STS对香石竹切花衰老过程中POD酶活性的影响.doc

STS对香石竹切花衰老过程中POD酶活性的影响赵晨宇 林学园艺学院观赏园艺042指导教师 龚荣高摘要：本文以香石竹切花为试材，研究了不同浓度的STS对切花衰老过程中POD酶活性的影响。结果表明：在一定范围内随着STS浓度升高，POD酶活性上升越平缓、阈值出现时间越晚，MDA积累量减少、电导率降低；当STS浓度为800 mg/L时，香石竹切花的MDA 含量显著减少，电导率显著降低，POD酶活性上升最平缓、阈值出现时间也明显延后，表明膜氧化减缓，进而延迟切花衰老。关键词：香石竹切花、STS、POD酶活性、衰老Effects of STS on POD Activities of Carnation cutting flower during the progress of Senescence Zhao Chenyu Ornamental Horticulture Grade four Class TwoDirected by Gong RonggaoAbstract: Applying the carnation cutting as testing materials, the effects of STS with different concentration on POD activities of carnation cutting during the progress of the senescence were studied. The results showed that POD activities, MDA content and electrical conductivity changed trend while STS content increasing. While STS content reached to 800mg/L, compared to CK, MDA content and electrical conductivity decreased significantly, and threshold value of POD activities delayed significantly, which indicated that it slowed down the cell membrane oxidized, thus, which delayed the carnation cutting senescence.Key words:Carnation cutting，STS，POD activities，Senescence香石竹（Dianthusca ryophyllus.L）又名康乃馨，是石竹科(Caryophllaceae)多年生草本花卉，其观赏价值高,是当今世界上十分畅销的四大鲜切花之一12。它在切花生产、贸易和消费中占有重要地位。由于香石竹切花为乙烯极为敏感，因而有关香石竹的保鲜和采后生理变化方面的研究，大都集中在如何抑制采后乙烯生成上34，但对机理方面的研究报道不多。银离子是乙烯重要的抑制剂，在生产上AgN03应用较多，但存在毒性等问题。而STS(硫代硫酸银)是硫酸银络合物，生理毒性比AgN03小且用量小，它含有活性银，在切花体内移动性好，其输送功能比Ag高70倍，能达到花冠顶端 5。然而，很少有关STS对香石竹生理方面的研究报道，特别衰老过程中对膜脂氧化方面的报道尚未见。膜脂氧化是切花衰老的重要指标，过氧化物酶（POD酶）是重要的植物抗性酶6和膜脂氧化保护性酶，它通过清除H2O2、OH、O2等自由基来避免膜脂过氧化作用7。膜氧化的主要体现在膜氧化产物丙二醛（MDA）增加、膜透性增加8。为此，本实验试图通过研究不同浓度的STS对POD酶活性、MDA含量和电导率的影响，探讨乙烯抑制剂STS对切花衰老中膜氧化的影响，为进一步研究香石竹切花的衰老机理提供理论和实践依据。1 材料与方法1.1 供试材料香石竹采自云南，购置于雅安心语花店，剪取大小一致、含苞待放的健株，花冠颜色为粉色。1.2 材料处理将供试花枝留30cm长，清除低于水面的叶片，减少因腐烂而滋生细菌的机会，插人盛有250mL瓶插液的玻璃瓶中，每个处理21枝，瓶口用脱脂棉固定花枝，并防止瓶内水分蒸发。本实验设5个处理，每个处理3次重复。瓶插期间室温为1825，相对湿度60%85%，试验处理的瓶插液成份分别为（如下表所示）：表1 处理液配方药 品 CK（处理1） 处理2 处理3 处理4 处理58HQC（mgL1） 200 200 200 200 200Vc（mg） 50 50 50 50 50 蔗糖（%） 2 2 2 2 2STS（mgL1） 0 200 400 600 800注：8HQC：8羟基喹啉柠檬酸；STS：硫代硫酸银；Vc：维生素。1.3 生理指标的测定方法1.3.1 MDA（丙二醛）的测定参照熊庆娥方法5略有修进，取花瓣0.5g置于研钵中，加入2ml 10TCA和少许石英砂，研磨成匀浆，加入8ml 10TCA继续研磨成匀浆。匀浆在3000rmin1下离心10min，取上清液3ml加入试管，取另一只试管加入水3ml（空白），各加入0.5的TBA溶液3ml，摇匀，在沸水浴煮沸10min（溶液出现小气泡开始计时），立即在冷水中冷却。如有沉淀，应离心。以空白做参比，在分光光度计450nm、532nm、600nm下测定样品反应液的消光值。1.3.2 POD酶活性（过氧化物酶）的测定采用愈创木酚法5，称取0.5g花瓣，加入20m molL1 KH2PO4溶液5ml，于研钵中研磨成匀浆，残渣再用5ml KH2PO4溶液提取一次，合并两次上清液，在3000rmin1下离心10min，取1ml上清液转入25ml容量瓶中，定容，混匀，贮于冷凉处备用。取光径1cm比色皿2只，于1只加入已混匀的反应液（愈创木酚溶液）3ml，KH2PO4溶液1ml，作为参比液;另一只加入反应混合液3ml，酶液1ml，立即记时并置于分光光度计中，在470nm下测定光密度，每隔3min读数一次，连续测定30min。1.3.3 可溶性蛋白的测定采用考马斯亮蓝G-250法5，取样品液1ml加入试管中，然后加入考马斯亮蓝5ml混匀，在分光光度计上，595mn下测定吸光度，在标准曲线上查出对应的蛋白含量。1.3.4 电导率的测定采用DDS-11A型电导仪测定法5，取花瓣若干，打孔后取30枚圆形花瓣，经真空处理后，使用无离子水浸提1h后测量。1.4 切花寿命的测定切花瓶插寿命计算方法：同一处理内以第一支花出现焦边萎蔫到最后一花出现焦边萎蔫时间和的一半来计算切花平均寿命9。切花寿命计算方法：以切花插入瓶中开始计算，以花瓣最外层焦边萎蔫作为瓶插寿命结束的标志，两者时间之差即为切花寿命。1.5 数据处理试验数据采用Excel绘图，运用DPS软件进行分析。2 结果与分析2.1 切花平均寿命由表2可知，随STS处理浓度升高，萎蔫时花冠开放程度不断加大，焦边出现的时间越晚。STS处理的切花平均寿命均极显著高于对照, 其中处理5的平均寿命最长，达到21d。说明STS能促进花冠开放、延迟焦边出现，并能显著延长切花寿命，在一定范围内随浓度升高而寿命延长。 表2 切花瓶插衰老观测表处理 萎蔫时花冠开放程度 花瓣出现焦边的瓶插时间（d） 切花瓶插寿命（d） CK 大部分未开放 9 12.0 A 处理2 少数尚未完全开放 13 16.0 B 处理3 大多数完全开放 14 16.6 B 处理4 全部完全开放 16 19.0 C 处理5 全部完全开放 19 21.0 D 注：表中大写字母表示P=0.01水平上的差异。2.2 STS对POD酶活性的影响从图1可以看出，POD酶活性在切花衰老过程中均表现为瓶插前23d有一高峰，随后快速下降，之后不同程度的不断上升，到最后酶活性消失。POD酶活性出现第一个高峰可能是由于切花离体后的胁迫生理作用引起的，而第二次高峰则主要由于植物的衰老积累了大量有害自由基引起的。CK中POD酶活性在5d后迅速上升，并在第8d达到最高峰。但加入STS的各处理POD酶活性升高较慢，特别是处理5，而且它们出现第二次高峰的时间不断延后，处理5直到16d后才出现，经差异显著性检验，结果表明第二个峰值出现时间差异显著，STS处理后的均显著高于CK，处理5也显著高于处理24。说明不同浓度银离子处理香石竹切花内的POD酶活性存在着差异，银离子浓度越高，POD酶活性的第二个峰值及存在活性时间延续越长。然而，各处理均在最后不能检测到POD酶活性，说明POD酶的清除能力已经超过了一个阈值，导致POD酶的活性丧失。同时也表明银离子浓度越高，POD酶的阈值出现越晚，就可以避免切花不受损害。图1 STS对POD酶活性的影响2.3 STS对MDA含量的影响从图2可以看出，随着瓶插时间的延长，香石竹切花内的丙二醛均出现不同程度的积累。但相对于经STS处理的切花，从总体变化趋势来看，CK（处理1）积累MDA要快些，并在第12d 达到最大值，处理5最慢。在12d对切花内MDA含量方差分析结果表明，CK与处理2相比差异性不显著，但与处理3、4、5的差异极显著，处理5也显著低于其它处理。说明STS具有防止MDA积累的作用，并随STS浓度的增加，MDA积累越慢，膜氧化程度也就越低。此外，从图2还可发现，在处理后的瓶插后第2d，各处理的丙二醛含量均略有升高，出现一个增高值，这可能是切花离体后生理上的一个调整和应激反应所致，即呼吸跃变和保护酶清理自由基的两个过程。图2 STS对MDA含量的影响2.4 STS对电导率的影响电导率是细胞透性大小的指标，同时也是膜完整性的指标。从图3可以看出， 电导率随着瓶插时间的延长而不断上升，但各处理上升的幅度差异明显。其中，CK的电导率升高最快，在花后12d达到高峰，而处理25的电导率上升较慢，特别是处理5上升缓慢，直到瓶插后21d才达到较高水平。对花后12d切花电导率方差分析结果表明，CK与其它处理的差异达显著（与处理2）或极显著（与处理3、4、5）水平，处理3、4、5之间的差异不显著，但与处理2的差异显著。第16天处理2的电导率值达到了最大值。经方差分析结果表明，它与处理3的差异未达到显著水平，与处理4的差异达到显著水平，而与处理5达到极显著水平。第16.6天处理3的电导率值也达到了最大值。但经方差分析结果表明，它与处理4和处理5间的差异并未达到显著水平。说明STS不仅能减缓切花电导率的升高，而且随着浓度的增加减缓的效果越显著。此外，从图3也可发现，不同浓度的STS处理香石竹切花在电导率方面也存在着一个小“跃变”的现象。在第2d各处理的电导率变化曲线都出现了峰值，它可能还是与切花离体后的胁迫生理有关。图3 STS对电导率的影响3 小结与讨论3.1小结本试验表明，随着瓶插时间的延长，香石竹切花内MDA含量增加，电导率增大，POD酶活性变化趋势大体为前期和后期有两个峰值出现；STS能显著减缓POD酶活性升高及其阈值的出现时间、MDA积累和电导率上升，从而延长香石竹切花寿命，并在一定范围内随STS浓度增加，MDA积累量越少，电导率越小，POD酶活性出现阈值时间越晚。当STS浓度达到800mgL1处理过的香石竹保鲜效果最好，平均寿命长达21天，与对照相比要延长9天。3.2 讨论朱建华10认为，乙烯对香石竹作用非常明显，它作为成熟激素诱导并加速香石竹这种跃变型切花的花朵开放。本实验中MDA含量、电导率值以及POD酶活性在23天左右，均有不同程度的升高趋势，可能是以下原因，一是切花在采收之后随即进行保鲜处理，这对香石竹生长进程来说是一种逆境的环境条件，当植物转入正常的生长模式时，香石竹出现了呼吸跃变，从释放少量乙烯到释放大量乙烯的过程，促使花径增大，即生理上由Systerm乙烯诱导Systerm乙烯的生成过程。此时各项指标伴随着呼吸跃变有上升的现象。银离子延缓植物衰老的原理之一就是银离子通过置换ACC合酶上关键位点上的铜离子来延缓乙烯的大量生成，从而避免呼吸跃变型花卉因大量乙烯生成而引发衰老11。二是切花自采收以后，由于逆境胁迫的原因，植物体内积累了较多的自由基，经过23天的调整，激发了植物本身的防御机制，酶和其它指标的升高，有利于清除体内有害自由基，保护植物不受损害。MDA积累量随时间的延长含量增加，并在后期出现明显的高峰值，随即因严重失水而降低。实验发现银离子浓度越高，香石竹MDA曲线高峰值出现的越晚，植物寿命越长。这表明植物逆境胁迫的伤害过程中包含着一种自由基机制。Fridovich12提出生物自由基理论解释膜伤害现象。脂质过氧化作用中产生脂质自由基，它不仅能连续诱发脂质的过氧化作用，而且又可以使蛋白质脱H+而产生蛋白质自由基，使蛋白质分子发生链式聚合，从而使细胞膜变性，最终导致细胞损伤或死亡。银离子的作用是在植物体遭遇逆境条件下减少体内自由基累积，减轻了膜脂过氧化，修复膜损伤，使膜的结构和功能不遭受破坏，避免伤害发生。同时减少了细胞内物质外溢，降低电导率值，延缓衰老。目前，普遍认为环境引起的自由基累积与膜伤害关系密切13。本实验结果说明银离子延缓衰老的原理之一是减少自由基对膜的伤害，改善水分胁迫，从而起到延长切花寿命的作用。O2可以通过启动自由基的链反应及其它类型的再氧化反应等产生毒性更强的羟基自由基(OH)以及单线态氧和过氧化氢(H2O2) 14。然而，在植物体内同时也存在着防止自由基伤害的保护系统，以清除逆境条件下细胞中产生的自由基。POD作为内源活性氧清除剂，主要功能是清除H2O215。实验表明：POD酶活性的增高，可以清除植物体内过量的活性氧，维持活性氧代谢平衡，使香石竹具有一定程度抵御和忍耐逆境伤害的能力，同时也意味植物衰老程度的加剧。结果还表明，随着处理时间的延长，银离子浓度越高香石竹的POD酶活性时间越长，反之，银离子浓度低的处理，POD酶有一个阈值出现，一旦超过这个限度，植物的损伤是无法修复的，也是不可逆的。说明植物清除体内过量的活性氧，维持活性氧代谢平衡的作用是有一定限度的。 因此，银离子的对POD酶的作用表现为延迟POD酶活性出现阈值的时间，延长香石竹的平均寿命，这对POD酶维持细胞中H2O2处于一个低水平是至关重要的。银离子属于重金属离子的一种，对植物也必然有毒害作用15，本实验处理的银离子浓度未达到对植物产生毒害的程度。因此无法判断800 mgL1浓度的银离子是否是作为香石竹保鲜液的最佳浓度。在最后进行废弃处理时发现：前面我们对香石竹的瓶插液进行了遮光处理并用脱脂棉封口，加之银离子和8羟基喹啉具有杀菌和抑制微生物繁殖的作用，本不应该出现微生物，但是最后发现，瓶内和花枝切口处还是布满了微生物，这直接对香石竹产生水分胁迫，可能是致使其衰老的原因之一16。参考文献1 陈俊愉.中国花径M.上海：文化出版社，1992.2 高勇，吴绍锦.切花保鲜剂研究综述J园艺学报，1989,16(2):139-145.3 Nchola Dbreloptnents in post-harvest techniques for cut flowers,J.Jounral of the American Society for Horticultural Scienoe,1980,3(2),43-47.4 吴敬须，李龙章，张飞鸟.切花采后生理与贮藏保鲜J北京园艺，1991(2):36-38.5 熊庆娥，植物生理学实验教程M.成都：四川科学技术出版社，2003.P72、85、1266 高俊平.观赏植物采后生理和技术M.北京：中国农业大学出版社，2007.P20-307 王少平，宋荷英，刘樾.STS处理切花香石竹的保鲜效果研究J安徽农业科学