蛋白质相互作用技术.ppt

常用蛋白质相互作用技术介绍 SPR技术分析蛋白质相互作用 体外转录和翻译鉴定蛋白质相互作用 偶联的转录和翻译过程 T7 RNApolymerase E colilysate gene DNA coupledtranscription translation protein gene 持续交换和非细胞体系的原理 T7RNApolymeraseTranslationmachineryE coliEnergyregeneratingsystem Protein DNAtemplate AminoacidsEnergysubstratesBuffercomponentsNTPs Supply AminoacidsEnergysubstratesBuffercomponentsNTPs Supply Inhibitoryby products Inhibitoryby products membrane membrane 供给腔反应腔供给腔 RTS500反应装置 reactionchamber feedingchamber withsemipermeablemembranes RTS500ProteoMasterE coliHYKit 质谱 X射线结晶学 核磁共振 结构生物学的蛋白标记 theaminoacidsandmethioninearebothprovidedseparatelyfromallotherkitreagents otherdesiredaminoacidscanbeexchangedbyusingtheRTSAminoAcidSamplerincombinationwiththeRTS500HY RTS500HY Methioninespecificlabelingofproteinsispossiblebysubstitutingthemethionine or 结构分析 GST融合蛋白鉴定蛋白质相互作用 GSTPULL DOWN 通过与GST融合蛋白质探针蛋白质相互作用从可溶性蛋白质库中亲和纯化一个未知蛋白质 再通过GST与谷光苷肽偶联球珠的结合收集相互作用蛋白质 从而分离出蛋白质复合物 1含有表达质粒的细菌培养 2诱导表达 3收集菌体 4加蛋白酶抑制剂 冰上破碎细胞 5离心取上清 按1 1的比例加谷光苷肽琼脂糖球珠 在4C 温和混匀30分钟 6离心收集琼脂糖球珠 用PBS轻轻混匀悬浮 反复三次 7将混合物装柱 让PBS流出 8加还原性的GSH将融合蛋白洗脱 9SDS PAGE检测蛋白质纯化情况 注意 绝大部分工作应在4C进行 对照 GST融合蛋白纯化基本程序 免疫共沉淀鉴定蛋白质相互作用 当细胞在非变性条件下裂解时 完整细胞内许多蛋白质之间的结合保持下来 因而可以据此检测生理条件下相关蛋白质间的相互作用 如果蛋白质X用其抗体免疫沉淀 在细胞内与X稳定结合的蛋白质Y也可能沉淀下来 蛋白质Y的沉淀是基于与X的物理相互作用 被称为免疫共沉淀 注意 绝大部分工作应在4C进行 对照 串联亲和纯化鉴定蛋白质相互作用和蛋白质复合体 Tandemaffinitypurification TAP 将靶蛋白与蛋白质标签融合并在天然宿主细胞中表达 制备提取物 然后采用标准的两步法重获靶蛋白及与其相互作用的蛋白质组份 成像的方