RNA结合蛋白LIN28的研究进展.doc

RNA结合蛋白LIN28的研究进展霍志超09级临床乙班摘要：RNA结合蛋白(RBP)是决定细胞分化、活动力和其他过程的调节子。LIN28是一种高度保守的RBP，在线虫和高等物种中有着复杂的调节机制和表达方式。它对微小RNA表达的调节、骨髂肌及心肌分化、肿瘤形成、多潜能诱导等多种发育的重要事件中起关键作用。本文就LIN28的研究进展予以综述。关键词：RNA结合蛋白；LIN28；胚胎干细胞；诱导性多潜能细胞；微小RNAResearch Progress on RNA Binding-protein LIN28 ZHOU Hongmei(Blood Center ofJmngduPeople S Hospital，angdu 225200，China)Abstract：RNAbinding proteins(RBP)ale important regulators which determine the cell differentiation，motility and other processesLin-28，a highly conserved RNAbinding protein with acomplex mechanism of regulation both in nematodes and in higher species，plays key role in regulating miRNA expression，differentiation of skeletal an d cardiac muscle，tumorigenesis and inducingpluripotentThis paper reviewed the advances in the studies of LIN28Key words：RNA bindingprotein；LIN28；Embryonic stem cells； Induced pIuripotentstem；MicroRNARNA结合蛋白(RNA binding-protein，RBP)在转录后基因表达调节中起着重要的作用，可参与RNA剪接、多聚腺苷化作用、序列编辑、RNA转运、维持RNA的稳定和降解、细胞内定位和翻译控制等。LIN28是一种高度保守的RBP，带有一对独特的RNA联结模体：冷休克结构域(cold shock domain，CSD)和一对反向的CCHC锌指模体(zinc finger notifs，ZFM)，在哺乳动物中，以多种类型富集于未分化的细胞中，LIN28影响分化中特殊RNA的翻译和稳定性 。1 LIN28在线虫中的表达LIN28起初发现于秀丽隐杆线虫中 ，通常在线虫的胚胎发育过程中，基因时空性表达是由一些关键因子控制的 引。调节时间性发育的基因称为异时性基因 ，异时性基因LIN28在线虫中控制时间、空间发育的多样性，LIN28和LIN4、LIN14组成调控网络，此调控网络对线虫幼虫发育初期起重要的控制作用 。在秀丽隐杆线虫中，异时性基因控制着整个发育过程的时间性，包括细胞的分裂、分化和部分组织中细胞的凋亡 。由于异时性基因的突变会导致基因发展过程中时间性改变，因此决定了细胞向特定方向分化提早或是推迟发生 。在正常发育过程中，LIN28在IJl期幼虫内大量表达，是决定I2期特定细胞的命运所必需的。在LIN28缺失的突变体中，L2期大量细胞的特异性分化消失，IJ3期的细胞和后期细胞的发育出现成熟。hu等 提出LIN28的阶段特异性是由2个遗传通路所调节的。抑制LIN28和LIN14，直至u 的中、晚期LIN4才表达，而此时LIN28和LIN14的转录水平开始下降。LIN28为编码细胞质蛋白质的基因，抑制特异的发育过程，在Ll期被活化，在随后的时间受抑制。LIN14和LIN28之间存在着相互抑制的关系。总之，在线虫中，LIN28在调控虫体发育的空间和时序表达上起重要作用，在控制其发育的时序性上是必不可少的。在早期的胚胎形成时，LIN28有表达，但在成熟期，则明显下调 。在线虫中，若RNA联结CSD区域内的高度保守氨基酸有4个明显的错义突变，LIN28的功能丧失，会引起线虫发育的缺陷。在线虫中LIN28的阻抑发生于转录后，且受LIN4、LIN14的调控 引。2 LIN28对miRNA Let-的调节及意义微小RNA(microRNA，miRNA)是生物体内源长度为2023个核苷酸的非编码小RNA，miRNA对细胞生长和发育过程的调节起多种作用，其失调常和人类疾病相关。尽管miRNA的生成和成熟路径已确立，但是其调节和失活的路径仍未知。miRNA通过与靶mRNA的互补配对而在转录后水平上对基因的表达进行负调控，导致mRNA的降解或翻译抑制。到目前为止，已报道有几千种miRNA存在于动物、植物、真菌等多细胞真核生物中，进化上高度保守。Let-7 miRNA最初发现于秀丽隐杆线虫，调节增殖和分化，其序列和功能高度保守。在胚胎细胞中，Lin28阻断let-家族miRNA的加工处理。在体外，LIN28选择性结合let7前体的末端环区域，此区域在体内介导抑制miRNA的加工。Piskounova等鉴定了用于此抑制的LIN28必需区域，此发现确立了前体的末端环在miRNA成熟过程中的调节作用，提供了LIN28负性调节let-7加工的机制。最近的研究结果显示，let-7表达的下降可使肿瘤的发生增加和患者预后变差 。在正常细胞的发育中，LIN28医学综述2009年lO月第l5卷第20期Medical Recapitulate，Oct 2009，Vo115，No20阻止let-7的积聚，基于此发现，Btissing等 提出在正常细胞和癌细胞中，let-7通过自我更新和促进分化调节“干性”细胞，对LIN28、let-7及其功能更全面的了解将对肿瘤的治疗提供帮助。miRNA是由大的前体miRNA(premiRNA)经RNA聚合酶2转录裂解而成：第1步，premiRNA(70 80个核苷酸)在Drosha RNase(关键的miRNA加工酶，在一个特殊的步骤中切断前体miRNA)的作用下从大的premiRNA上切开；第2步，在细胞质内，在Dicer酶(双链RNA专一性RNA内切酶)的作用下premiRNA进一步加工合成为成熟的miRNA。LIN28蛋白连接到let一7 premiRNA上，增强了尿嘧啶核苷酸对3 一末端的吸引力，形成uplet-7(uridylatedprelet-7)，不能被Dicer加工处理而遭受降解，不能合成具有功能的let-7 miRNA。在后生物中，let一7miRNA大多数是高度保守转录物，先期的工作表明，线虫类let一7的靶目标是LIN28，据此推测】et-7miRNA、LIN28在双负反馈环机制下建立了双稳开关。Heo等 报道，RNA联结蛋白Lin28a和Lin28b作为let一7 miRNA生物合成的转录后抑制子。并观察到LIN28主要在细胞质对let一7的前体(pre1et-7)3 末端的尿嘧啶核苷酸产生诱导作用，同时提出了L1N28调节miRNA生物合成的转录后机制，在未分化细胞和特定的肿瘤细胞中高度表达，从而进一步提出了LIN28介导的let7下调，可能在细胞发育、干细胞编程和肿瘤形成中发挥重要作用。3 L1N28在骨髂肌、心肌中的表达及意义脊椎动物中也存在着异时性基因LIN28的同源分子，包括果蝇、爪蛙，在人和小鼠中同样克隆了LIN28的同源基因。LIN28基因在小鼠胚胎发育中起一定的作用。在哺乳动物的胚胎干细胞中和胚胎形成早期，LIN28分布广泛，但在胚胎形成后期和成人中，LIN28在许多组织中的表达受到抑制 。在大多数哺乳动物细胞培养模型中LIN28的下调与细胞的分化相关，LIN28已作为“干性”的标志 。实际上，在鼠胚胎形成过程中，且直到85105 d，所有组织和胚胎层LIN28呈高表达，然而，在此阶段，它开始显示一些组织特异性，在上皮组织、生长中的心肌以及大约在胚胎155 d的体内生肌节中可检测到LIN28，此后，LIN28在心肌和骨骼肌中的存在是连续的，持续至胚胎形成后期甚至存在于成体内。在完全成熟组织中也检测到LIN28，胚胎后期和成熟生命中其表达局限于数个组织中，例如成人的心肌、骨骼肌中，这表明LIN28蛋白在这些组织和器官中具有特殊的功能。在肌肉组织中，LIN28似乎与分化的状态相关。成人的初级肌细胞中，LIN28在分化中被很强地诱导，体内再生的骨骼肌中，新生的纤维在分化和成熟过程中，LIN28是上调的。新鲜分离的处于增殖和分化过程中的胚胎和胎儿初级肌原细胞，LIN28强表达，在成人初级肌原细胞增殖过程中，LIN28几乎检测不到，但在分化末期明显上调。总的看来，LIN28蛋白在肌肉分化末期有一个功能，即LIN28在肌细胞中的表达增加了分化的效率。肌肉转录因子成肌分化抗原低水平稳定表达的鼠胚胎干细胞被定为肌原性谱系，在分化过程中它们表达LIN28。然而，处于控制中的胚胎干细胞，当有异种胚胎形成时，LIN28下调。这些结果提示，LIN28在肌肉中有着重要的组织特异性功能。Polesskaya等 发现，LIN28连接到多核糖体层的翻译起始复合物上可增强蛋白合成的效率，LIN28在肌细胞中的表达增加了分化的效率，这提示LIN28在胚胎、成熟细胞和组织中起“翻译增强子”的作用。LIN28的一个重要的靶点是人的胰岛素样生长因子2(insulin1ike growth factor 2，IGF-2)。IGF-2是一种重要的肌肉组织生长和分化因子对于体内外有效的肌肉分化是必不可少的 引。LIN28与IGF-2转录后调节密切相关，LIN28复合物包含涉及翻译起始和延长因子以及5 帽和poly(A)联结蛋白。正在分化的肌原细胞中，LIN28和多聚核糖体层结合，这种诱导作用导致IGF一2 mRNA上核糖体数量增加，从而增强蛋白IGF一2翻译的效率。受RNA干扰使得LIN28衰竭时，IGF-2 mRNA未能移位到核糖体部位，导致IGF一2蛋白的合成率下降。LIN28对IGF-2在培养的肌细胞中翻译上调的表达是必要的，且在体外有增强翻译的能力，因此提出了LIN28作为“翻译增强子”发挥功能，当相关的mRNA不再被转录且其水平下降时，增强蛋白合成的效率，LIN28与翻译结构以及诸如IGF一2 mRNAs的联合，引起mRNA起始事件的增加，对mRNAs上移至Lin一28翻译起始复合物并与之结合起间接的稳定作用。在进行分化的肌原细胞中，LIN28本身似乎在翻译水平被调节。LIN28表达和组织特异性的现有知识很难预测它的功能。在一些哺乳动物的分化模型中，例如维甲酸(retinoic acid，RA)诱导分化的p19胚胎癌细胞，依赖miR一125b控制LIN28的表达，在其他的体外分化系统中，例如：TERA一2胚胎癌细胞中与分化相关的LIN28下调不受miR一125b的调： ，且受控于转录水平 。上述结果表明，不同的组织能被完全不同的机制所调节，依赖或不依赖miRNA。分析LIN28在调节骨骼肌形成中的相关的已知医学综述2009年1O月第15卷第20期Medical R功能区域，肌原细胞系的结果分析表明由于保守的氨基酸发生点突变，缺失在CSD区，而不在ZFM区，从而导致了LIN28的亚细胞定位发生错误。这些表明在肌肉分化中LIN28保守的RNA联结CSD区域是必需的LIN28功能。在肌细胞中LIN28联结在包含翻译起始复合物的RNA上。成人骨骼肌纤维的形成通常除了与核染色质的改型和浓集相关外，还与总的转录活力下降、总mRNA水平低下相关联 。在肌原细胞中已经识别了数个被LIN28联结的mRNA，如：肌原转录因子成肌分化抗原、核糖体蛋白质36B4的mRNA等。骨骼肌的再生依赖于激活、增殖和后续的成肌于细胞(卫星细胞，从新的肌纤维融合而来)的分化 ，这些肌纤维的成熟依赖于复杂的调节机制，特别依赖于IGF-2的存在。IGF-2还参与骨骼肌纤维的再生后的肥大和心肌梗死后体内外心肌肥大 2 。在总的转录活力发生下降后，完全再生的骨骼肌纤维中IGF-2蛋白保持强表达，表明在此阶段IGF-2的表达依赖于转录后的机制。总之，LIN28在肌肉中有着重要的组织特异性功能，在骨骼肌分化过程中，LIN28与多聚核糖体层的翻译起始复合物相结合，在进行分化的肌细胞中LIN28联结IGF-2 mRNA，增强IGF-2蛋白的翻译效率，LIN28对IGF-2 mRNA和多核糖体的联结具有重要意义，它调节IGF-2的表达和骨骼肌细胞的分化效率。4 LIN28在肿瘤中的作用LIN28与正常的骨骼肌形成有关，但是与肌细胞的恶变无关，如LIN28与横纹肌肉瘤(rhabdomyosarcoma，RMS)发展无关。RMS是一种起源于肌前体细胞的儿科肿瘤，肌肉细胞过表达IGF-2，且为它们的增殖充当一个重要的自分泌因子 引。然而，RMS细胞中LIN28的表达水平不可检测，且LIN28在这些细胞中的异位表达不引起末期的肌肉分化。RMS中IGF2的上调不是由于LIN28引起的IGF-2合成的异常调节。研究观察进一步表明，由LIN28调节的翻译可能是正常肌肉组织的特征，而肌起源的变异细胞将首先依赖增加转录效能产生必需的细胞因子。尽管如此，LIN28途径的失调可能与人类其他的肿癌有关，Guo等 报道了在人类肝癌中LIN28亚型的过表达，他们通过基因芯片和5 一RACE(cDNA末端快速扩增技术，rapid amplification of cDNA ends，RACE)的方法，从肝癌组织中获得了一个新的LIN28的同源基因(LIN28 homologB，LIN28 B)：该基因全长5542 bp，编码250个氨基酸。显示了LIN28B可作为一个通用的、有价值的肝癌血清标记分子，与肝癌细胞的发病过程有密切的关系。国内的研究结果 亦证实了LIN28B基因与肝癌之间存在着密切的相关性：肝癌的恶性程度越高，则该基因的表达量越高，反之，则越低。LIN28B为肝癌的预后诊断提供了一个新的标记分子，关于其在且癌发病过程中发挥的功能有待后续研究。Raf激酶抑制蛋白(Raf kinase inhibitor protein，RKIP)作为肿瘤转移抑制因子，可以抑制前列腺癌、人乳腺癌和黑色素瘤细胞的转移，并已成为一个新的前列腺癌诊断标志物。DangiGarimella等 报道，RKIP抑制肿癌转移信号通路的调节过程涉及LIN28和let-7，鼠模型中RKIP抑制乳癌细胞转移的侵袭、抑制乳癌细胞进入血管和骨转移，机制涉及促分裂原活化蛋白激酶(mitogenactivated proteinkinase，MAPK)，使得LIN28的转录因Myc而减少，LIN28的抑制能增强乳癌细胞中let-的加工，let-7表达的提高抑制了3-羟基一3一甲基戊二酸(HMGA2，一种染色质重塑因子，可激活侵入前和转移前基因)，LIN28的衰竭和let-的表达抑制了骨转移 。5 LIN28的多潜能诱导性及其应用前景体细胞核移植允许存在于哺乳动物的卵母细胞反式作用因子编程体细胞核到未分化状态。2007年美国汤姆森小组独自使用LIN28、OCT4、SOX2、NANOG成功诱导分化出诱导性多能干细胞 ，显现胚胎干细胞的特性。这些诱导的人类多能干细胞有正常核型，表达端粒末端转移酶活性，表达人类胚胎干细胞特有的表面标志和基因，保持发育的潜能，可分化为具有3个原胚层的高等衍生物。一旦消除技术上的限制，这种人诱导性多能干细胞系除了对移植医学有益外，对新疾病模型的产生和药物的研制应当也是有用的。人类诱导性多能干细胞对心血管研究和治疗的应用有很大的前景，但人类ips分化为功能性心肌细胞仍未得到证实。研究的目的是用OCT4、SOX2、NANOG和LIN28转基因生成的人多能干细胞分化为心肌细胞潜能的特征，与人胚胎干细胞相比，多能干细胞是心肌修复和心血管研究的自体细胞来源可行的选择 引。LIN28在人和鼠的胚胎干细胞中高度表达。已证明在鼠的胚胎干细胞中LIN28特异性抑制导致细胞增殖的下降，当LIN28过表达时，加速细胞增殖。LIN28和包含细胞周期蛋白(cyclins A，cyclinsB)、细胞周期蛋白依赖性的蛋白激酶4的mRNA的核蛋白微粒特异地结合。更重要的是LIN28水平变化导致这些蛋白水平的相关变化，来自cyclin B和细胞周期蛋白依赖性的蛋白激酶4 mRNAs的3 非编码区序列医学综述2009年1O月第15卷第2O期Medical Recapitulate，Oct 2009，Vo115No20以依赖于LIN28的方式对报道基因进行翻译。因此推测LIN28对于多潜能细胞的生长和维持、基因翻译的调节或许起作用 。6 小结综上所述，LIN28是一种高度保守的RBP，是miRNA调节蛋白，人类最初于线虫中发现HN28，称其为“异时l生基因”，负性调节Let-7 miRNA，在进行分化的肌细胞中LIN28联结IGF-2 mRNA，增强IGF一2蛋白的翻译效率，在骨骼肌的分化末期，LIN28能充当一个“翻译增强子”的作用，将特定的mRNA转运至多核糖体上，因而增加了蛋白合成的效率，此翻译调节机制对于肌形成具有重要作用。研究还表明，LIN28可作为一个通用的、有价值的肝癌血清标记分子，与肝癌细胞的发病过程有密切的关系，低分化肝癌中LIN28高表达，RMS细胞中LIN28的表达水平不可检测。最近研究结果显示，HN28作为一种多能性启动子，与其他因子共同作用使人类体细胞重新编程为多能干细胞，显现胚胎干细胞的特性。尽管人类对HN28的研究取得了明显的进展，并揭示了它在多方面的重要性，但是对LIN28的认识还远不够，尚有诸多问题有待深入研究，相信在不久的将来，LIN28在各个层次的调节机制和作用会越来越清晰。参考文献1 Balzer E，Moss EGLocalization of the developmental timing regulator Lin28 to mRNP complexes，Pbodies and stress granulesJRNA Biol，2007，4(1)：16-252 Moss EG，Lee RC，Ambms VThe cold shock domain protein LIN一28 controls developmental timing in Celegans and is regulated bythe lin-4 RNAJCell，1997，88(5)：637-6463 Pasquinelli AE，Reinhart BJ，Slack F，et a1Conservation ofthe sequence and temporal expression of let-7 heterochmnic regulatoryRNAJNature，2000，408(6808)：86-894 Banerjee D，Slack FControl of developmental timing by small ternporal RNAs：a paradigm for RNAmediated regu lation of gene expressionJBioessays，2002，24(2)：1191295 Reinhart BJ，Slack FJ，Basson 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