血清蛋白聚丙烯酰胺凝胶电泳.ppt

血清蛋白聚丙烯酰胺凝胶电泳PolyAcrylamideGelElectrophoresis PAGE pp61 掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳分离混合蛋白质的原理 熟悉聚丙烯酰胺凝胶电泳的实验方法和操作技术 目的与要求 制备凝胶安装凝胶管加样 血清样品15 20 L 其中含甘油 溴酚兰 电泳 3mA 管 剥胶染色和脱色 操作步骤 实验原理 聚丙烯酰胺是由丙烯酰胺和交联剂亚甲基双丙烯酰胺在催化剂作用下 聚合交联而成 具有网状立体结构的凝胶 并以此为支持物在垂直的玻璃管中进行电泳 电泳分离的区带类似圆盘状故命名为圆盘电泳 结果 聚丙烯酰胺凝胶电泳可分为连续电泳和不连续电泳两类 连续电泳指整个电泳系统中所用缓冲液 pH值和凝胶网孔的孔径都是相同的 不连续电泳是指在电泳系统中采用了两种或两种以上的缓冲液 pH值和孔径 具有浓缩效应 电荷效应 分子筛效应 不连续圆盘电泳的凝胶管中置有两种不同的凝胶层 浓缩胶 分离胶 不连续电泳能使稀的样品在电泳过程中浓缩成层 从而提高分辨能力 浓缩胶的浓缩效应 电极缓冲液 Tris Gly溶液 pH8 3 浓缩胶缓冲液 Tris Cl溶液 pH6 7 分离胶缓冲液 Tris Cl溶液 pH8 9 溶液中主要的负离子 pI 血清蛋白质 5 0左右 甘氨酸 5 97 以及完全解离的Cl离子形成先导离子 快离子 尾随离子 慢离子 P26 在缓冲系统中的弱酸 如甘氨酸 在pH6 7时很少解离 其有效泳动速率很低 而氯离子却有很高的泳动速率 蛋白质的泳动速率介于两者之间 加上电压以后 作为先导离子的氯离子和尾随离子的甘氨酸离子分离开来 并在其后面留下一个导电性较低的区带 由于导电性和电场强度成反比 这一区带便获得较高的电压梯度 加速甘氨酸离子的泳动 使其赶上氯离子 建立起甘氨酸和氯离子的电压梯度和泳动速率乘积相等的稳定态 使这些带电颗粒以相同的速度泳动 两种离子之间有明显的边界 当甘氨酸 氯离子界面通过样品进入浓缩胶时 在移动界面前有一低电压梯度 界面后有一高电压梯度 由于在移动界面前的蛋白质分子泳动速率比氯离子低 因此氯离子能迅速越过 移动界面后的蛋白质处于较高的电压梯度中 其泳动速率比甘氨酸快 因此 移动的界面将蛋白质分子堆积到一起 形成一条狭窄的区带 由于浓缩胶为大孔凝胶 故对蛋白样品没有分子筛作用 当移动的界面到达浓缩胶和分离胶的界面时 凝胶的pH明显增加 导致甘氨酸大量解离 此时 甘氨酸的有效泳动速率明显增加 超越蛋白分子 直接在氯离子后移动 由于凝胶孔径变小 蛋白质分子的迁移速率降低 落在后面的蛋白质便在均一的电压梯度和pH环境中泳动 并根据其固有的电荷与分子大小进行分离 可见 甘氨酸并非作为缓冲成分参与 而是作为尾随离子来参与电泳过程 制备凝胶安装凝胶管加样 血清样品15 20 L 其中含甘油 溴酚兰 电泳 3mA 管 剥胶染色和脱色 操作步骤 制备凝胶 分离胶 浓缩胶 过硫酸铵后加 1 AP 过硫酸铵 引发剂 1 TEMED 四甲基乙二胺 催化剂 引发剂在凝胶形成中提供自由基 通过自由基的传递 使丙烯酰胺成为自由基 导致聚合反应 催化剂则可加快引发剂产生自由基的速度 注意事项 丙烯酰胺和亚甲基双丙烯酰胺具有神经毒性 避免呼吸道吸