一种从富含腐殖质的土壤中提取DNA的适宜方法.doc

一种从富含腐殖质的土壤中提取DNA的适宜方法摘要：一种快速便利的从土壤中提取DNA的方法出现了。土壤DNA是在EDTA、SDS、苯酚、氯仿、异戊醇的存在下，从溶解的直接环流胞的异丙醇的沉淀物中提取的。提取的DNA用改善的DNA净化设备和DNA凝胶抽提分离设备纯化。用这种方法，从富含腐殖质的灰黑色森林土中提取的DNA从腐殖质里释放，因此，这种DNA可以有效用于的PCR扩增，而且不会被分解。相反，从传统CTAB方法提取的DNA样品产量低纯度低，而且不能从常用商业土壤DNA分离设备中将同一土壤样品中的DNA分离。同时，这种方法节省时间，又很方便，提供了有效的选择权，特别是对富含腐殖质的土壤。关键字：DNA提取，腐殖质，宏基因组学DNA，土壤DNA，土壤微生物介绍：分离出没有修剪过的纯的高分子量的DNA很重要，因为宏基因组学的发展需要依靠它。然而，从富含腐殖质的土壤提纯DNA是很困难的，因为腐殖质可以和DNA一起沉淀，干扰下游过程。微量腐殖质的存在可以显著的影响PCR扩增的进程、阻止分解，并通过和酶结合与Mg2+产生螯合物。在一些情况下，大量稀释提取的天然DNA会直接引导PCR扩增，但不能从根本上解决问题。因此，从土样品中提取DNA进行更深一步的纯化是一个必须的下游过程。为了解决这个问题，已经开发了很多能显著提高土壤DNA纯度的方法。比如，PEG、粉末活性炭、聚乙烯聚吡络烷酮、硅基柱都曾被用于土壤DNA纯化。PEG8000代替异丙醇用于在不减少DNA产量的情况下减少腐殖质。Desai和Madamwar用PAC从沉积物中提取无抑制剂的宏基因组。非线性电泳中改变同步阻力系数的仪器被用来选择性的浓缩高分子量的土壤DNA，并移除异物，包括腐殖酸。尽管很有效率，但这些方法都没有一个有相对较长的草案，也较少使用试剂和设备。更重要的是，一些方法可能侧重于某些特定的土壤类型，其中富含腐殖质的土壤会成为最大的挑战之一。因此，为了开发一个便利有效节约时间的方法，从富含腐殖质的土壤中提纯DNA，仍然是很必要的。如今，大量的商业设备被发明出来用于从富含腐殖质的土壤中提纯DNA，但没有一种设备对所有类型的土壤都有效，特别是富含腐殖质的土壤。在这里，我们介绍一种方便的依据DNA净化设备和DNA凝胶抽提分离设备的方法，特别是对富含腐殖质的土壤中DNA的提取，提供了有价值的选择。材料和方法：从中国辽宁省沈阳农业大学的植物园里收集了一份灰黑色森林土样品。土壤DNA提取过程的三个步骤是这样的：第一步，准备天然的土壤DNA。5g土悬浮在10ml抽提缓冲液中。抽提缓冲液包括125 ml EDTA，5% SDS，100 mM Tris/HCL（PH 8.0），10 ml 苯酚、氯仿、异戊醇（25:24:1，体积），用研钵和研杵研磨2分钟。混合物在10000转的离心机中离心5分钟，然后上清液和0.6体积异丙醇缓慢混合，在冰内冷却20分钟。沉淀物在TE缓冲液中溶解以便提供褐色泥浆让天然DNA和腐殖质还有其他污染物混合，TE缓冲液包括10 mM Tris/HCL和1 mM EDTA（PH 8.0）。第二步和第三步是分别用改善的DNA纯化设备和胶回收设备进行DNA的纯化。已经在第一步获取的泥浆用离心机离心，上清液和缓冲液在DNA纯化设备里以1:3的体积混合。在10000转的离心机中离心5分钟后，所得的混合物在冰内冷却5分钟。根据设备的说明将上清液纯化。然后在DNA纯化设备中洗脱的DNA样品在120V的电压下，在含有0.8%的琼脂糖的琼脂糖凝胶中电泳20分钟，再在DNA凝胶萃取盒中进行进一步的纯化。DNA样品最终在纯化设备中洗脱，并悬浮在TE缓冲液中以便做进一步的分析。在DNA纯化过程中所有的设备，含有缓冲剂的柱负载要在DNA离心洗脱之后在65。C的环境中培养5分钟。相同的土壤样品也同样用SoilGen DNA设备和经典的CTAB为基础的土壤DNA提取方法进行DNA的提取。以设备为基础的方案的所有细节都作为补充信息展示出来。用不同方法提取DNA是慎重的，产量也可以从A260/A230，A260/A280，A260/A465，A260/A665的比值中估计出来。为了更进一步的估计DNA提取方法的效率，提取的土壤DNA用来作为PCR扩增16S rRNA的样本，用16S rRNA的引物（5-AGAGT TTGAT CCTGG CTCAG-3)和增长链（5-AAGGA GGTGA TCCAG CCGCA-3)。PCR在20ul里用2 U的DNA聚合酶、缓冲剂、0.5 ngDNA样品/ul、0.2 mM dNTP、0.5 uM 引物进行操作。反映在94。C中进行2分钟。在95。C的条件下30秒内进行25个周期，55。C的条件下反应40秒，72。C的条件下反应4分钟，最后在72。C的条件下保温10分钟。将提取的DNA纯化的过程进一步决定于BamHI的抑制分解。一微克的土壤DNA在20ul的溶液中反应产生的混合物被5 U的BamHI分解，并在37。C的条件下保温10分钟。PCR产物和被分解的DNA在0.8%的琼脂糖中可以看到。结论：在这个研究中，分离土壤DNA的方法由三步组成：微生物细胞的破坏，再用现有的SDS和将天然DNA的提取（第一步），用改善的DNA纯化设备（第二步）和DNA凝胶萃取设备纯化（第三步）。用脱氧核糖核酸酶将DNA降解是很重要的因素，因为可能会导致DNA从土壤中提取失败。用上述方法和商业设备，EDTA和SDS 很普遍的作为抑制剂抑制脱氧核糖核酸酶的活性。在后面的步骤中，离心得到的上清液通过苯酚、氯仿、异戊醇混合物将脱氧核糖核酸酶移除从而提取出来。虽然EDTA和SDS 很强烈的抑制脱氧核糖核酸酶的活性，剩余的脱氧核糖核酸酶的活性仍然足够降解DNA，经常在从土壤中提取DNA时导致失败，这可能是因为很多设备和方法再现性差。在我们的方法中，DNA在微生物细胞研磨时释放出来，苯酚、氯仿、异戊醇能直接和土壤混合并让脱氧核糖核酸酶直接失活。因此，能有效组织DNA的降解而且这个方法能得到令人满意的产量并具有可重复性。在土壤中的微生物细胞破裂后，提取的DNA用改善的DNA纯化设备和DNA凝胶萃取设备纯化。根据DNA纯化设备生产商介绍，DNA样品被纯化要和缓冲液混合，离心后直接装载到洗脱设备的柱上。然而，当天然土壤DNA和缓冲液混合时，离心时会出现沉淀物阻塞冲洗柱。因此，离心要在装载混合物之前进行，这是移除沉淀物很关键的一步。在除去沉淀物后，上清液从黑褐色变成了亮褐色，表明这一步移除了污染物。DNA纯化设备和DNA凝胶萃取设备不是一开始就设计出来基因组DNA的纯化。这可能是第一篇用这两个设备从土壤微生物系统中分离基因DNA的报道。令人满意的产量（大约30 ug DNA/g 土壤）表明这两个设备对这个实验很合适。另外，用这种方法获取的元基因组DNA的碎片的尺寸大于10 kb而且没有明显的DNA降解，并低分子量的污染物也能够看到。一种商业土壤DNA分离设备（土壤基因组提取试剂盒）和一种传统的CTAB土壤DNA提取方法也曾经被用来从相同土壤中提取DNA来比较不同方法的效率。结果，不知道为什么，没有DNA可以用土壤基因组提取试剂盒提取出来，可能这种土壤类型不在这个设备的适用范围之内，因为不同商业土壤DNA提取设备对某种特定类型的土壤（如：粘土、粉土、沙土、砾土）有一定的偏差。在这个研究中，高水平的腐殖质和其他污染物都可能影响土壤DNA分离设备等人稳定性。尽管DNA可以用传统的CTAB土壤DNA提取方法分离出来，获得的DNA样品是黑褐色的表明样品不纯。在这个研究中，用这两种设备纯化方法提取的DNA A260/A230和A260/A280的值很接近纯DNA的理论值，这现象表明这两种设备纯化方法对移除土壤DNA中的污染物是有效的。而用传统的CTAB土壤DNA提取方法提取的DNA值显著低于纯DNA的理论值，这种方法对有效移除富含腐殖质的土壤中的污染物（如碳水化合物、酚类化合物、多肽类和芳香族）是无效的。另外，用这两种方法提取的DNA A260/A465和A260/A665的值是最高的，比用传统的CTAB土壤DNA提取方法提取的DNA值要高得多。这些结果表明在移除腐殖质方面，这两种设备纯化的方法比用有效得多。吸收系数表明DNA纯化步骤中用改善的DNA纯化设备和DNA凝胶萃取设备是很有必要的。另外，用这两种对抑制分解和PCR扩增也是有成功的，而用传统的CTAB方法在这两方面都不成功。这些结果进一步表明只有用这两种设备纯化方法来提取DNA能得到令人满意的纯度。因此，PCR扩增很成功，而抑制分解还不完善，表明了腐殖质和DNA吸附在DNA纯化设备的硅胶上，有些腐殖酸能从基质中连续洗脱下来。但是单独的硅胶方案不能够完全移除天然DNA中所有的腐殖质。腐殖质成分的电荷和分子还有其他小分子杂质大小和土壤DNA是不一样的因此仍残留的杂质能通过琼脂糖凝胶电泳和DNA凝胶萃取设备移除，这个可以在纯化之后检测土壤DNA纯度来核实。讨论：在这个典型试验中，用这两种设备纯化技术来进行DNA纯化的全过程可以在70分钟内完成，比传统的CTAB土壤DNA提取方法和其他商业土壤DNA分离设备和其他广泛用过的方法要快得多。不同的DNA纯化设备和DNA凝胶萃取试剂盒可以影响两种设备纯化方法的效率。因此，进一步调查这种方法的有效性和适用范围是很有必要的。然而，至少这两种设备纯化的方法能提供一个新颖的有价值的选择，特别是对从富含腐殖质的土壤中提取DNA。总之，这两种设备纯化的方法至少有三个显著特点。第一，在天然DNA准备阶段，苯酚、氯仿、异戊醇的混合物可以直接和研磨的土壤混合，这点可以有效地阻止DNA降解。这个特殊的设计对令人满意的重复度和DNA产量是很重要的，也许对其他方法也有很重要的参考价值。第二，这可能是第一篇用DNA纯化设备和DNA凝胶萃取设备分离土壤微生物界高质量基因染色体DNA的报道。这两种设备被广泛用于大约所有的分子生物学实验室，这使得分离DNA十分便利。最后，用这种方法分离DNA的全