电子显微镜使用方法.doc

五、电镜标本制作方法 电镜标本用于观察组织细胞的超微结构。扫描电镜用于细胞表面的观察，透射电镜用于细胞内部结构的观察。现以透射电镜标本的制作为例作简要介绍： (一)取材 标本的新鲜程度要求高于光镜标本，组织块小于lmm3。 (二)固定 常用的固定液有25戊二醛磷酸缓冲液和1锇酸。这些液体穿透力较强，能稳定和保存细胞内的结构。固定温度应控制在04，固定时间12小时。 (三)冲洗 冲洗液由02molL磷酸缓冲液(pH7.2)与双蒸水等量混合配成。冲洗组织块2次间隔15分钟。 (四)脱水 脱水剂多采用浓度递增的酒精和丙酮，从50 70 90酒精 1/2 90酒精+1/2 90丙酮混合液 90丙酮(以上步骤均在04冰箱中进行) 100丙酮，间隔1015分钟。 (五)包埋 包埋剂为环氧树脂618或812和固化剂十二碳烯基丁二酸酐(简称DD-SA)，加入适量增塑剂苯甲酸二丁酯(简称DDP)。为了使反应速度增快，可加入加速剂2，4，6-三(二甲氨基)甲基苯酚(简称DMP-30)。 包埋剂配方： 环氧树脂618或812 60 DDSA 40 DBP 3 DMP-30 1上述试剂依次加入，边加边搅拌，全部加完后再充分搅拌1015分钟，静置于3540温箱内排出气泡。包埋前组织块必须浸透，入无水丙酮加等体积包埋剂室温3小时，纯包埋剂37 2小时。包埋时先将纯包埋剂倒入胶囊或含硅胶的包埋槽内，置入组织块。包埋后在60C温箱中烘23天后硬化成块，即可剥去胶囊或包埋槽。 (六)将组织块修成塔形，尖端面积为0.2mm0.3mm左右，用超薄切片机切成50mm厚的超薄切片，再置于铜网上。 (七)染色 常用的染液有12醋酸铀和枸橼酸铅。醋酸铀染色是在组织块进行脱水过程中进行的，而枸橼酸铅染色则多用于片染。最后，将载有切片的铜网置于透射电镜内观察和摄影。由于电镜电子束穿透能力的限制，必须把标本切成厚度小于0.1um以下的薄片才适用，这种薄片称为超薄切片。常用的超薄切片厚度是50-70nm。 在透射电镜的样品制备方法中，超薄切片技术是最基本、最常用的制备技术。超薄切片的制作过程基本上和石蜡切片相似，需要经过取材、固定、脱水、浸透、包埋聚合、切片及染色等步骤。一 取材的基本要求组织从生物活体取下以后，如果不立即进行适当处理，会由于细胞内部各种酶的作用，出现细胞自溶现象。此外，还可能由于污染，微生物在组织内繁殖使细胞的微细结构遭受破坏。因此，为了使细胞结构尽可能保持生前状态，必须做到快、小、准、冷：(1)动作迅速，组织从活体取下后应在最短时间内 (争取在1分钟内) 投入2.5%戊二醛固定液。(2)所取组织的体积要小，一般不超过1mm1mm1mm。也可将组织修成1mm1mm2mm大小长条形。因为固定剂的渗透能力较弱，组织块如果太大，块的内部将不能得到良好的固定。(3)机械损伤要小，解剖器械应锋利，操作宜轻，避免牵拉、挫伤与挤压。(4)操作最好在低温(04)下进行，以降低酶的活性，防止细胞自溶。(5)取材部位要准确。取材方法：将取出的组织放在洁净的蜡版上，滴一滴预冷的固定液，用两片新的、锋利的刀片成“拉锯式”将组织切下并修小，然后用牙签或镊子将组织块移至盛有冷的固定液的小瓶中。如果组织带有较多的血液和组织液，应先用固定液洗几遍，然后再切成小块固定。透射电镜工作原理：利用电子射线（或称电子束也称电子波）穿透样品，而后经多级电子放大后成像于荧光屏。主要优点：分辨率高，可用来观察组织和细胞内部的超微结构以及微生物和生物大分子的全貌。溶液成膜（颗粒1000埃： 细胞碎片，病毒，生物大分子）蓝耳病毒45-70纳米1 取材与固定 目的 将所取样本尽可能固定在生活状态下固定剂： 戊二醛（醛基和氨基反应） 四氧化锇（锇与双键螯合） 多聚甲醛（醛基和氨基反应）0.1M磷酸缓冲液（PB）固定剂浓度：戊二醛（GA）：3%（ 0.1M PB ）四氧化锇(锇酸):1%（ 0.1M PB ）多聚甲醛（FA）:4% （ 0.1M PB ）2.5%戊二醛+2%多聚甲醛（ 0.1M PB ）1%戊二醛+1%四氧化锇（ 0.08M PB ）固定方法（迅速）： 将动物麻醉或急性处死，暴露所需器官 剪取小块组织，放在预先冷却的固定液中 在洁净纸片上滴一滴冷却的固定液，取出组织块初步修块（细长条：L：2-3mm,W：1mm） 转移回冷却的固定液中常规（两步固定法） GA固定液中4C 12h(中间0.5-1h可取出修块) 转移到冲洗液中（0.18M蔗糖in0.1MPB） 4C 12h(原则上与固定时间相等)，中间换液2次 锇酸固定液中4C或 R.T.1h dd水中冲洗 *在冲洗液中可存放12周，但每周至少换一次液（在固定液中长放易脆） *经GA固定后膜还有一定的渗透作用，在经锇酸固定后就没有了 *清洗要充分（GA与锇酸会产生微细沉淀，一般两个固定液间更换两次冲洗液后第三次过夜；锇酸与乙醇会产生微细沉淀）2 脱水 脱水剂：乙醇或丙酮（梯度脱水）50%70%(80%)90%100%100%10-15m10-15m10-15m10-15m45m45m4C4C4C4C或 R.T.R.T.R.T. *低浓度时对组织有提取作用，时间不可长 *低温可降低提取作用，但100%低温会吸水 *可停在90%过夜，不能在100%，脆时常摇动 *100%加干燥剂保存在干燥器中3 浸透与包埋包埋剂： （几类物质的混合物） 环氧树脂（基本成分） 氨类物质（催化剂） 酸酐（交联）固化剂 临苯二甲酸二丁酯（增塑剂）包埋剂的基本要求脱水剂+包埋剂1：1包埋剂包埋剂包埋剂 1h过夜1248h24h37C或 R.T.37C45C60C胶囊中胶囊中胶囊中不要加盖*R.T.下干燥器中可保存相当长时间4 修块与切片0.1*0.1mm，90度，梯形 玻璃刀（现做现用，20-30片） 钻石刀 切片机的工作原理： 金属膨胀杆 切片厚度与颜色 500A 600-900A 900-1500A 1500-1900A 1900-2400 2400-2800A 灰色 银灰色 金黄色 紫色 蓝色 绿色支持网与支持膜 铜网 不锈钢网 3mm 目数 镍网 金网 聚乙烯醇缩甲醛膜（Formvar）（0.2-0.5% in 氯仿） 聚乙烯醇缩丁醛膜 火棉胶膜（14in醋酸戊酯） 碳膜*切片保存5 染色目的将重金属原子结合到细胞结构上使造成图像反差重金属：铅盐（Pb,82）蛋白质，糖元，脂类（膜看得清楚） 铀盐（U,92） 大多数细胞成分均可，特易于核酸复染 醋酸铀（黄色有毒晶体，见光分解） 50-70%乙醇饱和溶液，放置过夜，取上清 避光（棕色光口瓶，黑纸罩上） 柠檬酸铅（有毒） 1.33g硝酸铅+1.76柠檬酸钠（2水）in 50ml dd水+浓NaOH数滴 避CO2（水去CO2，口吹， NaOH 颗粒） 醋酸铀30m，漂洗 柠檬酸铅37m（不宜过长），漂洗 0.02N NaOH分色，漂洗 *染液配好后可使用半年左右，放置较久的染液离心一下效果好 半薄切片 对于不均匀的组织重要 厚度0.5微米（介于光与超薄之间） 载玻片水滴上70-80