产物。纯化的HBV-POL达到了5 mg/mL。还有很多关于在真核系统中HBV-POL纯化与不完全纯化的报告。在目前的研究中，重组的HBV-POL在网状细胞溶菌液系统中被表达，在活性检测中作为积极控制。体外表达的蛋白产物用35S-甲硫氨酸标记，在数据3C中显示。大约95-kDa HBV-Pol 蛋白质被发现，从HBV-Pol-ORF核苷酸序列预言中。纯化的HBV-POL的特性为了估量纯化的HBV-POL的酶活性，对于DDDP和RDDP酶活性的检测需用提纯的的HBV-POL和HBV-POL pT7质粒，并且在网状细胞溶菌液系统中表达，作为一个负控对于P-R酶活性的检测。对于P-R酶活性的检测P-E溶剂作为一个负控因素。P-R酶活性和P-E酶活性相比较。在反应条件下P-R有弱的DDDP活性，更高的RDDP活性。同聚物底层模板在许多组的酶活性检测中被使用。活性检测结果显示，P-R和P-E有更高的RDDP活性相对弱的DDDP活性。这个样本在以前不完全纯化的HBV-POL中被观测到。讨论人类HBV-POL对于HBV基因组DNA复制是至关重要的。在DNA合成中有弱的RDDP活性和高的DDDP活性。治疗CHB，美国有六种药物，其中lamivudine, adefovir dipivoxil, entecavir and telbivudine是HBV-Pol的抑制剂。对于CHB疗法，HBV-POL DNA复制一直是一个主要的目标。然而，影响人类的HBV-POL，还不能在普通寄主中稳定而且大规模的不同表达，比如大肠杆菌或者酵母。尽管重组的HBV-POL可以在不同系统被表达。和用不同的方法纯化，但是获得高纯度高作用的HBV-POL，并且没有分子伴侣陪同表达一直是一个难题。因此，我们发展一个可靠的纯化方法，去进一步研究HBV-POL的活性。对于多功能蛋白的主要困难，像HBV-POL在不同的系统表达和纯化中是不稳定的。人类HBV-POL表达过程中主体形成，不仅在大肠杆菌中，也可以在真核表达系统中实现。为了和这个保持一致，靶蛋白被呈现在全部的裂解液中，小颗粒不浮在裂解缓冲液的表面。我们初步的研究显示了表达人类HBV-POL在纯化的条件下是容易退化的，甚至在蛋白酶抑制剂存在时。Choi et al9在酵母表达系统中也观察到了这个现象。因此，成功的大规模纯化人类HBV-POL的关键点是溶解和靶蛋白的溶解。到目前为止，无人报道过HBV-POL高水平的表达与纯化在大肠杆菌系统中，而我们纯化的蛋白到达了5 mg/mL.这是一个更高的数据与Choi et al9相比较。在这个研究中，我们试着以下策略的应用，获得了高水平的重组HBV-POL。第一，末端6个组氨酸的标记便于迅速纯化，Xpress抗原决定簇在HBV-POL的N末端融合便于被初级抗体anti-Xpress识别。第二，靶蛋白最大限度的表达需降低感应温度。第三，对于细胞裂解纯化，强浓度的的裂解剂被弱的替换。第四，一个高浓度的还原剂应用到纯化过程中，保持HBV-POL可溶的形式，组织二硫化物粘合物形成，因为大约有2.5%的HBV-POL氨基酸剩余，是半胱氨酸。据说，由于细胞质的因素，HBV-POL结构上的和生物化学上的研究是复杂的，比如HSP9018, HSP603，还有其他因素在纯化的过程中。然而，我们发展了一种新方法可以大规模的纯化有完全活性的HBV-POL，除去细胞质因素，通过在纯化过程中盐的调整。粘合步骤中改变本性的条件下，从全部的溶菌液中分离靶蛋白。溶菌液中有1%的SDS存在，不溶的人类HBV-POL被迅速的溶解。从大肠杆菌中释放的蛋白酶是没活性的，在SDS变性的步骤中。可溶的HBV-POL从镍树脂柱中洗提，用弱的洗提剂和还原剂存在的缓冲液。在洗提过程中SDS被NP-40替换。为了防止靶蛋白被氧化，在降低的状态下保持半胱氨酸剩余，在洗提的全程过程中应用高浓度的还原剂。在这项研究中，大肠杆菌的表达系统中大规模的生产有功能的并且完整的人类HBV-POL是成功的。这种纯净形式的重组蛋白的可利用性，便于HBV-POL的结晶化和结构机制的详细分析，大量的有功能的人类HBV-POL的可利用性有助于高产的筛查检测药物的