酶工程-题库

酶工程酶的定义及其本质：指一类具有高效率的特异性的生物催化剂。酶是具有催化活性的：蛋白质(enzyme),核酸(ribozyme),或脱氧核酸(deoxyribozyme). 酶工程：它是一项利用酶、含酶细胞器或细胞作为生物催化剂来完成重要化学反应，并将相应底物转化成有用物质的应用型生物高新技术。 1971年，美国，第一届国际酶工程会议，确认：酶工程的核心内容酶的生产与应用主要涉及：酶的产生；酶的分离纯化；酶的固定化；酶分子的定向改造与修饰；酶生物反应器；酶的应用。第1章 酶的命名和分类国际系统分类法及编号（EC编号）系统编号方法是将每一种酶用4个数字编号，中间以“.”隔开。第一个数字表示反应性质，分六大类，用1、2、3、4、5、6表示；第二个数字表示亚类，根据底物被作用的基团或键的特点标号；第三个数字表示亚亚类，更精确反应了所催化反应底物或反应物的性质第三个数字表示亚亚类下的个别酶的顺序号，一般按酶的发现先后次序进行排列。1961年国际酶学委员会（Enzyme Committee, EC）根据酶所催化的反应类型和机理，把酶分成6大类：1氧化还原酶，2转移酶，3水解酶，4裂合酶，5异构酶，6合成酶酶的组成：单纯酶，结合酶（全酶）=酶蛋白+辅助因子辅助因子：辅酶，辅基，金属激活剂（金属离子作为辅助因子）酶的催化专一性主要决定于酶蛋白部分。辅助因子通常是作为电子，原子或某些化学基团的载体。酶的分子结构：活性部位和必需基团必需基团：这些基团若经化学修饰使其改变，则酶的活性丧失。活性部位：酶分子中直接与底物结合，并和酶催化作用直接有关的部位。(结合基团专一性，催化基团催化性质)维持酶的空间结构酶活性中心特点：1）活性中心的某些功能基因是酶的必须基团。2）活性中心只占酶分子的很小一部分3）酶的活性中心是一个三维实体4）酶的活性中心并不是和底物的形状正好互补的5）酶的活性中心是位于酶分子表面的一个裂缝内6）酶与其专一性底物的结合通过次级键实现的酶催化作用的特点：温和性，专一性，高效性，可调性酶含量的调节（合成和降解），酶活性的调节 共价调节； 别构调节；（协同效应，同/异促效应）；反/前馈调节；激素调节；同工酶调节第二节 酶反应动力学1. 酶活力与酶促反应速度酶活力：在一定条件下，酶催化某一反应的反应速度（一般测初速度）。酶促反应速率：单位时间、单位体积中底物的减少量或产物的增加量。 单位：浓度/单位时间米氏方程米氏常数的意义：Km 称为米氏常数，是当反应速率为最大反应速率一半时的底物浓度，单位为浓度单位。 1.Km是酶的特征性常数之一，只与酶的性质有关，与酶的浓度无关；不同的酶其Km不同。但指在一定的温度、pH、离子强度、一定的底物存在下而言的。 2.Km表示酶与底物之间的亲和程度，Km越大，表示亲和程度越小，酶的催化活性越低； Km越小亲和程度大，酶的活性越高。 3.Km值可帮助判断某一代谢的方向及生理功能。催化可逆反应的酶，对正逆两个方向反应的Km常常是不同的。测定这些Km的大小及细胞内正逆两向的底物浓度，可以大致推测该酶催化正逆两向反应的效率；这对了解酶在细胞内的主要催化方向及生理功能具有重要的意义。4. 判断酶的最适底物。 有的酶可作用多种底物，因此对每一个底物都有一个Km值，Km最小的那个底物为该酶的最适底物或天然底物。 5.测定不同抑制剂对某个酶的Km及Vmax的影响，可区别抑制剂是竞争性的还是非竞争性的抑制剂。 KM与VmaX的算法影响酶促反应速度的因素：底物浓度，酶浓度，温度，pH值，激活剂，抑制剂抑制剂的分类：不可逆抑制作用：1.非专一不可逆抑制剂2.专一性不可逆抑制剂可逆抑制作用：1.竞争性抑制作用2.非竞争性抑制作用3.反竞争性抑制作用4.线性混合型抑制作用。Ks型不可逆抑制剂：根据底物的化学结构而设计的抑制剂，具有和底物类似的结构，可以和相应的酶相结合，同时所带活泼化学基团化学修饰酶分子中必需基团从而抑制酶的活性。这种抑制剂是通过其对酶的亲和力而对酶进行修饰标记的，所以又称亲和标记试剂。Kcat型不可逆抑制剂（自杀性底物）：具有与天然底物相类似的结构，本身也是酶的底物，被酶催化后，潜伏性的反应基团因酶的催化而暴露或活化，作用于酶的活性中心或辅基，使酶被共价修饰而失活。第三节 酶活力及其测定酶活力（enzyme activity）又称酶活性，是指酶催化某一化学反应的能力。酶活力大小就是指在一定条件所催化的某一化学反应速度的快慢，即酶催化的反应速度越快，酶活力越高，反之则表示该酶活力低。 常用的酶活力单位有三种： A. 国际单位 (IU)这种单位是由国际酶学委员会规定的。 在标准条件(25、最适pH、最适底物浓度)下，酶每分钟催化 1 mmol 底物转化为产物所需要的酶量，定义为1个国际单位 (IU)。 B. Katal是由国际酶学委员会于1972年规定的一种新单位在最适条件下，每秒钟能使1mol/L 底物转化为产物所需要酶的量定义为 1个Kat 。 1 Kat = 60106 IU1 IU= 1mol /L min=1/60 mol /L s=1/60 Kat= 16.6 nKat C. 自定义的活力单位指每毫克酶蛋白所含的酶活力单位数比活力是酶制剂纯度的常用指标 比活力越大，表示酶越纯转换数 :表示酶的催化中心的活性，指在一定条件下每秒钟每个活性中心或每个酶分子转换底物的分子数。 Vm=k3 /Et 转换数=k3=Vm/Et 第二章 产酶微生物的分离和选育产酶微生物工业化要求:产酶量高，酶性质符合要求最好是分泌型的胞外酶非致病菌,不产生毒素菌株稳定,不易退化和感染噬菌体原料廉价,发酵周期短,易培养提取产酶微生物的分离和选育调查研究查阅资料设计试验方案（确定采集样品的生境）采样（确定特定的富集条件）平板分离（确定培养基及可能的检测方法）原种斜面（确定发酵培养基础条件）大致步骤初筛（1株1瓶）复筛（1株35瓶）结合初步工艺条件摸索再复筛（1株35瓶）菌株35株单株纯种分离投入生产：生产性能试验符合工业生产要求，毒性试验符合安全性要求，菌种鉴定菌种保藏产酶微生物的分离和选育工业微生物育种方法：诱变育种，杂交育种，基因工程育种第三章 酶的生物合成与发酵生产(一) 酶合成调节的类型 1.诱导 (induction) 凡能促进酶生物合成的现象称为诱导。 组成酶：细胞固有的酶类。 诱导酶：是细胞为适应外来底物或其结构类似 物而临时合成的一类酶。既可以是酶的底物，也可以是底物的结构类似物，或底物的前体物质。 2. 阻遏 (repression) 能阻碍酶生物合成的现象称为阻遏分解代谢物阻遏(catabolite repression)指细胞内同时有两种分解底物（碳源或氮源）存在时，利用快的那种分解底物会阻遏利用慢的底物的有关酶合成的现象。分解代谢物的阻遏作用，并非由于快速利用的甲碳源本身直接作用的结果，而是通过甲碳源（或氮源等）在其分解过程中所产生的中间代谢物所引起的阻遏作用。反馈阻遏(feedback repression)酶催化作用的产物或代谢途径的末端产物使该酶的生物合成受阻的过程。调节基因(regulator gene)：常位于调控区的上游，可产生一种组成型调节蛋白(regulatory protein) 调节蛋白是一类变构蛋白，有两个结合位点：操纵基因；效应物。分为两种：1）阻遏物，没有诱导物时与操纵基因结合 2）阻遏物蛋白，只有在辅阻遏物存在时才与操纵基因结合（二）基因调控理论 Jacob and Monod的操纵子学说（operon theory） 操纵子：原核生物中，由几个功能相关的结构基因及其调控区组成的基因表达的协同单位。操纵子：1.结构基因（编码蛋白质）2.控制部位(操纵基因，启动子)酶生物合成的调节基因转录水平的调节是微生物调节酶合成量的重要机制。意义：通过阻止酶的过量合成，节约生物合成的原料和能量。提高酶产量的策略（一）条件控制1. 添加诱导物诱导物分为4类：1）酶的作用底物：淀粉，乳糖2）酶作用底物的前体3）酶的反应产物：纤维素酶的产物纤维二糖（一般为胞外水解酶）4）酶的底物类似物或修饰物：IPTG2. 降低阻遏物浓度分解代谢物阻遏 1）尽量使用非阻遏性碳源（果糖，葡萄糖）2）采取流加方式限制阻遏性碳源；反馈阻遏1）从培养基中去除终产物2）添加阻止产物的抑制剂3. 促进分泌表面活性剂，增加细胞通透性4. 添加产酶催进剂植酸钙镁，聚乙烯醇，醋酸钠（二）菌种选育（一劳永逸）1.改良育种 (1) 使诱导型变为组成型选育组成型突变株；减少酶合成对诱导物的依赖性，突变发生在调节基因，使它不能形成阻遏物或失去了结合阻遏物的能力。(2)使阻遏型变为去阻遏型；获得在引起阻遏的条件下酶的产量也达到无阻遏水平2. 基因工程育种（1）改造调节基因（2）增加结构基因的拷贝数（3）将目标基因转移到宿主细胞表达第二节 酶发酵动力学 细胞生长动力学：在分批培养(batch culture)过程中，细胞生长一般要经历延迟期、指数生长期、减速期、静止期和衰亡期5个阶段。液态发酵方法：分批培养：Batch culture在发酵起始前，将菌种和所需的原料全部投入发酵罐，然后在合适的条件下完成发酵过程。补料分批培养：Fed-batch culture指在分批培养的过程中补充易耗养料的工艺。连续培养：Continuouse flow culture连续发酵过程中，生物反应器是一个开放系统，通过连续补料加入无菌营养液，又不断地将发酵液移去。 二、产酶动力学 （一） 酶生物合成的模式在分批培养过程中，根据酶的合成与细胞生长之间的关系，可将酶的生物合成分为3种模式，即： 生长偶联型:同步合成型： 酶的生物合成与细胞生长同步。特点：酶的合成可以诱导，但不受分解代谢物阻遏和反应产物阻遏。当去除诱导物、细胞进入平衡期后，酶的合成立即停止，表明这类酶所对应的mRNA很不稳定。中期合成型： 酶的合成在细胞生长一段时间后才开始，而在细胞生长进入平衡期以后，酶的合成也随着停止。特点：酶的合成受产物的反馈阻遏或分解代谢物阻遏。 所对应的mRNA是不稳定的。部分生长偶联型延续合成型非生长偶联型 滞后合成型：只有当细胞生长进入平衡期以后，酶才开始合成并大量积累。许多水解酶的生物合成都属于这一类型。特点：受分解代谢物的阻遏作用。所对应的mRNA稳定性高。酶生产中最理想的合成模式：延续合成型：发酵过程中没有生长期和产酶期的明显差别。细胞开始生长就有酶的产生，直至细胞生长进入平衡期后，酶还可以继续生成一段时间。 对于：同步合成型：提高对应的mRNA的稳定性，如降低发酵温度。滞后合成型：尽量减少甚至解除分解代谢物阻遏，使酶的合成提早开始。中期合成型：要在提高mRNA稳定性以及解除阻遏两方面努力。计算：营养物浓度（生长限制基质浓度）和生长速率之间的动力学关系：Monod模型:比生长速率（1/h） （specific growth rate）max：最大比生长速率（1/h）S：营养物浓度（生长限制基质浓度） 克/LKs：莫诺德常数或饱和常数或营养物利用常数 克/L，或 mol/L产酶动力学一般产酶动力学方程可表达为：式中 X细胞浓度(g /L) m细胞比生长速率(h-1) a生长偶联的比产酶系数(IU/g) b非生长偶联的比产酶速率(IU/(gh) E酶浓度(IU/L) t时间(h) 第四章 酶的分离与纯化酶分离纯化的一般流程1）预处理（pretreatment）包括发酵液处理和细胞破碎等2）初步纯化（rough fractionation）除去与目的产物性质差异很大的杂质,盐析，等电点沉淀和有机溶剂沉淀等3）高度纯化（fine fractionation除去与产物性质相似的杂质,层析，电泳法等4）浓缩与干燥（concentration and desiccation使酶与溶剂分离的过程,旋转蒸发，透析，超滤和冷冻干燥等。第一节 酶的分离一、发酵液预处理二、细胞破碎（细胞破碎方法）三、酶的提取:把酶从生物组织或细胞中以溶解状态释放出来的过程，以供进一步从中分离纯化所需要的酶 提取目标：a. 将目的酶最大限度地溶解出来，尽量少的杂质从原料中引入溶液。 b. 保持生物活性提取方法：（一）盐溶液提取:盐溶（salting in）（二）酸、碱溶液提取:胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶，0.12mol/L 硫酸提取,pH远离等电点、防止蛋白变性（三）有机溶剂提取:与脂结合牢固或分子中非极性侧链较多的酶，不溶于水，酸或碱中。 乙醇、丙酮和丁醇四、沉淀分离（根据溶解度的不同） 通过改变条件或加入某种试剂，使溶液中的溶质的溶解度降低，从而从溶液中沉淀析出。 浓缩作用和纯化作用在生物大分子制备中最常用的几种沉淀方法： 中性盐沉淀（盐析法） 有机溶剂沉淀 选择性沉淀（热变性和酸碱变性） 等电点沉淀 有机聚合物沉淀五、萃取（extraction）分离 利用溶质在互不相溶的两相之间分配系数的不同而使溶质得到纯化或浓缩的方法。萃取操作的3个步骤：1）混合 2）分离 3）溶剂回收（二） 双水相萃取技术，又称水溶液两相分配技术（partion of two aqueous phase system）：用两种不相溶的亲水性高分子聚合物水溶液，如聚乙二醇（PEG）和葡聚糖（Dextran）进行萃取。由于形成的两相均有很高的含水量（达70%90%），故称“双水相”系统。 （三） 超临界流体萃取：兼有蒸馏和溶液萃取的特征，与常规溶剂萃取的区别：将超临界流体作为萃取剂。 超临界流体(supercritical fluid，SCF）：超过气液共存时的最高压力和最高温度下物质特有的点临界点后的流体。（四） 反胶团萃取反胶团：又称反胶束（Reversed Micelles）指表面活性剂（由亲水的极性基团和疏水的非极性基团两部分组成）分散在连续有机溶剂中自发形成的一种稳定的纳米级的聚集体。第二节 酶的精制一、膜分离：借助一定孔径的高分子薄膜，将不同大小、形状、性质的颗粒或分子进行分离的技术。 1.透析 2.超滤二、层析法（一）凝胶过滤层析： 凝胶过滤又称分子筛层析,是以各种多孔凝胶为固定相，利用溶液中各组分的分子量不同而进行分离的技术。基本原理：大分子物质不能进入凝胶孔内，在凝胶颗粒之间的空隙向下移动，并最先被洗脱出来；小分子物质可自由出入凝胶孔，流程长而后流出层析柱。（二）离子交换层析1.原理:根据待分离物质带电性质不同的分离纯化方法。两种离子交换剂：阴离子交换剂； 阳离子交换剂（三）亲和层析(Affinity Chromatography)：由吸附层析发展起来的 ，是从复杂混和物中纯化蛋白质的最好方法。又称：功能层析（function chromatography）生物专一吸附（biospecific adsorption）选择层析（selective chromatography）第三节 电泳电泳（electrophoresis, EP） ：指带电粒子在电场中向着与其所带电荷性质相反的电极方向移动的过程。电泳技术是根据各种带电粒子在电场中迁移速度的不同而对物质进行分离的实验技术。影响迁移率的因素：1）颗粒性质：Q越大、r 越小、形状越接近球形，v 越快。2）电场强度：E越高，v越快。3）溶液性质：pH值：离pI越远，v越快。（用buffer保持恒定） 离子强度：离子强度越高，v 越低。原因：离子氛（ionic atmosphere）。通常，缓冲液离子强度在0.02-0.2之间。4）电渗：在电场中，液体对于固体支持物的相对移动。应避免用高电渗物质作支持介质。不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳系统的不连续性表现在以下几个方面： 1.凝胶由上、下两层凝胶组成，两层凝胶的孔径不同，上层为大孔径的浓缩胶，下层为小孔径的分离胶。 2.缓冲液离子组成及各层凝胶的pH不同。电极缓冲液为pH8.3的Tris-甘氨酸缓冲液，浓缩胶为pH6.7的Tris-HCl缓冲液，而分离胶为pH8.9的Tris-HCl缓冲液。 3.在电场中形成不连续的电位梯度。因此，在这样一个不连续的系统里，存在三种物理效应，即样品的浓缩效应，凝胶的分子筛效应和电荷效应，提高了分辨率。SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulphate- polyacrylamide gel electrophoresis, SDS- PAGE）简称SDSPAGE。是目前测定蛋白质亚基相对分子量（relative molecular mass, Mr）的一种最好的办法。等电聚焦 ( isoelectric focusing，IEF )利用蛋白质具有不同等电点的特性，以聚丙烯酰胺为电泳支持物，在其中加入载体两性电解质（商品名：Ampholine，一种含有各种连续 pI 的小分子混合物）的电泳方法称聚丙烯酰胺等电聚焦电泳（IEF-PAGE）。原理：两性电解质载体在电场作用下，按各自pI形成从阳极到阴极逐渐增加的平滑和连续的pH梯度。蛋白质在此pH梯度凝胶中泳动，当迁移至pH值等于pI处时不再泳动，被浓缩成狭窄的区带。应用：蛋白质的分离纯化；测等电点酶的浓缩和干燥 ：酶的干燥多采用冷冻干燥法。 2、 纯化方案的评价（三）提纯倍数与回收率: 酶的比活力(纯度)=活力单位数/毫克蛋白比活力越高，酶纯度也越好。表示酶制剂纯度的一个指标。纯化倍数=提纯后比活力/提纯前比活力表示提纯过程中纯度提高的倍数。提纯倍数越大，表示该方法纯化效果越好。总活力酶活力单位数 酶液总体积即样品中全部酶活力。回收率提纯后酶总活力/提纯前酶总活力100表示提纯过程中酶损失程度的大小。回收率越高，损失越小。判断一个分离纯化方法的优劣，常用总活力的回收率和比活力的提纯倍数两个指标。回收率：反映酶的损失情况。提纯倍数：表示方法的有效程度。一个好的纯化步骤是回收率较高，提纯倍数也较大。第五章 酶与细胞的固定化什么是固定化酶？被局限在某一特定区域上的，并且保留了它们的催化活力，可以反复，连续使用的酶。固定化酶的特点优点：1.易于与产物、底物分离；可以进行连续反应，提高酶的使用率。2.提高酶的稳定性。3.产物溶液中没有酶的残留，简化了提纯工艺。4.酶反应过程能够加以严格控制。5.较游离酶更适宜于多酶反应。酶的固定化方法载体结合法：物理吸附法,离子交换吸附法,共价结合法,交联法包埋法(网格型,脂质体包埋法),微囊型固定化酶的制备原则 根据不同酶的性质、不同的应用目的以及不同的应用环境：（1）保持自然酶的催化活性不破坏酶活性中心结构。（注意结合部位、和反应条件）（2）固定化的载体应该与酶结合牢固。（3）载体不能与反应液、产物发生化学反应。（4）有一定的机械强度，不会因搅拌破碎。（5）固定化后产生的空间位阻小。（6）成本低，利于工业化生产。细胞固定化细胞的固定化是利用物理、化学等因素将细胞约束或限制在一定的空间界限内，但细胞仍能保留其催化活性，并具有能被反复或连续使用的活力。固定化细胞的优越性：1)不需要分离纯化，酶活力损失少2)固定化细胞密度大，缩短发酵周期，提高生产能力3)固定化细胞保持了胞内酶系的原始状态与天然环境，因而更稳定4)固定化细胞保留了胞内原有的多酶系统，既能以单一的酶，又以复合酶系完成整个反应过程。特别是需要辅助因子的合成过程，如合成干扰素等。5)发酵液菌体较少，有利于产品分离纯化。固定化酶的性质活性：多数情况下固定化酶活力常低于天然酶；有可能不影响；有时升高。稳定性: 主要表现在对热的稳定性提高，可以耐受较高的温度；保存稳定性好，可以保存较长时间；对蛋白酶的抵抗性增强，不易被蛋白酶水解；对变性剂的耐受性提高。最适温度：固定化酶的最适作用温度一般与游离酶差不多，但有些固定化酶的最适温度与游离酶比较会有明显的变化。最适pH值：常会发生一些变化，主要受载体带电性质和酶催化反应产物性质的影响底物特异性：与游离酶比较可能有些不同，其变化与底物分子量的大小有一定关系。酶的活性与酶的种类，反应系统的组成，固定化方法以及固定化载体的不同而变化。影响酶催化活性的主要因素：构象改变：固定化过程中酶和载体的相互作用，引起酶的活性中心/调节中心构象改变，从而导致酶活性改变的一种效应。立体屏蔽：由于载体的孔径太小，或是由于固定化的方式与位置不当，给酶的活性中心/调节中心造成了空间障碍，底物无法直接和酶接触，从而影响了酶活性的一种效应。（大孔径胶，连接臂）微扰：固定化载体的亲水，疏水性质与介质的介电常数等直接或间接酶的催化能力。分配效应：固定化载体的亲水和疏水性质使酶的底物、产物以及其他效应在微观环境与宏观环境间发生了不等分配，改变了酶反应系统的组成平衡，从而影响酶反应速度的一种效应。扩散限制效应：指底物、产物以及其他效应物的迁移和运转速度受到限制的一种效应。第6章 酶反应器什么是酶反应器:酶和固定化酶在体外进行催化反应时，都必需在一定的反应容器中进行，以便控制酶催化反应的各种条件和催化反应的速度。用于酶或固定化酶进行催化反应的容器及其附属设备称为酶反应器。酶反应器是用于完成酶促反应的核心装置。功能：它为酶催化反应提供合适的场所和最佳的反应条件，以便在酶的催化下，使底物（原料）最大限度地转化成产物。它处于酶催化应过程的中心地位，是连接原料和产物的桥梁。酶反应器的类型酶反应器特点小结酶反应器的选择依据酶的应用形式：游离酶，固定化酶依据酶反应动力学性质依据底物 / 产物理化性质其他考虑因素操作的简便性运行的经济性第八章 酶化学修饰及修饰目的 一、酶化学修饰 1.限制酶大规模应用的原因：1)细胞外稳定性差；2)酶活性不够高；3)具有抗原性。 2. 改变酶特性有两种主要的方法： 1)通过分子修饰的方法来改变已分离出来的天然酶的活性。 2)通过基因工程方法改变编码酶分子的基因而达到改造酶的目的。酶选择性化学修饰：在较温和的条件下，以可以控制的方式使一种蛋白质同某些化学试剂起特异反应，从而引起单个氨基酸残基或其功能基发生共价的化学改变。化学修饰方式：1. 肽链有限水解修饰利用酶分子主链的切断和连接，使酶分子的化学结构及其空间结构发生某些改变，从而改变酶的特性和功能的方法。酶蛋白主链修饰通常采用酶法（用专一性较强的蛋白酶或肽酶为修饰剂）。 2. 酶分子侧链基团修饰采用一定的方法(一般为化学法)使酶分子的侧链基团发生改变，从而改变酶分子的特性和功能的修饰方法酶侧链基团：组成蛋白质的氨基酸残基上的功能团。有氨基、羧基、巯基、咪唑基、吲哚基、酚羟基、羟基、胍基、甲硫基等大分子修饰（大分子结合修饰）：是目前应用最广的酶分子修饰方法。 1.定义：利用水溶性大分子与酶结合，使酶的空间结构发生某些精细的改变，从而改变酶的特性与功能的方法。1 聚乙二醇修饰酶2 右旋糖酐及右旋糖酐硫酸酯修饰酶3 糖肽修饰酶4 具有生物活性的大分子修饰酶5 蛋白质或其它大分子物质修饰酶第九章 酶的蛋白质工程一、蛋白质工程概念：是以创造性能更适用的蛋白质分子为目的，以结构生物学与生物信息学为基础，以基因重组技术为主要手段，对天然蛋白质分子的设计和改造。蛋白质工程两种常用方法：定向进化 理性设计定向进化：突变 筛选突变位点是随机的，不确定的；突变位点的数目也是不确定的；突变位点的效应更熟不可预知的；理论上讲，凡是能够引起突变的因素（物理的，化学的，生物的）都可以应用于定向进化中突变体的产生。定点突变：突变位点是确定的，突变的个数也是预知的；突变的效应可能是已知的，也可能是未知的；定点突变的方法一般是以PCR技术为基础的。重组酶的高效表达 ：一、细菌表达体系，二、酵母系统中的表达，三、丝状真菌中的表达第10章 非水介质中酶的催化作