蛋白质的分离、纯化和表征.ppt

第7章蛋白质的分离 纯化和表征 ProteinSeparation PurificationandCharacterization 因材施法 有的放矢 ProteinPurificationandCharacterization 对蛋白质分子进行的各种研究 要建立在对蛋白质分子本身的性质 特别是区别于其它生物与化学分子的独特的性质 和各种实验手段的原理和适用性深入了解的基础上 ProteinPurificationandCharacterization 分离和纯化蛋白质的各种方法主要是利用蛋白质之间各种特性的差异 包括 分子的大小和形状酸碱性质溶解度吸附性质对配体分子的特异生物学亲和力 ProteinPurificationandCharacterization Theaimofproteinpurificationistoisolateoneparticularproteinfromalltheothersinthestartingmaterial exploits利用 Solubility Size Charge Hydrophobicityor andspecificbindingaffinityoftheproteinofinterest ProteinPurificationandCharacterization 1蛋白质的酸碱性质Ionizationofprotein对某一种蛋白质来说 在某一pH 它所带的正电荷和负电荷恰好相等 也即净电荷为零 这一pH称为蛋白质的等电点 isoelectricpoint pI 沉淀技术 Ionizationofprotein 蛋白质的滴定曲线形状和等电点 在有中性盐存在下可以发生明显的变化 蛋白质等电点在一定程度上决定于介质中离子的组成 没有其他盐类干扰时 蛋白质质子供体基团解离出来的质子数与质子受体基团结合的质子数相等时的pH称为等离子点 isoionicpoint acidexcesspositivechargeCationexchanger isoelectricpointbalancedpositiveandnegativecharge alkalineexcessnegativechargeAnionexchanger 3 10 pH Overallchargeonprotein TheoverallchargeonaproteindependsonpH Ionizationofprotein 7 2蛋白质分子的大小与形状Proteinsizeandshape7 2 1根据化学组成测定最低相对分子质量铁的原子量铁的百分含量 100最低相对分子质量铁的原子量最低相对分子质量 100铁的百分含量 55 8例如 肌红蛋白相对分子质量 1000 335 16700用其他物理化学法法测得的肌红蛋白Mr与此极为接近 可见肌红蛋白分子中只含一个铁原子 Proteinsizeandshape 7 2 2渗透压法测定相对分子质量渗透与渗透压 渗透压法测定相对分子质量溶剂分子由纯溶剂 或稀溶液 向溶液 或浓溶液 单方向净移动现象称为渗透 osmosis 渗透的结果 溶液内的体积增加 液面升高 直至达到一定的静水压力时维持平衡 这时的静水压力就是溶液在平衡浓度时的渗透压 osmoticpressure 渗透压是单位体积内溶质质点数的函数 而与溶质的性质和形状无关 在浓度不大时 渗透压与溶质的相对分子量的关系为 RT c Mr Kc2 Mr RT lim cc 0 渗透压法测定相对分子质量 7 2 3蛋白质的扩散和扩散系数扩散 diffusion dm dt DAdc dxD扩散系数 A扩散面积扩散系数随Mr的增加而降低 但扩散系数对Mr的变化并不敏感 一般不单独用来确定Mr 7 2 4沉降分析法测定相对分子质量蛋白质溶液在电场中受到强大的离心力作用时 如果蛋白质的密度大于溶液的密度 蛋白质分子就会沉降 沉降的速率与蛋白质分子大小和密度有关 而且与分子形状 溶液的密度和粘度有关 沉降速率法沉降平衡法 沉降分析法测定相对分子质量 离心机转速60000 80000rpm离心力40000 700000g 沉降分析法测定相对分子质量 离心力4 2v2rF gF 离心力 单位以地心引力的倍数g表示 即g或 g g 重力加速度 等于980 6cm2 s2 r 通常指自离心管中轴底部内壁到离心转轴中心之间的距离 cm v 为转速 即离心机每秒的转数 若以每分钟转数 rpm 表示 则上式应为4 2v2rF 1 60 2g 7 2 4 1沉降速率法沉降界面n单分子颗粒以恒定速度移动时 净离心力与摩擦力的关系 nFc Fb Ffndx dtmp 1 2 fdx dts 2 单位离心场的沉积速度是个定值 称为沉降系数 sedimentationcoefficient 或沉降常数 蛋白质 核酸 核糖体和病毒的沉降系数介于1 10 13到200 10 13秒的范围 10 13秒作为一个单位 斯维得贝格单位或沉降系数单位 即S 沉降分析法测定相对分子质量 7 2 4 2沉降平衡法利用沉降平衡法测定相对分子质量是在较低速度 8000 20000r min 的离心场中进行的 蛋白质的沉降平衡 图7 3 沉降分析法测定相对分子质量 在时间dt内浓度为c的溶液越过横截面A的溶质量 dm cAdx dtdt因此扩散作用沿相反方向越过横截面A的溶质量 dm DAdc dxdt 沉降分析法测定相对分子质量 当净离心力与扩散力平衡时 在离心池内从液面到液底形成一个由低到高的恒定浓度梯度 因此 2RTdln c2 c1 Mr 1 2 x22 x12 沉降分析法测定相对分子质量 7 2 5凝胶过滤法测定相对分子质量Gelfiltrationchromatography凝胶过滤法的原理 Gelfiltrationchromatography SizeexclusionchromatographyMolecularsieve 筛子 chromatography Moleculesareseparatedonthebasisoftheirsizeandshape Theproteinsampleinasmallvolumesisappliedtothetopofacolumnofporous 有孔的 beadsthataremadeofaninsolublebuthighlyhydrated 亲水的 polymersuchaspolyacrylamide Bio Gel orthecarbohydratesdextran 葡聚糖 Sephadex oragarose 琼脂糖 Sepharose Smallmoleculescanentertheporesinthebeadswhereaslargerormoreelongatedmoleculescannot Thesmallermoleculesthereforehavealargervolumeofliquidaccessible 可接近的 tothem boththeliquidsurroundingtheporousheadsandthatinsidethebeads Incontrast thelargermoleculeshaveonlytheliquidsurroundingthebeadsaccessibletothem andthusmovethroughthecolumnfaster emergingoutofthebottom eluting洗脱 first Thesmallermoleculesmovemoreslowlythroughthecolumnandelutelater 层析柱的洗脱体积与分子量的关系 Ve K1 K2lgM 凝胶过滤法测定相对分子质量 7 2 6SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定相对分子质量SDS 有效变性剂 带负电荷巯基乙醇 打开二硫键蛋白质亚基在电场中的行为只与分子大小有关 Rf K1 K2lgM ElectrophoresisofProtein Inpolyacrylamide 聚丙烯酰胺 gelelectrophoresis PAGE proteinsareappliedtoaporouspolyacrylamidegelandseparatedinanelectricfieldonthebasisoftheirnetnegativechargeandtheirsize Small morenegatively chargedproteinsmigratefurtherthroughthegelthanlarger lessnegatively chargedproteins 7 3蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀Proteincolloidcharacteranddeposition7 3 1蛋白质的胶体性质蛋白质溶液是一个分散系统分散相质点100nm的为悬浊液 介于1 100nm的为胶体溶液 Proteincolloidcharacteranddeposition 胶体系统的稳定条件 1分散相质点的大小2分散相质点带有同种电荷3分散相质点能与溶剂形成溶剂化层 每克蛋白质分子能结合0 3 0 5克水 蛋白质溶液具有 丁达尔效应 布朗运动及不能通过半透膜的性质 Proteincolloidcharacteranddeposition Thehydrophobicandhydrophilicpartsonthesurfaceofprotein Proteincolloidcharacteranddeposition 7 3 2蛋白质的沉淀沉淀蛋白质的方法 1 盐析法盐析一般不引起蛋白质的变性2 有机溶剂沉淀法脱去水化层及降低介电常数 酒精 丙酮 3 重金属盐沉淀法生成不溶性的复合物4 生物碱试剂和某些酸类沉淀法单宁酸 三氯醋酸 磺基水杨酸和硝酸5 加热变性沉淀法 7 4蛋白质分离纯化的一般原则PrinciplesofProteinpurification蛋白质分离纯化的程序包括 1 前处理2 粗分级分离3 细分级分离4 结晶 7 5蛋白质的分离纯化方法MethodsofProteinPurification根据蛋白质在溶液中性质的分离纯化方法 1 分子大小2 溶解度3 电荷4 吸附性质5 对配体分子的生物学亲和力 7 5 1根据分子大小不同的纯化方法7 5 1 1透析和超过滤常用的半透膜是玻璃纸或称赛璐玢纸 透析装置利用压力和离心力的超过滤装置 MethodsofProteinPurification MethodsofProteinPurification 蛋白质的分离纯化方法 密度梯度 区带 离心法蛋白质颗粒的沉降不仅决定于它的大小 而且也决定于它的密度 MethodsofProteinPurification MethodsofProteinPurification 凝胶过滤gelfiltrationchromatography 1903 1906 M Tswett将叶绿素的石油醚溶液通过CaCO3管柱 并继续以石油醚淋洗 由于CaCO3对叶绿素中各种色素的吸附能力不同 色素被逐渐分离 在管柱中出现了不同颜色的谱带 所以称色谱图 MethodsofProteinPurification GelFiltrationChromatography也称 凝胶过滤层析 分子排阻层析 凝胶渗透层析 分子筛层析凝胶的交联度和孔度 网孔大小 决定了凝胶的分离分级范围 GelFiltrationChromatography 常使用的凝胶有 交联葡聚糖 Sephadex 聚丙烯酰胺凝胶 Bio gelP 琼脂糖 SepharoseBio gelA GelFiltrationChromatography凝胶过滤的原理 当不同分子大小的蛋白质流经凝胶层析柱时 比凝胶孔径大的分子不能进入珠内网状结构 而被排阻在凝胶珠之外随着溶剂在凝胶珠之间的空隙向下移动并最先流出柱外比网孔小的分子能不同程度地自由出入凝胶珠的内外这样由于不同大小分子所经过的路径不同而得到分离 凝胶过滤 柱层析的基本装置Column 蛋白质的分离纯化方法 层析柱通常是玻璃的 总的说来 长柱分辨率高 但大量物质的处理则用粗的柱比较适宜 Column 蛋白质的分离纯化方法 凝胶过滤的术语 Vt凝胶柱床的总 床 体积Ve洗脱体积V0孔隙体积 外水体积Vi内水体积Vm凝胶基质体积Vt Vi V0 Vm 蛋白质的分离纯化方法 GelFiltrationChromatography 7 5 2利用溶解度差别的纯化方法7 5 2 1等电点沉淀和pH控制 蛋白质的分离纯化方法 利用溶解度差别的纯化方法 7 5 2 2蛋白质的盐溶和盐析盐溶 少量盐促进蛋白质溶解的现象盐析 大量盐使得蛋白质沉淀的现象 盐析作用 大量中性盐的加入使水的活度降低 原来溶液中的大部分甚至全部的自由水转变为盐离子的水化水 那些被迫与蛋白质表面的疏水基团接触并掩盖它们的水分子成为下一步最自由地可利用的水分子 因此被移去以溶剂化盐离子 留下暴露出来的疏水基团 随着盐浓度的增加 蛋白质疏水表面进一步暴露 由于疏水作用蛋白质聚集而沉淀 最先聚集的蛋白质是表面上疏水残基最多的蛋白质 蛋白质的分离纯化方法 利用溶解度差别的纯化方法 7 5 2 3有机溶剂分级分离法与水互溶的有机溶剂 如甲醇 乙醇和丙酮等 能使蛋白质在水中的溶解度显著降低 室温下 有机溶剂不仅能引起蛋白质沉淀 而且伴随着变性 控制有机溶剂浓度也可以分离纯化蛋白质 有机溶剂引起蛋白质沉淀的主要原因之一是改变了介质的介电常数 介电常数的降低将增加两个相反电荷之间的引力 蛋白质的分离纯化方法 利用溶解度差别的纯化方法 7 5 2 4温度对蛋白质溶解度的影响在一定温度范围内 约0 40 之间 大部分球状蛋白的溶解度随温度升高而增加 人的血红蛋白从0 25 溶解度随温度上升而上升 蛋白质的分离纯化方法 利用溶解度差别的纯化方法 脲或盐酸胍的变性作用 7 5 3根据电荷不同的纯化方法7 5 3 1电泳Electrophoresis在外电场作用下 带电颗粒 如不处于等电点的蛋白质分子 将向着与其电性相反的电极移动 这种现象称为电泳 蛋白质的分离纯化方法 Electrophoresis 区带电泳 zoneelectrophoresis 可分四类 a滤纸电泳和薄膜电泳 b粉末电泳 c细丝电泳 d凝胶电泳 适于分离蛋白质和多核苷酸 核酸 电泳装置主要包括两个部分 电源 电泳仪 和电泳槽 电源提供直流电 在电泳槽中产生电场 驱动带电分子的迁移 Electrophoresis 蛋白质的分离纯化方法 蛋白质的分离纯化方法 Electrophoresis 7 5 3 2聚丙烯酰胺凝胶电泳PolyacrylamideGelElectrophoresis PAGE 有时用不连续的胶 浓缩胶与分离胶 不连续的聚丙烯酰胺凝胶电泳有3种物理作用 1 样品的浓缩效应2 分子筛效应3 电荷效应 蛋白质的分离纯化方法 PolyacrylamideGelElectrophoresis PAGE Thegreaterthenetchargethefasterthemoleculewillmove InPAGEtheelectrophoreticseparationiscarriedoutinagelwhichservesasamolecularsieve Smallmoleculesmovereadilythroughtheporesinthegel whereaslargermoleculesareretarded Theporesizesinthegelcanbecontrolledbychoosingappropriateconcentrationsofacrylamide 丙烯酰胺 andthecross linkingreagent methylenebisacrylamide 甲叉双丙烯酰胺 Thehighertheconcentrationofacrylamideused thesmallertheporessizeinthefinalgel SDS PAGE原理 蛋白质的分离纯化方法 Acrylamid丙烯酰胺N N methylenebisacrylamideN N 甲叉双丙烯酰胺 聚丙烯酰胺凝胶的孔径可以通过改变丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺的浓度来控制 丙烯酰胺的浓度可以在3 30 之间 低浓度的凝胶具有较大的孔径 如3 4 的聚丙烯酰胺凝胶对蛋白质没有明显的阻碍作用 可用于等电聚焦或作为PAGE电泳的浓缩胶 也可以用于分离DNA 高浓度凝胶具有较小的孔径 对蛋白质有分子筛的作用 可以用于根据蛋白质的分子量进行分离的电泳中 如10 20 的凝胶常用于PAGE电泳的分离胶 SDS PAGE原理 蛋白质的分离纯化方法 SDS PAGE Insodiumdodecylsulfate SDS PAGE theproteinsaredenaturedandcoatedwithanoverallnegativecharge duetoboundSDS andthusthebasisfortheirseparationisonlytheirmass SDS PAGE Theproteinmixtureisfirsttreatedwithareducingagentsuchas2 mercaptoethanol 巯基乙醇 ordithiothreitol 二硫叔糖醇 tobreakallthedisulfidebonds ThestronganionicdetergentSDSisthenaddedwhichdisruptsnearlyallthenoncovalentinteractionsintheprotein unfoldingthepolypeptidechain SDS PAGE ApproximatelyonemoleculeofSDSbindsviaitshydrophobicalkyl 烷基 chaintothepolypeptidebackboneforeverytwoaminoacidresidues whichgivesthedenaturedproteinalargenetnegativechargethatisproportional 成比例的 toitsmass 蛋白质的分离纯化方法 7 5 3 3毛细管电泳CapillaryElectrophoresis电泳是在微内径管 一般为50um内径和300um外径 内进行的 一般管长50 100cm 电压10 50kV 时间10 30min 蛋白质的分离纯化方法 CapillaryElectrophoresis 虽然被分析样品因电泳迁移而分离 然而电渗作用 electroendosmosis 使他们向负极移动 由于电渗流很强 其速度一般比样品的电泳速度大 因此所有的正 负离子和中性分子都被推向负极 蛋白质的分离纯化方法 蛋白质的分离纯化方法 CapillaryElectrophoresis 7 5 3 4等电聚焦 isoelectricfocusing IEF 等电聚焦或称电聚焦 electricfocusing EF 两性电解质 pH梯度 蛋白质的分离纯化方法 Theprincipleofisoelectricfocusing 在IEF的电泳中 具有pH梯度的介质其分布是从阳极到阴极 pH值逐渐增大 蛋白质分子具有两性解离及等电点的特征 这样在碱性区域蛋白质分子带负电荷 向阳极移动 直至某一pH位点时失去电荷而停止移动 此处介质的pH恰好等于聚焦蛋白质分子的等电点 同理 位于酸性区域的蛋白质分子带正电荷向阴极移动 直到它们的等电点上聚焦为止 在电场内经过一定时间后 等电点不同的蛋白质混合物的各组分将分别聚焦在各自等电点相应的pH位置上 形成分离的蛋白质区带 蛋白质的分离纯化方法 Theprincipleofisoelectricfocusing 蛋白质的分离纯化方法 Theapparatusofisoelectricfocusing 蛋白质的分离纯化方法 Applicationofisoelectricfocusing 1 分离等电点不同的蛋白质 2 测定某个未知蛋白质的等电点 3 研究蛋白质微观不均一性 4 蛋白质纯化制备 5 用于IEF SDS PAGE双向电泳 蛋白质的分离纯化方法 Theprincipleofisoelectricfocusing Isoelectricfocusingelectrophoreticallyseparatesproteinsonthebasisoftheirrelativecontentofpositivelyandnegativelychargedgroups WhenaproteinisatitspI itsnetchargeiszeroandhenceitwillnotmoveinanelectricfield Theprincipleofisoelectricfocusing Inisoelectricfocusing apolyacrylamidegelisusedwhichhaslargeporesandcontainsamixtureofpolyampholytes smallmultichargedpolymerthathavemanypIvalues Ifanelectricfieldisappliedtothegel thepolyampholytesmigrateandproduceapHgradient EachproteinwillmigratethroughthegeluntilitreachesapositionatwhichthepHisitspI 双向电泳 2 DE 与蛋白质组学Two dimensionalgelelectrophoresisandproteomics 蛋白质组学不是一个封闭的 概念化的 稳定的知识体系 而是一个领域 它旨在阐明生物体全部蛋白质的表达模式及功能模式 其内容包括蛋白质的定性鉴定 定量检测 细胞内定位 相互作用研究等 是连接基因组 序列与基因功能之间的桥梁 蛋白质的分离纯化方法 双向电泳 2 DE 低氧蛋白质组的2 D电泳图 蛋白质的分离纯化方法 7 5 3 6离子交换层析 IonExchangeChromatography IEC 蛋白质的分离纯化方法 IonExchangeChromatography Inionexchangechromatography proteinsareseparatedonthebasisoftheiroverall net charge IfaproteinhasanetnegativechargeatpH7 itwillbindtoacolumncontainingpositively chargedbeads whereasaproteinwithnochargeorabetpositivechargewillnotbind Thenegatively chargedproteinsboundtosuchacolumncanthenbeelutedbywashingthecolumnwithanincreasinggradient increasingconcentration ofasolutionofsodiumchloride Na Cl ions attheappropriatepH IonExchangeChromatography TheCl ioncompetewiththeproteinforthepositively chargedgroupsonthecolumnProteinshavingalowdensityofnegativechargeelutefirst followedbythosewithahigherdensityofnegativecharge IonExchangeChromatography 离子交换层析是以离子交换剂为固定相 依据流动相中的不同带电组分与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时的能力的差别 与离子交换剂结合力的差别 而进行分离的一种层析方法 离子交换层析是生物化学领域中常用的一种层析方法 广泛的应用于各种生化物质如氨基酸 蛋白 糖类 核苷酸等的分离纯化 蛋白质的分离纯化方法 IonExchangeChromatography 纤维素离子交换剂交联葡聚糖离子交换剂盐浓度的微小变化就会直接影响它对蛋白质电荷吸附容量 因此 蛋白质混合物的分离可以由改变溶液中的盐离子强度和pH来完成 梯度混合器 蛋白质的分离纯化方法 IonExchangeChromatography 离子交换层析的原理 离子交换层析是依据各种离子或离子化合物与离子交换剂的结合力不同而进行分离纯化的 离子交换层析的固定相是离子交换剂 它是由一类不溶于水的惰性高分子聚合物基质通过一定的化学反应共价结合上某种电荷基团形成的 高分子聚合物基质 电荷基团 平衡离子 蛋白质的分离纯化方法 离子交换层析的原理 蛋白质的分离纯化方法 离子交换层析系统的组成 蛋白质的分离纯化方法 离子交换层析的操作流程 1 离子交换剂的选择和预处理2 装柱3 平衡4 加样和淋洗5 洗脱6 收集 鉴定及保存7 基质的再生 蛋白质的分离纯化方法 7 5 4利用选择性吸附的纯化方法吸附层析是利用待纯化的分子和杂质分子与吸附剂之间的吸附能力和解吸性质不同而达到分离目的 材料 硅胶 硅烷醇Si OH 氧化铝活性炭 蛋白质的分离纯化方法 7 5 4 1羟基磷灰石层析结晶磷酸钙分离蛋白质 核酸 蛋白质的分离纯化方法 7 5 4 2疏水作用层析蛋白质存在于分子表面的疏水氨基酸残基的数量是不同的 连接在支持介质 如琼脂糖 上的疏水基团与蛋白质表面上暴露的疏水基团结合 使用逐渐降低离子强度或增加pH的洗脱液 蛋白质的分离纯化方法 7 5 5利用对配体的特异生物学亲和力的纯化方法 亲和层析 AffinityChromatography 蛋白质的分离纯化方法 亲和层析的原理 蛋白质的分离纯化方法 AffinityChromatography Affinitychromatographyexploitsthespecific highaffinity noncovalentbindingofaproteintoanothermolecule theligand First theligandiscovalentlyattachedtoaninert 惰性的 andporousmatrix 基质 Theproteinmixtureisthen