DGGE法.docx

变性梯度凝胶电泳变性梯度凝胶电泳原著：Jeroen H. Roelfsema and Dorien J. M. Peters1.翻译：小高1.简介变性梯度凝胶电泳是人们多年来广泛使用的一种健全的检测点突变的方法（1）。它是一种基于PCR的方法，其原理是，与野生型基因相比，改变了PCR产物中突变序列的解链温度。通过PCR，致使DNA两个基因其中一个中的点突变变成不同的DNA的混合体。PCR后的产物中包括野生型基因和突变型基因。即同源二聚体。然而这两种产物的解链温度差别不大。在PCR反应的最后一个循环，形成另外一种产物，即异源双链DNA，它包括一条野生型的链和一条突变的链。DGGE的原理就在于同源PCR产物的解链温度远远低于异源PCR的产物，因为异源双链有一个错配(see Fig. 1)。为了看到同源和异源DNA的解链温度之间的差别，只要让其在含有变性剂尿素和甲酰胺的丙烯酰胺梯度凝胶上电泳即可。仅仅靠这些变性剂本身是不够的。另外，跑电泳的胶的温度也比较高，通常在60。电泳过程中，PCR产物在变性以前一直保持双链DNA的形式。一旦变性后，PCR产物将以单链DNA的形式继续跑，但是片段则会保留在变性的地方。为了达到这个目的，需要连上一个所谓的GC夹子以阻止完全变性。这个GC夹子是由40-60个单纯的鸟嘌呤和胞嘧啶核苷酸构成的一条链，然后连接在其中的一种PCR引物上。加上GC夹子进行PCR后的产物其一端具有很高的变性温度。因此，PCR产物在DGGE的胶上将部分变性。GC夹子保持双链。其余的片段形成“Y”形继续保留在胶上原来的地方。2.操作步骤2.1.设计PCR引物对于DGGE来说，用于筛选点突变的PCR引物的解链特性是很关键的。当片段到达凝胶的临界点时，应该及时地变性，而不是在一端开始随着电泳的进行逐渐的慢慢的变性。这种慢性解链会形成模糊的条带或者斑点，将导致很难检测出突变。因为解链特性对于实验的成败至关重要，所以选取用来扩增目标产物的引物时必须格外小心。出于这个目的，为了选择引物，我们必须使用专门的软件来分析PCR可能产物的解链曲线。在这方面有各种各样的商业或者免费的平台软件可供使用。并且也有专门用来在线分析序列的网站。研究者在分析目标序列的时候通常都会得到一条不规则的解链曲线。但是连接上一个含40-60个核苷酸的GC夹子后往往会使曲线明显地变得平滑(see Fig. 2)。曲线的上下浮动范围应该在1以内。当然，GC夹子附近的解链温度很高。如果连接上GC夹子后曲线未变的平滑，那么我们应该尝试连到另一端。因为对于DGGE来说，GC夹子连接在引物的哪一端都可以。选择过程就是通过尝试各种不同的正反引物以获得曲线平滑的产物和适合PCR的引物。DGGE产物大多数在200-400bp。对于大于400bp的产物很难找到理想的解链曲线。GC夹子的长度也会改变整个序列的解链过程。人们通常都使用含55个核苷酸的GC夹子，但是有时候也需要含60个核苷酸的，尤其是含GC丰富的序列。最终，通过计算机分析大多数目标序列都能获得好的平滑的曲线。然而，也有一些麻烦的序列需要使用特别的方法。例如，如果一段没有GC夹子的序列其解链曲线末端下降，这样可以再连接一个小一些的GC夹子。这叫做两极镶嵌。在这种极少的案例中我们可以在需要的地方使用一串8-20个核苷酸的序列。我们仍需特别注意富含GC的序列，因为这种序列在GC夹子开始的地方解链曲线并没有剧烈的变化，但是当接近GC夹子时解链温度开始上升。这里要说明的是，在引物上GC夹子之间增加一些A、T碱基，退火部分将会导致解链曲线剧烈的变化。就向前面所说的，一个GC夹子包括40-60个鸟嘌呤和胞嘧啶。我们强烈建议在实践中使用已经被证实有效的一段序列作为GC夹子。设计你自己的GC夹子是很困难的，这或许将导致在PCR过程中形成稳定的发夹结构。许多解链预处理程序提供GC夹子的序列。制作一个带GC夹子的PCR引物并不需要专门的改变。操作规程与其它的PCR是一样的，并且退火和变性温度都没有变化。变性梯度凝胶电泳非常适合筛选基因组DNA中的突变，因为大部分的外显子长度都小于400bp，可以作为一个片段来分析。因此用来筛选大的片段的许多方法对小的外显子来说用处不大。这些年来，根据许多基因的突变分析来看，很多突变都影响一致的剪接位点。因此，在外显子附近的内含子序列里的引物就会被选择，通过这种方式其剪接位点也将作为外显子的序列筛选出来。剩下的内含子与编码序列相比就不是隐藏有害的突变，而是更像包含无害的多态性片段。因此，在DGGE片段中我们应该尽量的减少内含子的序列。2.2.呈现突变为了分离同质双链和异源双链，DGGE片段需要经过丙烯酰胺凝胶。含有9%的丙烯酰胺凝胶可以保证清晰并且易于处理的条带。灌注这些凝胶，需要两种储备液：97.5：1丙烯酰胺/双丙烯酰胺 in 0.5XTAE和相同的储备液加上7M尿素和40%的甲酰胺。前者叫做0%变性剂，后者叫做100%变性剂。100%到0%之间的梯度很少用到，因为在这么宽的梯度范围内同质双链和异源双链的变性点可能很接近，然而，设置一个30%的梯度却是很有必要的。为了选择尿素/甲酰胺梯度，一段序列的解链温度（Tm）通常根据由计算机分析得到的经验公式得到：TmX3.2-182.4=变性度%。通过增加或者减少计算得到的尿素/甲酰胺浓度的15%来获得需要的30%这个梯度，以使得解链点大概在凝胶的中心。具有不同尿素和甲酰胺梯度的丙烯酰胺凝胶是用底部有短管相通的两个容器组成的简单的梯度混合器倾注的。这种系统适用于倾倒各种梯度。第一次电泳是在一种叫做time-travel的凝胶上进行的，在这种胶上，DGGE序列停留在泳道的15到20分钟时间间隔内。电泳跑完后，所有泳道变性的序列都应该停留在凝胶的相同高度，无论是什么时候加的。如果不是这种结果，那么这个系统就必须重新设计(see Fig. 3)。如果一条序列的条带不清楚或者在胶上停留的位置太靠前或者太靠后，那么这个梯度就应该调整。从技术角度上来讲，DGGE实验最具有挑战性的问题是如何使电泳温度保持在60。有很多种方法可以使其温度达到60，但是最常用的是将盛有丙烯酰胺凝胶的玻璃槽放到一个恒温的热水器内。也有很多商用的可供DGGE的全部的配套设备，它们是用较低的缓冲室喷淋温水。通常都是在90V0.5XTAE缓冲液中电泳一宿，但是也可以用更高的电压在白天做短时间的电泳。电泳完后，胶要沉浸在含有EB的0.5XTAE的缓冲液中以呈现DNA条带。3. EDGGE的应用变性梯度凝胶电泳是用来鉴定小的突变的一种方法，例如点突变。点突变是指一个核苷酸转移或者颠换到另一个上去。然而，许多类型的小突变例如缺失或者插入一个或者多个核苷酸都可以用DGGE鉴定出来。事实上，这些突变对于同质双链和异源双链都会引起解链温度的巨大差异，因此在胶上很容易就能看出来。如前所述，DGGE可以鉴定200-400bp的序列，这使得它很方便的应用于分析基因组中的外显子。然而，DGGE也可以用来筛选RNA。但是，RNA比起DNA更加的容易降解，因此他需要先转化成cDNA。因此，为了诊断和研究基因遗传性异常，人们通常扫描基因组DNA突变。例如，DGGE被广泛的应用于结肠直肠癌的各种基因分析，像APC,MSH2,MSH6,MLH1等等。对于像结肠直肠癌这种可以治愈的潜在的致死性疾病症状前诊断特别重要。经过突变分析发现，患有结肠直肠癌的家族，基因突变通常都是唯一的。显然，检测一个家族的未知突变需要一种已经尝试并且证实有效的技术，例如DGGE，特别是当风险很高的时候。然而，出于研究目的，可靠性也是很重要的。要研究各种类型的突变需要这种检测技术能够反映出各种点突变，如此才可以做出突变范围的正确的分析报告。进行性假肥大性肌营养不良是由X染色体上的一个编码抗肌萎缩蛋白的大型基因突变引起的。绝大多数的突变是大量的缺失或者重复，但是大约百分之三十的突变是发生在第70个外显子或者它们附近的结合位点上的点突变。为了加速筛选程序，PCR产物必须聚集起来，从三个到六个片段，然后在一条泳道上跑胶。当然，这种多路技术不仅仅限于大的基因。一个例子就是胰岛素。使用二重扩增反应就可以筛选出整个的基因。两种反应的产物都可以在同一个胶上分析，这样可以快速地筛选大量的序列。DGGE最初是用来轻松的诊断突变出现时的异源双链核酸。在筛选显性遗传病的基因突变时，PCR过程中形成异源双链DNA。然而，DGGE是否能应用于隐形遗传病？囊性纤维化是已知的最常见的隐形遗传病。自从1989年CFTR基因鉴定出来以后，突变诊断后显示，一些突变很频繁，最显著的是508位置的突变，三个核苷酸的缺失导致508位置色氨酸苯丙氨酸读码框的缺失。这种频繁的突变经常用其他的方法分析，以筛选已知的具体的突变。对于那些剩下的罕见的先前没有鉴定出来的突变，DGGE尤其适合。囊性纤维化是一个隐性基因，但这并不妨碍筛选，一个很简单的原因就是筛选的是患者的父母的DNA。他们的父母以杂合子的形式携带突变。尽管如此，筛选他们父母的基因没有太大的困难，因为在两个基因中很难同时出现稀缺突变。然而，我们必须注意的是由于地理或者自然条件的隔离，群体中的纯合稀缺突变也经常发现。即使这样，大多数的情况下，仔细的分析DGGE凝胶也将会发现纯合的突变。然而待测DNA也可以与正常的DNA混合以创建异源双链DNA。从技术的角度来看，隐形遗传和X连配错乱没有区别。此外，通常都是检测含杂合子的母亲的DNA。检测点突变不仅仅局限于遗传错乱。它也适用于肿瘤。癌症是由于基因中的一系列的突变引起的，从整条染色体的缺失到点突变。手术上切除肿瘤并没有改变DNA的量，但是根据肿瘤和DNA分离的方法，DNA或许会被降解成小的片段。总之，这对于DGGE 方法来说并不是个难题，因为PCR片段通常都很小。另一个问题是肿瘤样品并不仅仅包含肿瘤细胞，其中也可能有血管和结缔组织。尤其是恶性肿瘤细胞可能导致样品中含有大量的未感染细胞。从经验来看，DGGE比其他方法更容易发现突变。在这种类型的研究中经常检测的典型基因有TP53、K-、N-和H-RAS。TP53基因上的突变检测通常受限于外显子5-8，人们认为这个区域隐藏了大部分的突变。然而，整个基因的突变分析显示这会导致忽略许多的突变。免疫组织化学常常被用来检查肿瘤中的p53的状态。研究者应该注意的是免疫组学化学和DGGE之间不能相互替代。在观察肿瘤中的p53时这两种方法是互补的。DGGE的另外一个完全不同的应用是可以估计不同菌种的数量和种类。编码rRNA的基因被当作靶标，因为在不同的种之间这些基因高度保守。在绝大多数保守区退火的引物可以用来扩增完全不同种类的基因。在不是很保守的区域的片段序列变化DGGE可以显现出来并且可以用来鉴定不同的种。这种技术最早在微生态学中发展起来用来检测生活在土壤和水中的物种。这种方法也可以应用于评估生活在人类体内或者体外的物种。例如监测用抗生素治疗的病人。检测点突变既可以用SSCP分析也可以用DGGE方法。这两种方法都有十多年的历史了，并且比起需要昂贵设备的最新的最先进的技术相对廉价。然而，什么时候用SSCP或者DGGE？DGGE是一种健全地方法，一旦优选一个产物，他将很有效。结果也很容易检测出来，因为只要放在紫外灯下一看就能立刻看到突变。清晰的结果是DGGE的一个巨大的优点。另外一个优点是它不需要放射性标记。SSCP需要放射性PCR或者银染，并且结果不够清晰。另一方面，SSCP比DGGE需要的时间少，并且不需要昂贵的材料。这就是为什么大量的样本用这种方法的原因。例如，筛选少量的样本要求用SSCP。DGGE适合于少选大量的长周期的样本。当在胶上发现异常的条带后，很明显就能看出哪个样本上的哪个序列出现了变化。变化的的性质或者确切的位置是未知的。为此，必须对PCR产物进行测序。如果最后必须测序，为什么检测突变不直接测序而是选择DGGE？答案有两个。首先，DGGE结果很清楚。DGGE条带上的突变可以清楚的看到，然而测序需要成熟的软件和电脑分析后仔细乏味的检查。第二，也是决定性的因素，当筛选大量的样本时，DGGE成本较低。引物选自外显子附近的内涵子序列，用来筛选整个的编码区和侧面的剪接位点。如果DGGE序列中含有相对大量的内含子片段，用DGGE来筛选基因组DNA中的外显子对于有些基因会比较的麻烦，因为内涵子序列中包含大量的多态性片段。用DGGE来筛选此类基因将会导致样本的条带异常，并且测序后大部分会显示多态性。研究者对于这类基因通常直接采取对样本测序以检测点突变。如果想筛选大量的样本的未知突变，DGGE是个不错的选择。因为它不需要放射性标记，所以被认为是一种用户容易掌握的技术。再加上可靠性和低廉的成本都是DGGE的优势。1、实验原理 变性梯度凝胶电泳（DGGE）是一种根据DNA片段的熔解性质而使之分离的凝胶系统。核酸的双螺旋结构在一定条件下可以解链，称之为变性。核酸50%发生变性时的温度称为熔解温度（Tm）。Tm值主要取决于DNA分子中GC含量的多少。DGGE将凝胶设置在双重变性条件下：温度5060 ，变性剂0100%。当一双链DNA片段通过一变性剂浓度呈梯度增加的凝胶时，此片段迁移至某一点变性剂浓度恰好相当于此段DNA的低熔点区的Tm值，此区便开始熔解，而高熔点区仍为双链。这种局部解链的DNA分子迁移率发生改变，达到分离的效果。Tm的改变依赖于DNA序列，即使一个碱基的替代就可引起Tm值的升高和降低。因此，DGGE可以检测DNA分子中的任何一种单碱基的替代、移码突变以及少于10个碱基的缺失突变。 为了提高DGGE的突变检出率，可以人为地加入一个高熔点区GC夹。GC夹（GC clamp）就是在一侧引物的5端加上一个3040bp的GC结构，这样在PCR产物的一侧可产生一个高熔点区，使相应的感兴趣的序列处于低熔点区而便于分析。因此，DGGE的突变检出率可提高到接近于100%。 作为一种突变检测技术，DGGE具有如下的优点：（1）突变检出率高。DGGE的突变检出率为99%以上。（2）检测片段长度可达1kb，尤其适用于100500bp的片段。（3）非同位素性。DGGE不需同位素掺入，可避免同位素污染及对人体造成的伤害。（4）操作简便、快速。DGGE一般在24小时内即可获得结果。（5）重复性好。但是，该方法需要特殊的仪器，而且合成带GC夹的引物也比较昂贵。 2步骤1PCR反应（同前） 其中，上游引物加40bp GC Clamp。 2PCR产物经琼脂糖凝胶电泳确认。 3垂直变性梯度凝胶电泳 变性梯度递增的方向与电泳方向垂直。所使用的胶为4%-10%聚丙烯酰胺凝胶，变性浓度为0100%。其中，含7 M尿素和40%去离子甲酰胺的胶为100%变性，不含尿素和去离子甲酰胺的胶为0%变性。垂直变性梯度凝胶电泳主要是检测引物的最适解链条件（即变性浓度）。 PCR产物加上样缓冲液后上样，300400l/孔 4平行变性梯度凝胶电泳 变性梯度递增的方向与电泳方向平行。根据垂直变性梯度凝胶电泳检测的解链区域的变性浓度，制备相应变性浓度的平行变性梯度凝胶，检测各标本是否存在突变。 PCR产物加上样缓冲液后，25l30l/孔，电压80-120V，温度60，时间3116小时。 5染色5分钟，凝胶成像仪分析结果。简 介这个方法是应用最早也是最常用的突变筛查方法之一，在过去的十年中经历了很大的改进，并被诊断室所广泛使用，最近有篇关于该问题的综述（Fodde和 Losekoot 1994 年）。原 理如果 DNA 双链分子全长不断增加温度或用化学变性剂处理，两条链就会开始分开（解链）。首先解链的区域由解链温度较低的碱基组成。 G.C 碱基对比 A.T 碱基对结合得要牢固，因此 G. C 含量高的区域具有较高的解链温度。同时影响解链温度的因素还有相邻碱基间的吸引力（称作“堆积”）。解链温度低的区域，通常位于端部称作低温解链区（ lower melting domain ）。如果端部分开，那么双螺旋就由未解链部分束在一起，这一区域便称作高温解链（ high melting domain ） ( 图 1) 。如果温度或变性剂浓度继续升高，两条链就会完全分开。变性梯度凝胶电泳法依据首要的一点是： DNA 双链末端一旦解链，其在凝胶中的电泳速度将会极剧下降（图 2 ）。第二个根据是，如果某一区域首先解链，而与其仅有一个碱基之差的另一条链就会有不同的解链温度，因此，将样品加入含有变性剂梯度的凝胶进行电泳就可将二者分开（图 3, 1 和 2 道）。最终，如果一双链在其低温解链区碱基错配（异源双链），而与另一等同的双链相比差别仅在于此，那么，含有错配碱基的双链将在低得多的变性剂浓度下解链。事实上，样品通常含有突变、正常的同源双链以及配对的异源双链，后者是在 PCR 扩增加时产行的。而含有错配的双链（图 3 中的 3 和 4 道）通常可以远远地与两个同源双链（图 3 中 1 和 2 道）分开，这种分离效果使该方法灵敏度很高。为使仅有一个碱基之差的不同分子取得最好的分离效果，必须先选择所要研究的 DNA 范围以及电泳样品时变性剂浓度梯度。这可以按图 2 所示的正交变性梯度实验进行经验性的解决。变性剂梯度应选在曲线斜率大的部分，因为这时多数分子处于部分变性状态这使得落入低温解链区的不同分子达到最佳分离。为防止对患者样品分析之前对目标 DNA 片段的经验性分析占去大量时间，已在本技术的改进人 Leonard Lerman 的实验室设计了一项计算机程序，程度名叫 MELT87 和 SQHTX ，它可以模拟和任何已知序列 DNA 解链温度有关的解链行为。以碱基序列为基础，程序可以给出解链图象。作为实例血红蛋白基因的解链图如图 4 所示。程序还可给出最佳凝胶电泳时间以及任何碱基改变对解链图象产生的预期影响。 MELT87 程序还可以决定是否将多聚 GC 加到 3 或 5 端的引物上。现在多数分析是用所谓的“ GC 夹板”（ clamp ）技术进行的（见下文）。它是将一段长度为 30-50 碱基，富含 GC 的 DNA 附加到双链的一端以形成一个人工高温解链区。 这样，片段的其他部分就处在低温解链区从而可以对其进分析。这一技术使该方法可检测的突变比例大大增加。该方法的发展经过该方法的主要发展阶段见表 1 ，其中许多操作今天已普遍使用。本表仅列出该方法的主要的发展经过，包括使用异源双链“ GC 夹板”技术， PCR 及专门的计算机程序等。 PCR 反应技术的问世使非标记技术简便了许多。表 1 变性梯度凝胶电泳的发展经过1979电泳系统发明Fisher 和 Lerman1979 年1983分离仅有一个碱基之差的 DNA 双链Fisher 和 Lerman1983 年1985于基因组 DNA 中检测出一地中海贫血突变Myers 等 1985 年使用异源双链技术Myers 等 1985 年首次使用“ GC 夹板”技术Myers 等 1985 年1987预测解链行为及分析用计算机程序出现Lerman 和 Silverstein1987 年1989“ GC 夹板”技术与 PCR 技术相连接Sheffield 等 1989 年非标记检测法问世Sheffield 等 1989 年本方法的不同形式(a) 分析模式。变性剂由甲酰胺 / 尿素变为温度梯度。一种方法为温度梯度凝脉电泳（ TGGE ），即在电泳板上保持一温度梯度，除此而外原理相同。另一方法称为“温度横扫型凝胶电泳（ temperature sweep gel electrophoresis ）”。这回，在电泳过程中逐渐统一提高胶板温度。在这两个方法中，化学变性剂的浓度在凝胶上保持衡定（这和通常不断增高的梯度不同）。而且由于可以避免“缓冲液储积”现象，所以显然这样做是有优点的。（而“经典”的分析方法是在“缓冲液储积”情况下进行的）。其他形式都是以电泳时条件不变为基础。在溶液解链一法中，双链在含有阶梯式升高的变性剂溶液中解链，然后用标准的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳方法对解链情况进行分析。在恒变性剂凝胶电泳（ CDGE ）（凝胶中的变性剂浓度一致）法中，对待分析片段的分离是在和该片段低温解链区相应的变性剂浓度之下进行的。但这意味着每种待分析片段需要不同的电泳条件，而且该方法可能会在 DNA 片段中检出未知突变。但除了此方法的发明者及其合作者的实验外，其他实验室很少使用这一方法。直到最近才由于毛细管电泳（ Khrapko 等 1994 年）的引入而使其转向分析应用，并称作恒变性剂毛细管电泳（ CDCE ）。它是在使双链刚开始解链时的恒定化学变性剂和温度条件下进行分析工作的。毛细管中填充以线性梯度丙烯酰胺（ linear acrylamide ），由激光探测系统检测标荧光物质的 DNA 分子。该检测系统快速灵敏可以在 30,000 个碱基序列中检出一个突变，但如果要对另一不同片段进行分析，前面的条件就必须改变。 每次分析的序列数量在增加。为了用最小量的电泳分析对更长 DNA 片段作突变和多态性筛查，在过去的一段时间里人们已经作了大量努力，其中一则很好的例子是可以将其用于未扩增的人类基因组 DNA （ Gray 1992 年）。一个实验用 4 种碱基切割酶之一对 DNA 进行消化，然后用变性梯度凝胶电泳技术电泳、迎迹转移。用放射性物质标记的 DNA 探针对 DNA 进行检测。因为使用了“ GC 夹板”技术或异源双链技术，所以该方法可用多种探针对薄膜进行多次检测。虽然此实验只检测出了 60% 的突变，但可用另外其他酶对此作部分补偿。用第一种酶检测不出位于高温解链区的突变，但或许用另一种酶作用时可使其落入低温解链区从而得以检测。更深入的一次筛查更多 DNA 的方法有如对 CFTR 基因（ Costes 等 1993 年）的特定外显子进行多种途经分析，将多个样品加到一个电泳道上电泳。另一方法对此作了更大的改进，将苯丙氨酸羟化酶基因的外显子放在同一凝胶条件的不同电泳道上电泳，而不是将 13 个外显子放到不同凝胶条件下泳（ Guldberg 和 Guttler1994 年）。这一方法称作宽幅度变性梯度凝胶电泳（ broadrange DGGE ）。因此用该方法筛查患者突变将会节约一大笔花费（图 5 ）。将基因组或基因片段分离后进行变性梯凝胶电泳再在另一方向上进行普通电泳同样可以在一次分析中检查更多的 DNA （ Uitterlinden 和 Vijg 1994 年）。(c)其他改进。在 PCR 反应过程中加入“ GC 夹板”（ Top1992 年）而不是应用含有“ GC 夹板”的特定引物，这一方法也有可能减少耗费。由一端进行 PCR 反应的引物有：带有 15bp 碱基接头的引物和由 15bp 接头和 35bp “ GC 夹板”构成的接头 / 夹式引物。当然这就要求一个用特定引物扩增，另一个用带有“夹板”的引物扩增，而且要用校读多聚酶（ Proof reading polymerase ）以防止引入人为突变。去除“ GC 夹板”或用化学“夹板”代替可能都会使操作简便（ Costes 等 1993 年 a ； Fernandez 等 1993 年）。此外，“ GC 夹板”由连接补骨脂的多个碱基 A 替代，经过扩增，它就会与新加上去的配对碱基 T 结合在一起，经光照射后与末端共价连接在一起。现已对此方法进行了深入的研究（ Costes 等 1993 年 b ）。 DNA 片段中特定突变通常会产生特定的异源双链和同源双链图，所以检测人员要能够区分所检测到的突变是否为以前所描述的突变。但是，两个或更多突变产生的双链图可能比较相像，所以要确定检测出的突变是否为新发现的突变，就可以通过再次分析前加入已知突变样品（ Guldberg 和 Guttler1993 年）而予以解决。如果已知突变与所检测到的突变相同，那么就会产生复合双链图，这种方法可以不用进行序列分析而对突变做出鉴定。Russ 和 Medjugorac(199 年 ) 报道用恒温平板代替了培养槽。最后，从安全角度出发，Guldberg等人（1994年）介绍了一种方法，将甲酰胺从恒变性剂凝胶电泳中去掉，他们还推测可以将变性剂从变性梯度凝胶电泳中去掉。从此方法发展早期开始，RNA：RNA和DNA：RNA双链就被不时地用来进行分析研究。突变检出率运用计算机程序从本方法原理第一条出发可以估计出检出率，或者用此方法去检测大量突变也可以估计出检出率。这两种方法得到的答案可能不一致，因为，比如说DNA分子周围序列对检测结果有影响。估计突变检出率的研究方法有两种类型：（a）用盲法检测100个左右的突变，至少包括所有突变类型中的两类，（b）对一群基因确有突变的患者进行检测，(c)未检突变的记录。所以至少能从三个层次来讨论变性梯度凝胶电泳的突变检出率问题。不过，随着检测方法的发展整个检出率提高了（表3）。表3 变性梯度凝胶电泳的突变检出率，自Cotton(1994年a) 改写方 法样 品检 出 率无“GC夹板”多种50-70%同源双链加“GC夹板”130个碱基对中的450个突变95%异源双链加“GC夹板”血红蛋白基因“实际上全部”应用“ GC 夹板”变性梯度凝胶电泳技术研究雌激素受体基因时，有一研究小组报道外显子 1 含有 70%GC 碱基，因为 CpG 区是突变热点，所以必须用单链构象多态技术进行大量的筛查（ Roodi 等 1995 年）。对特定基因突变的患者进行检查，应用异源双链技术和“ GC 夹板”技术，按照所推荐的方法进行检测，现在已经清楚如果有突变存在，那么几乎毫无遗漏地被检出来。例如，在一项对 44 例血友病 B 患者所作的研究中， 40 例患检出潜在缺陷，用序列测定法或变性梯凝胶电泳法在其余 4 例中没有检出突变。应用此方法分析 308 例丹麦苯丙酮尿症患者染色体，检出了 99% 的等位基因突变（其中 32 例为单碱基突变， 3 为例缺失突变）（ Guldberg 等 1993 年）。在轻型或缓和型血友病 A 的例子里，检测出 26 例已知点突变，用 45 对引物对 99% 的编码序列进行扩增，检测出了所有突变（ Higuchi 等 1991 年）。在 29 例患者中检出了 25 例突变（检出率为 86% ），不过其他突变可能位于未被检测的区域（例如内含子）。对用带有 GC 夹板的异源双链变性梯度凝胶电泳分析所遇到的假阴性问题（即漏掉突变）比较难以找到准确的原因，但如果用来检测已知突变，那就变得显而易见了。在 7 例次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶（ HGPRTase ）突变实验中， CDGE （恒变性剂凝胶电泳）法漏掉了一例突变，令人惊讶的是，“ GC 夹板” DGGE 法漏掉了 4 例突变（ Hovig 等 1991 年）。“宽幅度”（ broad range ） DGGE 也被用上去了，所以不清楚是否选用不同引物就可以使这 4 例突变分开，或是因为 DNA 前后序列影响对突变的检测。在因子基因 GC 堆积的 371bp 片段中报道了同一密码子上另外的 4 个假阴性突变（ Traystman 等 1990 年），但当该片段降解为 236bp 长的片段后就易于检测了。看来尚无假阳性的报道，应该注意到可能会检测出甲基化的碱基（见 Cotton 1992 年 a ）。总之，看来使用 DGGE 结合“ GC 夹板”技术以及使用异源双链技术都可检出近 100% 的突变，但不能说这 100% 检出率是由于假阴性得到了证明。这近乎 100% 的检出率已使此方法成为寻找未知突变的诊断室和许多实验室的首选方法。灵敏度对于遗传性疾病，在给一定位点（该位点突变为杂合状态）野生型占 50% 的情况下，一个方法要能检测出 50% 的突变碱基。然而如果要研究嵌合体或癌症，就必需有更加灵敏的方法，因为这时突变分子所占的比例降低了很多。对于检测癌症中小量的残存性病灶这一点特别正确，要尽可能检测出最小数量的突变分子。在 DGGE 法中，突变的同源双链分子和另两种互补异源双链分子完好无损，分离后可用于定量分析和进一步进行其它分析，如测序（而裂解法破坏突变分子）。在某些特定情况下 DGGE 法可以从 100bp 长的序列中检测出 0.5% 的突变分子（见 Khrapko 等 1994 年）。如果用 CDGE （见前文）法进行分离，分离工作用毛细管电泳完成，通过激光诱生的荧光进行探测，这时可以从 206bp 长的片段中检测出 0.03% 或 1/3000 的突变分子（ Khrapko 等 1994 年）。在检测残留的癌细胞方面，这一方法应该很有用。突变和邻近序列效应（ context effects ）到目前为止，已对不同邻近序列（ contexts ）中 DNA 链间所有可能的单碱基差异进行了研究，但没有对影响检测的因素作大规模系统的研究。有一项研究使用 TGGE （温度梯度凝胶电泳）技术检查最邻近序列对单碱基错误配对稳定性的影响（ Ke 和 Whartell 1993 年）。错误配对的邻近序列可能会影响检测从而象报道所说的那样使突变漏掉了。优点和缺点通常所用 DGGE 法的优缺点见表 4 。尽管有这些缺点，但如决定要用， DGGE 法还不失为一种快速、无放射性的好方法，有 99% 的把握从外显子大小的 DNA 片段中检测出突变分子。表 4 DGGE 法的优缺点优点几乎可以检出所有突变可将突变分子完好无损地同野生型分子分开用于进一步的分析无须标记电泳前只需一步操作可用于未经扩增的基因组 DNA可检测出象甲基化这样的 DNA 修饰缺点需要专门设备需要用计算机对序列进行分析，需要进行预实验需要昂贵的“ GC 夹板”无法确定突变在 DNA 片段中位置需要用含有毒性物质甲酰胺的梯度凝胶DNA 片段大小限制在 100-500bp本方法的发展前景由于 DGGE 法突变检出率高，所以该方法可能已被诊断室用了一段时间了，如果用不同的 DGGE 技术加上“ GC 夹板”方法在一块胶上可以筛查几千 bp 长的片段。按照筛查模式来讲，那将是比较理想的。从诊断角度考虑，理想的方法是在一块胶上筛查一位患者所有的外显子而不是对每一个外显子用不同的胶板。 Guldberg 和 Guttler(1994 年 ) 的“宽幅度”（ broad range ）凝脉电泳将来可能会受人青睐，但都可能使突变检出率有所损失，因此，“化学夹板”法可能会被广泛使用。从两个方向上使用 DGGE 技术对于检查整个基因组（ Uitterlinden 和 Vijg1994 年）和肿瘤诊断（ Verwest 等 1994 年）可能会更加重要。同时，将 DGGE 法用于自动化测序仪也有可能。主要应用Fodde 和 Losekoot （ 1994 年）的综述给出了 DGGE 技术的大量应用。但，一些主要的应用在表 5 中给出。 DGGE 技术不仅可用于癌症和遗传病的筛查及诊断，而且，在癌症（残存性病灶、突变图谱研究等）突变定量实验中还用以检测少数突变等位基因。最近有人用来检测-地中海贫血，见图 6 。已有人将大约 150 多个应用列了出来（ BioRad 实验室 1994 年）。表 5 DGGE 法十种新近的主要应用基 因疾病方 法参阅内容线粒体 DNA筛查Yoon 等 1991 年因子基因血友病 A筛查Higuchi 等 1991 年APCFAP筛查Fodde 等 1992 年CFTR胆囊纤维化筛查Fe