酶底物法(科立得)产品培训.ppt

水中微生物检测的全球领导者叶卫军电话水中微生物检测 新国标方法 总大肠菌群 大肠埃希氏菌 耐热大肠菌群固定底物技术酶底物法介绍 总大肠菌群 大肠埃希氏菌及耐热 粪 大肠菌群固定底物技术酶底物法 微生物检测的重要性 地震等自然灾害过后水体中会被大量微生物所污染 特别是粪便污染 如水体中含有肠道病原菌株 并被人饮用则会爆发严重疾病如泌尿系感染 菌血症和脑膜炎 少数肠道病原菌株可引起急性腹泻 通常人们用投放含氯消毒剂进行消毒 但消毒效果如何还需要通过检测水体中是否含有总大肠菌群和大肠埃希氏菌来判断 指示菌的方法学定义 总大肠菌群 TotalColiforms 大肠菌群系指一群在37 培养24h能发酵乳糖 产酸产气 需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌 该菌群主要来源于人畜粪便 具有指标菌的一般特征故以此作为粪便污染指标评价饮水的卫生质量 耐热大肠菌群 ThermotolerantColiforms 原名 粪大肠菌群 FecalColiforms 用提高培养温度的方法将自然环境中的大肠菌群与粪便中的大肠菌群区分开 在44 5 仍能生长的大肠菌群 称为粪大肠菌群 是水体受人畜粪便污染的比较直接指标 大肠埃希氏菌 大肠杆菌 E Coli 大肠埃希氏菌是指能产生 半乳糖苷酶 D galactosidase 分解ONPG Ortho nitrophenyl D galactopyranoside 使培养液呈黄色 能产生 葡萄糖醛酸酶 glucuronidase 分解MUG 4 methyl umbelliferyl D glucuronide 使培养液在波长366nm紫外光下产生荧光的细菌 大肠埃希氏菌是粪大肠菌群的组成部分 是水体受人畜粪便污染的最直接指标 水中含有大肠埃希氏菌提示有粪便污染 背景知识大肠菌群 耐热大肠菌群 大肠埃希氏菌 耐热大肠菌群 大肠埃希氏菌 大肠菌群 目前的粪大肠菌群检测方法是实际上是检测耐热大肠菌群而不是大肠埃希氏菌 有关文献报道的试验结果表明 有15 的阳性耐热粪大肠菌群实际上属于总大肠菌群而不是大肠埃希氏菌 这种情况的发生多数是由于耐热的克雷伯氏菌普遍存在于自然环境中 而非来源于人畜粪便 因此与人类疾病的产生也没有绝对的关联 同时 用上述方法检测 会有10 的假阴性结果 是因为大肠埃希氏菌属有10 不会产气 注1 注1 目前的粪大肠菌群检测方法 产酸产气是预试验的阳性判断指标 粪便污染指示菌比较 我国水质微生物指标 细菌 检测方法 多管发酵法 MultipleTubeFermentation MTF 滤膜法 MembraneFiltration MF 固定底物技术酶底物法 DefinedSubstrateTechnology DST 酶底物法 EnzymeSubstrateTest EST 检测方法 多管发酵法 MTF 共需3 5天时间以100mL水样中大肠菌最可能数 mostprobablenumber MPN 表示培养基制备 试管培养 22 26小时 阴性结果 无产酸 产气 产酸 产气平板培养18 24小时革兰氏染色 镜检观察菌落形态 挑取特征菌落证实试验 培养24 2h 有产酸产气者 即证实有总大肠菌群存在 检测方法 滤膜法 membranefiltration MF 共需2 3天时间用孔径为0 45 的微孔滤膜过滤水样 细菌被截留在滤膜上 将滤膜贴在选择性培养基上 经培养后 计数生长在滤膜上的典型大肠菌群菌落数 计数单位为菌落形成单位CFU colonyformingunit 储备培养基的制备 过滤 需器械灭菌等 培养 22 24H 阴性结果 无典型菌落 革兰氏染色镜检观察菌落形态 挑取特征菌落证实试验 培养24 2h 有产酸产气者 即证实有总大肠菌群存在 酶底物法总大肠菌群阳性反应原理 半乳糖醛苷 半乳糖苷酶 酶底物法大肠埃希氏菌阳性反应原理 葡萄糖醛酸酶 4 甲基 伞形葡萄糖苷酸 1 方法本标准方法采用固定底物技术酶底物法DefinedSubstrateTechnology DST2 培养基 采用MinimalMediumONPG MUG 简称MMO MUG培养基3 优点假阳性 假阴性底操作简单 快速定性 定量 51孔 97孔定量盘法 50多个国家和组织认证世界卫生组织WHO 美国EPA 水与废水标准检验法 生活饮用水标准检验方法 对酶底物法定义 科立得应用 饮用水源水瓶装水再生水 废水食品水畜牧用水医疗用水 收录于 标准测试法 内 APHA 美国公共卫生协会 USEPA AOAC USNCIMS UKDWI IBWA WHO 假阳性比较 vs滤膜法 假阳性比较 vs滤膜法 Jacobsetal AEM 1986 Frickeretal WaterRes 1997 报告者 英国泰晤士水务样品来源 泰晤士河 样品数450个 假阳性比较vs滤膜法 Jacobsetal AEM 1986 Frickeretal WaterRes 1997 产生的原因传统方法培养基非选择性 会产生相似结果引起假阳性反应培养基污染样品交叉污染操作误差结论试验证明可以用Colilert取代滤膜法进行大肠菌群和大肠埃希氏菌 还证明了Colilert DST酶底物法是不受化学 外力等外界因素变化而变化的 假阴性比较 vs滤膜法及多管法 Jacobsetal AEM 1986 Frickeretal WaterRes 1997 假阴性率产生的原因由于是非特异培养基所以会有杂菌干扰清洁剂 盐 抗生素 毒素 温度等原因会造成抑制反应非发酵大肠菌膜过滤法的问题 过滤膜的损坏 Jacobsetal AEM 1986 Frickeretal WaterRes 1997 实验步骤 Colilert对比滤膜法 滤膜法72步 科立得 5步 实验步骤 97孔定量盘法vs多管发酵 测试时间比较表 经济成本分析 定性检测操作示范 2步法 加入科立得试剂 摇晃至溶解 36C培养24小时 判断结果 1 无颜色变化 阴性2 黄色 总大肠菌群阳性3 黄色且荧光 大肠埃希氏菌阳性44 5 培养24小时 判断结果 1 无颜色变化 阴性2 黄色 粪大肠菌群阳性 定量检测 51孔定量盘 5步法 加入科立得试剂后 摇晃至溶解 将Colilert溶液倒入51孔 或97孔 定量盘Quanti Tray 内 将定量盘Quanti Tray 放入程控定量封口机Sealer封口 36 或44 5 培养24后 计算呈阳性反应的格子 然后对照MPN表计数 定量检测 51孔定量盘 5步法 固定底物技术酶底物法科立得 所需试剂及设备 定性科立得试剂取样瓶 可用玻璃瓶替代 定量科立得试剂取样瓶 可用玻璃瓶替代 51孔 97孔定量盘程控定量封口机 Colilert使用总结 科立得市场占有率 美国的市场占有率为95 欧洲的市场占有率为90 全国有20余家环境监测站 如北京 上海 四川 厦门 郑州 沈阳等 40余家自来水公司 35家省市级疾病预防控制中心及水文站 应用案例 2004年非典 爱德士捐赠科立得试剂给中国CDC及上海CDC抗拒非典2008年汶川地震 爱德士公司捐赠1000套科立得试剂到四川省CDC及环境监测站2008年奥运会 协助北京自来水及北京CDC完成奥运安全供水任务与中国环境监测站 上海环境监测站及厦门环境监测站做了对比实验 案例分析 2004年非典 爱德士捐赠科立得试剂给中国疾病预防控制中心及上海中国疾病预防控制中心抗拒非典 案例分析2008年汶川地震 爱德士公司捐赠1000套科立得试剂到四川省CDC及环境监测站 第一家捐赠试剂到灾区的厂家 案例分析2008年奥运会 协助北京自来水及北京CDC完成奥运